平菇發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中黃曲霉毒素降解變化分析

崔 筱，胡素娟，劉 芹，吳 杰，師子文，張玉亭，孔維麗

（河南省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所 鄭州 450002）

玉米芯是黃淮海地區(qū)栽培平菇的主要原料，秋季收獲后的玉米芯存放不當易產(chǎn)生黃曲霉毒素。黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一組由曲霉屬（Aspergillus）的一些霉菌產(chǎn)生的具有強毒性和致癌性的次級真菌代謝產(chǎn)物[1-3]。據(jù)統(tǒng)計，曲霉屬中有28個種的霉菌可產(chǎn)生黃曲霉毒素，其中最重要及最廣為人知是黃曲霉（A.flavus）、寄生曲霉（A.parasiti-cus）和紅綬曲霉（A.nomius）[4]。目前已分離鑒定出20 余種黃曲霉毒素異構體，其中最常見的包括B1、B2、G1、G2、M1、M2。

黃曲霉毒素具有穩(wěn)定的結構，通過物理（臭氧、微波、高壓、紫外照射、吸附劑等）或化學方法（堿處理法、氧化法等）僅能降低黃曲霉毒素的含量，很難將其完全去除。熟料栽培的金針菇菌渣中檢測出黃曲霉毒素，其殘留影響了食用菌菌渣飼料化及基質化的應用[5]。生物降解法是利用微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物或者所分泌的酶降解黃曲霉毒素，該方法由于其反應條件溫和、底物專一性強、不易破壞營養(yǎng)成分等特點成為了近幾年研究的熱點[6]。目前，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)多種細菌、真菌能夠降解黃曲霉毒素。孫然然[7]從土壤中篩選分離出一株纖維菌屬（Cellulosimicrobium）的芬氏纖維微菌（C.funkei），該菌株降解黃曲霉毒素B1 的能力可達到94.16%。Risa 等[8]發(fā)現(xiàn)，紅球菌屬（Rhodococcus）的紅平紅球菌（R.erythropolis）NI1 和紫紅紅球菌（R.rhodochrous）NI2 菌株對黃曲霉毒素B1 的降解率可分別達到80% 和84%。Risa 等[8]發(fā)現(xiàn)，紅球菌屬的R.erythropolis可有效降解黃曲霉毒素B1。Eshelli等[9]發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬（Streptomyces）的S.lividansTK24 和S.aureofaciensATCC10762 對AFB1 的降解率分別為86%和88%。于麗娜等[10]發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬（Pseudomonas）的M8 菌株可降解黃曲霉毒素B1。Akocak 等[11]發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌（P.fluorescens）PB27 對黃曲霉菌絲生長和孢子萌發(fā)具有抑制效果。劉長宇[12]研究發(fā)現(xiàn)藤黃單胞菌屬（Luteimonas）的菌株L.sp.CW574 對AFB1 的降解率可達到67.0%。李俊霞等[13]發(fā)現(xiàn)寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）的嗜麥芽窄食單胞菌（S.maltophilia）對AFB1 的降解率達85.7%。Hormisch 等[14]發(fā)現(xiàn)分枝桿菌屬（Mycobacterium）的M.fluoranthenivorans可有效去除黃曲霉毒素AFB1。宮小明等[15]研究表明，芽孢桿菌屬（Bacillus）的枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）在抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)、菌絲生長、分解毒素3 個方面都有顯著作用。吉小鳳等[16]從肉雞腸道糞便中篩選到一株乳桿菌屬脫毒菌株LAB-10，發(fā)現(xiàn)該菌株對AFB1的脫毒率達到63.4%。Line 等[17]通過C-14 標記黃曲霉毒素B1 來追蹤黃桿菌屬（Flavobacterium）的橙色黃桿菌（F.aurantiacum）對其降解的情況，發(fā)現(xiàn)該菌的活細胞和死細胞都可以吸收一定量的黃曲霉毒素。鄒盼盼等[18]發(fā)現(xiàn)類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）的飼料類芽孢桿菌（P.pabuli）E1 菌株有高效降解黃曲霉毒素的能力。李平[19]發(fā)現(xiàn)擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）的菌株海洋擬諾卡氏菌N.sp.MA03有高效抑制黃曲霉毒素合成的能力。Biernasiak等[20]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有降解AFB 的能力，在大麥、小麥和玉米粉的混合發(fā)酵試驗中，釀酒酵母菌能有效地降低AFB1、B2、G1 和G2 的含量，降解率達到30%以上。施翠娥等[21]采用氮離子注入黑曲霉（A.niger）后獲得一株黑曲霉突變株90A，發(fā)現(xiàn)其可以抑制合成或降解糧油作物中的黃曲霉毒素。Liu 等[22]利用假蜜環(huán)菌屬（Armillariella）的發(fā)光假密環(huán)菌（A.tabescens）E-20 的提取液可使樣品中的AFB1 含量減少80%。Wang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，原毛平革菌屬（Phanerochaete）的乳白原毛平革菌（P.sordida）YK-624 菌株可降解黃曲霉毒素B1。Motomura 等[24]發(fā)現(xiàn)，側耳屬（Pleurotus）的糙皮側耳（P.ostreatus）其發(fā)酵液具有降解黃曲霉毒素的功效。Das 等[25]利用側耳屬的平菇發(fā)酵液降解玉米秸稈中的AFB1。

