夏其樂, 郝蓓瓊,2, 韓超, 曹艷, 楊祖泉, 劉晨星, 陳秋夏

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 310021;2.浙江農(nóng)林大學(xué) 食品與健康學(xué)院, 浙江 杭州 311300; 3.浙江樹人學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院, 浙江 杭州 310015;4.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 亞熱帶作物研究所, 浙江 溫州 325005)

新鮮的農(nóng)產(chǎn)品和藥材含水量比較高, 難以長(zhǎng)期存放。干燥處理可以有效減少農(nóng)產(chǎn)品和藥材的水分含量、降低水分活度、控制原料質(zhì)量, 避免受潮引發(fā)的蟲蛀和發(fā)霉等劣變[1]。自古以來, 干燥是食藥材的重要加工環(huán)節(jié), 唐代孫思邈著 《千金翼方》中就有記載: “夫藥采取, 不以陰干曝干, 雖有藥名, 終無藥實(shí)。[2]” 但這個(gè)過程同時(shí)會(huì)破壞原材料的功能成分結(jié)構(gòu)和生物活性, 所以針對(duì)不同的原材料探究出合適的干燥方式, 在延長(zhǎng)儲(chǔ)藏期的同時(shí)最大限度地保持其活性成為關(guān)鍵的問題。

紅樹林系統(tǒng)在防風(fēng)固堤、促淤造陸、抵御自然災(zāi)害、凈化海域環(huán)境、為海洋動(dòng)物提供棲息地、維持生物多樣性等方面發(fā)揮著重要作用[3]。秋茄(Kandeliacandel) 為紅樹科 (Rhizophoraceae) 秋茄屬 (kandelia), 是一種生長(zhǎng)于濱海灘涂的海洋植物, 主要分布在福建、浙江和臺(tái)灣等我國南方地區(qū)以及東南亞國家[4]?！冬F(xiàn)代本草綱目》 中記載秋茄的各部位均可用作藥材, 它的藥效功能來源于其中所含有的黃酮、萜類、酚類、多糖等內(nèi)源成分,使得秋茄在抗氧化、抗腫瘤、降血糖和抑菌等方面均表現(xiàn)出顯著的藥理活性[4-6]。

秋茄作為一種富含活性物質(zhì)的天然海洋植物資源, 具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。目? 關(guān)于秋茄加工處理的相關(guān)研究不多, 不同干燥方式對(duì)秋茄功能成分和生物活性的影響未見相關(guān)報(bào)道。現(xiàn)階段對(duì)秋茄干燥工藝的相關(guān)研究具有實(shí)際意義, 為進(jìn)一步提取、分離新的天然活性成分提供了可能。本研究比較了經(jīng)不同干燥方式后的秋茄的功能成分及生物活性變化, 篩選出最適合工業(yè)化生產(chǎn)的秋茄干燥工藝, 為生產(chǎn)加工過程中的秋茄質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要的儀器與試劑

ME204E 電子分析天平 (瑞士Mettler Toledo 儀器 公 司); Five Easy plus pH 計(jì) (瑞 士 Mettler Toledo 儀器公司); UV-1800 紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司); SCIENTZ-10N 冷凍干燥機(jī) (寧波新芝公司); XH-C 旋渦混合器 (金壇市白塔新寶儀器廠); Tecan Spark 多功能酶標(biāo)儀 (瑞士Tecan 公司); SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱 (上海博訊公司)。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 (1 mg·mL-1)、齊墩果酸 (分析級(jí))、沒食子酸 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);2, 2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基 (DPPH, 96%)、二甲基亞砜 (DMSO, 99.7%)、2-2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸-二胺鹽 (ABTS, 98%, 上海麥克林有限公司);α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖 (≥95%,上海士鋒生物科技有限公司); 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(≥97%)、對(duì) 硝 基 苯 基-β-D-吡 喃 半 乳 糖 苷(PNPG, 生物技術(shù)級(jí), 99%, 上海源葉生物科技有限 公 司); 尼 羅 藍(lán) (Dye content ≥75%, 美 國Sigma-Aldrich 公司)。

1.2 方法

1.2.1 秋茄來源、處理以及提取液制備

秋茄樣品采集于浙江省龍港市鰲江口, 采集日期為2021 年5 月31 日。秋茄樣品經(jīng)廈門大學(xué)王文卿教授鑒定為紅樹科秋茄胎苗。將收集到的秋茄樣品充分洗凈、均勻切斷后分成3 組, 每組500 g,然后進(jìn)行以下干燥處理:

陽光自然曬干 (簡(jiǎn)稱 “曬干” ): 將秋茄樣品單層均勻平鋪于不銹鋼托盤上, 放置于通風(fēng)良好、干燥、陽光直射的室外進(jìn)行自然曬干至水分含量約10%。

熱風(fēng)恒溫烘干 (簡(jiǎn)稱 “烘干” ): 將秋茄樣品單層均勻平鋪于不銹鋼托盤上, 在60 ℃的烘箱恒溫烘干至水分含量約10%。

真空冷凍干燥 (簡(jiǎn)稱 “凍干” ): 將秋茄樣品先置于-80 ℃冰箱預(yù)冷凍2 h, 均勻平鋪在凍干托盤上在-50 ℃, 真空度為50 Pa 同樣凍干至水分含量約10%。

參考翁夢(mèng)婷[5]的方法對(duì)干燥后的樣品進(jìn)行提取, 將不同干燥處理后的秋茄打粉過0.35 mm (50目) 篩, 放入離心瓶中按1 ∶10 的質(zhì)量體積比用蒸餾水稀釋, 加水后在旋渦混合器上混合。接著在40 ℃水浴超聲提取30 min, 放入離心機(jī)5 000 r·min-1離心15 min, 過濾取濾液, 并將濾渣重復(fù)提取兩次, 合并濾液后得到秋茄提取液。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

秋茄中總黃酮含量測(cè)定參考包強(qiáng)等[7]的方法。經(jīng)測(cè)定得到標(biāo)曲方程:Y=0.013 2X-0.009 (圖1中a), 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 的 線 性 梯 度 為0、12、24、36、48、60、72 mg·L-1。

圖1 不同化學(xué)物質(zhì)的吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線

將秋茄提取液稀釋5 倍, 取2.5 mL 于25 mL刻度試管中, 分別加1.0 mL 5% NaNO2溶液, 搖勻放置6 min, 加1 mL 10% Al (NO3)3溶液, 搖勻放置6 min, 加2.5 mL 4% NaOH 溶液, 用蒸餾水將其定容至25 mL, 振蕩搖勻后, 室溫靜置15 min, 以空試管調(diào)零, 在512 nm 下測(cè)吸光值D。對(duì)照已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到總黃酮含量。

1.2.3 總多糖含量的測(cè)定

秋茄中總多糖含量測(cè)定參考馬麗等[8]的方法。經(jīng)測(cè)定得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.059 4X-0.001 5(圖1 中b), 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性梯度為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mg·L-1。將秋茄提取液稀釋40倍, 取2.0 mL 于25 mL 具塞試管中, 再加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL 濃硫酸, 搖勻后置于沸水中水浴20 min, 取出后水浴冷卻10 min, 在490 nm處測(cè)定吸光值D。對(duì)照已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到總多糖含量。

1.2.4 總?cè)坪康臏y(cè)定

秋茄中三萜含量測(cè)定參考張家敏等[9]的方法。經(jīng)測(cè)定得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.045 9X-0.020 6(圖1 中c), 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性梯度為0、4、8、13、17、21 mg·L-1。將秋茄提取液稀釋2 倍, 取2.5 mL 于25 mL 比色管中, 氮吹溶劑至吹干, 加入0.5 mL 50 g·L-1的香草醛-冰乙酸和1.0 mL 高氯酸, 混合后60 ℃水浴20 min 冰水冷卻15 min 后加入3.0 mL 冰乙酸, 室溫靜置反應(yīng)10 min, 最后于547 nm 處測(cè)吸光值。對(duì)照已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到總?cè)坪俊?/p>