前期研究表明，在平菇發(fā)酵料制備過程中，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）等大量的微生物參與其中，發(fā)酵微生物在不同階段基因豐度此消彼長，將物料分解成容易被平菇菌絲吸收的小分子營養(yǎng)物質[26]。這些菌群是否含有能夠降解玉米芯中的黃曲霉毒素的菌類，黃曲霉毒素含量是否變化尚未有分析報道。鑒于此，筆者利用前期以玉米芯為原料發(fā)酵制備平菇培養(yǎng)料進行的宏基因組和代謝組檢測數(shù)據(jù)為基礎，通過采用非度量多維尺度排序法（non-metric multidimensional scaling，NMDS）研究不同發(fā)酵階段發(fā)酵料中微生物種群基因豐度變化情況，通過進一步分析不同階段相關微生物基因豐度的變化與黃曲霉毒素含量的相關性，闡明發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中菌群變化與黃曲霉毒素合成和降解的相關規(guī)律，挖掘出平菇發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中合成、抑制/降解黃曲霉毒素的潛在菌群，為食用菌培養(yǎng)料的安全制備提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)酵原料及配方 發(fā)酵原料按照玉米芯84%、麩皮10%、尿素1%、石灰5% 的比例混勻，含水量68%。玉米芯、麩皮、石灰和尿素購自新鄉(xiāng)農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 試劑 LC-MC 級甲醇、水、甲酸、醋酸銨、FastDNA SPIN Kit for Soil（MP，USA）和AxyPrepDNA Purification Kit（AXYGEN，Inc.）購自索萊寶公司。

1.2 方法

試驗于2018 年11 月在河南省新鄉(xiāng)市進行。按照Kong 等[26]的發(fā)酵方法，將攪拌均勻的培養(yǎng)料堆疊成高60 cm、頂部寬80 cm、底部寬120 cm 的梯形堆，長度不限，每組培養(yǎng)料干料質量為250 kg，堆好后，用直徑30 cm 的木棍從上往下打孔，孔間距為30 cm，試驗進行10 d，從第3 天開始翻堆，每隔1 d 翻1 次堆，至發(fā)酵結束共翻堆4 次，每翻堆1 次取1 次樣品。以建堆第1 天的培養(yǎng)料為對照（T1），另4 次取樣分別標記為T2、T3、T4、T5。按照料堆形狀分別從左中右、上中下9 個位點各取樣1 kg，然后均勻混合為1 份樣品[27]，平均分成6 份，?80℃保存，用于發(fā)酵料微生物基因豐度及黃曲霉毒素含量分析。參照劉皓皓等[28]對發(fā)酵培養(yǎng)料進行的代謝組學檢測數(shù)據(jù)，測定黃曲霉毒素含量。采用Kong等[26]所做的發(fā)酵培養(yǎng)料宏基因組測定數(shù)據(jù)，對發(fā)酵料微生物進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS（version 20.0）進行Pearson相關性分析，采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）比較不同發(fā)酵時期微生物多樣性及黃曲霉毒素含量的差異性，用最小差異顯著分析法（LSD）進行多重比較，試驗結果用平均值表示。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段的黃曲霉毒素含量、曲霉屬相對基因豐度變化及相關性分析