1.2.5 總酚含量的測(cè)定

秋茄中三萜含量測(cè)定參考李培源等[10]的方法并做適當(dāng)修改。經(jīng)測(cè)定得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.096 5X-0.005 9 (圖1 中d), 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性梯度為0、0.8、2.4、4.0、5.6、7.2 mg·L-1。將秋茄水提物提取液稀釋5 倍, 取2.5 mL 于25 mL 容量瓶中, 加入2.5 mL Folin.Ciocalten 顯色劑, 搖勻, 再加入5 mL 5% Na2CO3溶液, 加水定容, 在25 ℃下避光放置反應(yīng)1 h, 在750 nm 處測(cè)定其吸光值。總酚得率為總酚含量乘以提取液體積乘以稀釋倍數(shù)除以1 000 再乘以100。

1.2.6 ABTS 自由基清除率測(cè)定

參考張培月等[11]的方法測(cè)定ABTS 自由基清除能力。加入秋茄提取液0.1 mL 和4.0 mL ABTS自由基反應(yīng)液, 避光靜置6 min, 在734 nm 處測(cè)定吸光值為A; 另設(shè)無水乙醇作為空白對(duì)照, 在734 nm 處吸光值為A0。清除率計(jì)算公式:

1.2.7 DPPH 自由基清除率測(cè)定

參考Yap 等[12]的方法測(cè)定DPPH 自由基清除能力。按表1 中數(shù)據(jù)加樣, 混勻, 暗處靜置30 min。以60%乙醇溶液調(diào)零, 在517 nm 處測(cè)定吸光值。清除率計(jì)算公式:

表1 DPPH 自由基清除率測(cè)定的各試管配制

1.2.8α-葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定

參照李井雷等[13]的方法檢測(cè)了秋茄提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。選取阿卡波糖為陽性對(duì)照。在405 nm 處測(cè)量吸光值,α-葡萄糖苷酶的抑制率計(jì)算公式:

式中:A對(duì)照1是PNPG 溶液和樣品的混合物的吸光度;A對(duì)照2是PNPG 和酶的混合物的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各處理組的各指標(biāo)檢測(cè)重復(fù)至少3 次, 剔除明顯異常的數(shù)據(jù)。采用IBM SPSS Statistics 26 軟件對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行均值的差異顯著性分析和皮爾遜線性相關(guān)分析 (Pearson correlation coefficient), 同組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。在表示比較各組間均值的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí),P＜0.05 被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性。皮爾遜線性相關(guān)的顯著性結(jié)果以*表示P＜0.05,**表示P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式對(duì)秋茄功能成分含量的影響

不同處理組的總黃酮、總多糖、總?cè)坪鸵约翱偡雍繙y(cè)定的結(jié)果如表2 所示。在3 個(gè)不同的處理組中, 凍干處理秋茄的總黃酮、總酚和總?cè)坪孔罡? 其總多糖含量介于另外兩組之間; 曬干處理秋茄的總多糖含量顯著高于其他兩組 (P＜0.05), 其總?cè)坪颗c凍干處理結(jié)果接近且無顯著性差異 (P＞0.05); 烘干處理的秋茄4 種物質(zhì)含量均顯著 (P＜0.05) 低于另外兩個(gè)處理組。吳勵(lì)萍等[14]

表2 干燥后秋茄總黃酮、總多糖、總?cè)埔约翱偡拥暮?(n=3) 單位: mg·g-1

指出, 凍干處理之所以在保留原料功能性成分方面優(yōu)勢(shì)不明顯, 其原因可能是由于分解活性成分的氧化酶活性在低溫狀態(tài)下受到一定程度的抑制, 但這個(gè)過程是可逆的, 待凍干結(jié)束后一旦回溫, 酶活性得以恢復(fù), 會(huì)繼續(xù)分解原料中的活性成分, 從而造成了含量的損失。吳勵(lì)萍等[14]采用真空冷凍干燥處理后的枸杞子的總多糖含量遠(yuǎn)低于經(jīng)微波干燥、紅外干燥、烘干處理過的總多糖含量,大約有20%的損失。同樣地, 王紅等[15]評(píng)價(jià)了6種不同干燥方法 (陰干、曬干、烘干、真空冷凍干燥、紅外干燥、微波干燥) 對(duì)芡實(shí)品質(zhì)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn), 真空冷凍干燥后, 芡實(shí)中總多糖、總酚和總黃酮類物質(zhì)含量分別下降了1.43、2.29、1.23 mg·g-1。廖素溪[16]通過4 種不同的方式 (熱風(fēng)105 ℃干燥、蒸30 min 后80 ℃干燥、遠(yuǎn)紅外105 ℃干燥和微波干燥) 對(duì)不同產(chǎn)地的鐵皮石斛進(jìn)行干燥, 通過對(duì)比發(fā)現(xiàn), 低溫干燥能更完整保留藥材的功能活性, 這為調(diào)整秋茄的干燥溫度提供了一定的參考。

2.2 不同干燥方式對(duì)秋茄的抗氧化活性以及降血糖能力的影響

不同干燥處理組的秋茄體外抗氧化和降血糖活性如表3 所示。曬干處理的秋茄ABTS 自由基清除率以及DPPH 自由基清除率最高且顯著高于另外兩組(P＜0.05),α-葡萄糖苷酶抑制率顯著低于另外兩組(P＜0.05); 凍干處理的秋茄α-葡萄糖苷酶抑制率最高, 而DPPH 自由基清除率最低; 烘干處理的秋茄ABTS 自由基清除率顯著低于其他兩組 (P＜0.05)。在本研究中, ABTS 與DPPH 自由基清除率結(jié)果以及體外α-葡萄糖苷酶抑制率的結(jié)果不完全一致。陳青等[17]研究了樹莓在干燥后體外的抗氧化活性, 發(fā)現(xiàn)ABTS 和DPPH 自由基清除能力的結(jié)果具有一致性。同時(shí)也有文章與本研究結(jié)果相似, 鄭善元等[18]

表3 不同干燥方式處理后秋茄的生物活性(n=3)單位:%

報(bào)道了不同單叢茶水提物的ABTS 與DPPH檢測(cè)結(jié)果不一致。遲曉君等[19]研究了老山芹在干燥后的抗氧化性變化, 發(fā)現(xiàn)微波干燥老山芹的自由基清除能力最強(qiáng), 熱風(fēng)干燥組的最差, 真空冷凍干燥效果一般。程毛等[20]提取了不同干燥處理后柚子皮中的多糖進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥最大程度保留了秋茄的體外降血糖活性, 這與本研究結(jié)論一致。農(nóng)產(chǎn)品和中藥材體系, 僅僅通過化學(xué)評(píng)價(jià)或生物評(píng)價(jià)均無法全面評(píng)價(jià)整體質(zhì)量與臨床功效[21]。為實(shí)現(xiàn)藥材在加工過程中更好的整體質(zhì)量控制, 通常采用“質(zhì)量標(biāo)志物-生物活性” 關(guān)聯(lián)分析[22]。

2.3 皮爾遜線性相關(guān)分析

將不同干燥處理的秋茄的功能成分含量與生物活性結(jié)果結(jié)合起來進(jìn)行皮爾遜線性相關(guān)分析, 從而挖掘秋茄中各種功能成分與生物活性潛在的聯(lián)系,同時(shí)為后續(xù)秋茄高值化利用的研究提供基礎(chǔ), 分析結(jié)果如表4 所示。相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn), 秋茄的ABTS 自由基清除率與其總黃酮、總多糖、總?cè)坪砍蕵O顯著相關(guān) (P＜0.01) 且相關(guān)系數(shù)均大于0.86, 說明秋茄中的多糖類、三萜類以及黃酮類物質(zhì)貢獻(xiàn)了較強(qiáng)的抗氧化活性。DPPH 自由基清除率、α-葡萄糖苷酶抑制率與以上幾種功能物質(zhì)的含量無顯著性相關(guān) (P＞0.05)。DPPH 清除率與α-葡萄糖苷酶抑制結(jié)果呈極顯著性相關(guān) (P＜0.01), 與ABTS 結(jié)果無顯著性相關(guān) (P＞0.05)。

表4 各檢測(cè)指標(biāo)之間的皮爾遜線性相關(guān)性分析

秋茄中提取的酚酸被認(rèn)為具有很強(qiáng)的抗氧化活性, 其抗氧化活性與總酚含量呈顯著性相關(guān) (P＜0.05)[22-24]。此外, 秋茄中的黃酮、三萜、多糖等功能成分也具有一定的抗氧化以及降血糖的活性[4,22-26]。唐嵐等[25]通過HPD722 樹脂純化分離秋茄后得到了總黃酮占比77.48%的提取物, 50 μg·mL-1黃酮溶液的DPPH 自由基清除率就可以達(dá)到78.57%。秋茄中復(fù)雜的成分可能是其粗提物的皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果無顯著性的主要原因。此外,屬于同一種大類的不同細(xì)分物質(zhì)的生物活性也各不相同。翁夢(mèng)婷[5]研究同樣發(fā)現(xiàn), 秋茄的抗氧化活性與總酚含量高度顯著相關(guān) (P＜0.01), 但是同屬于酚酸的游離酚酸、可溶脂酚酸以及可溶糖苷化酚酸等之間的抗氧化活性存在顯著性差異 (P＜0.05)。這可能是導(dǎo)致本研究中抗氧化的結(jié)果與總酚含量未呈顯著性相關(guān) (P＞0.05) 的主要原因。

3 結(jié)論與討論

陽光自然曬干能最大限度地保留秋茄中的功能成分與生物活性, 可作為秋茄加工的最佳處理方式。吳秀彩等[27]歸納總結(jié)了秋茄中功能已被明確的化學(xué)成分, 包括12 種黃酮化合物、24 種萜類化合物、12 個(gè)酚酸化合物以及7 個(gè)糖苷化合物等。除抗氧化和降血糖功能外, 秋茄已被發(fā)現(xiàn)還有其他的藥用價(jià)值。符健[28]研究發(fā)現(xiàn), 秋茄粗提物對(duì)大鼠的胃潰瘍癥狀具有顯著的改善作用。秋茄的粗取物同時(shí)被發(fā)現(xiàn)具有廣譜抑菌作用, 分離出3 個(gè)抑菌作用強(qiáng)于粗提物的單體化合物HS-2 (京尼平甙酸)、HS-4 (京尼平甙酸的衍生物, 名稱為10-(4′-羥 基-3′, 5′-二 甲 氧 基 苯 甲 酰 基) -京 尼 平 甙酸) 和HS-5 (未知單體化合物)。王小蒙[29]研究發(fā)現(xiàn), 秋茄提取物對(duì)胰島素抵抗大鼠和2 型糖尿病大鼠的各相關(guān)指標(biāo)有明顯的改善作用, 可以提高胰島素敏感性, 保護(hù)胰島細(xì)胞, 減緩肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的堆積。由此可見, 秋茄中含有的功能物質(zhì)種類多、功能廣、活性強(qiáng), 是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ闹参镌? 干燥方式對(duì)其他功能成分及生物活性的影響還有待研究。

采收方式、切制方式、干燥方式、貯藏方式等諸多加工因素都會(huì)對(duì)其質(zhì)量造成不同程度的影響,而且這些因素對(duì)藥材中細(xì)分功能成分的影響是不規(guī)律的[30-33]。本研究探索了干燥對(duì)秋茄功能成分及生物活性的影響, 為其加工過程中的質(zhì)量控制提供了參考。