以p<0.05 和VIP（variable importance in the projection）>1 為條件篩選出具有差異性表達的化合物，對在T1、T2、T3、T4、T5 時期檢測到的黃曲霉毒素進行分析。結果如圖1-A 所示，共檢測到兩類黃曲霉毒素，分別為AFM1、AFG2，且在T1 期含量均極顯著低于T2 期，在T1 和T2 時期AFM1 和AFG2 峰面積分別為704 621.885、107 624.797 和2 271 682.524、694 248.663，而在T3、T4、T5 階段未檢測到黃曲霉毒素。采用NMDS 分析了不同發(fā)酵階段曲霉屬相對基因的豐度變化，結果如圖1-B 所示，在T2 期，曲霉屬相對基因豐度最高，為2.00%，T1期最低，為0.01%，隨著發(fā)酵時間延長，在T3～T5期，曲霉屬相對基因豐度極顯著降低，分別為0.60%、0.30%和0.06%，表明發(fā)酵初期的升溫過程有利于曲霉繁殖，導致黃曲霉毒素含量增加。

圖1 不同發(fā)酵階段黃曲霉毒素含量及曲霉屬相對基因豐度Fig.1 Aflatoxin content and relative gene abundance of Aspergillus at different fermentation stages

為了探究黃曲霉毒素含量與曲霉屬間的關系，對在T1、T2、T3、T4、T5 時期檢測到的黃曲霉毒素含量與各階段的曲霉屬基因豐度進行Pearson 相關性分析。結果表明，AFM1 和AFG2 含量與曲霉屬基因豐度呈顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.489、0.530（表1），說明曲霉屬是合成黃曲霉毒素AFM1和AFG2 的種屬。

表1 不同發(fā)酵階段黃曲霉毒素含量與曲霉屬基因相對豐度變化相關性分析Table 1 Correlation analysis between aflatoxin content and relative abundance changes of Aspergillus genes at different fermentation stages

2.2 不同發(fā)酵階段發(fā)酵料中微生物種群基因豐度變化情況

為了確定發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中微生物種群的遺傳信息，推測這些微生物菌群是否與降解黃曲霉毒素有關，對不同階段的發(fā)酵料樣品進行了宏基因組測序和分析研究。采用非度量多維尺度排序法分析了不同發(fā)酵階段微生物種群的基因豐度變化。筆者將文獻報道的抑制/降解黃曲霉毒素相關的菌群和本研究中相對豐度較高的優(yōu)勢屬作為研究對象，結果表明，在本研究中，僅富集到纖維菌屬、紅球菌屬、鏈霉菌屬、假單胞菌屬、分枝桿菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、黃桿菌屬等細菌，并未檢測到假密環(huán)菌屬、原毛平革菌屬、側耳屬等屬的真菌（圖2）。在屬水平上，不同階段有不同的優(yōu)勢屬。在發(fā)酵前期（T1 期），不動桿菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬、谷氨酰胺桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌屬豐度較高，在嗜熱階段（T2、T3 期），芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、假黃色單胞菌屬、類芽胞桿菌屬、直絲菌屬豐度較高；在發(fā)酵后期（T4、T5 期），假黃色單胞菌屬、藤黃單胞菌屬、高溫雙岐菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬等豐度較高。其中，不動桿菌屬在T1、T2、T3 期豐度較高，且在T2 期達到最高（37.18%），高于發(fā)酵料制備整個時期的所有菌群，但到T4、T5期豐度分別降至0.25%、0.20%；假單胞菌屬在發(fā)酵前期豐度較高（11.48%），T2 期降至最低（0.32%），在T3、T4、T5 期豐度提高，分別為1.65%、2.92%、2.66%；假黃色單胞菌屬在T1、T2 階段豐度較低，在T3、T4、T5 期豐度逐漸提高，在T5 期達到最高（13.59%）；類芽胞桿菌屬、芽孢桿菌屬在整個時期豐度一直較高，在嗜熱階段（T3 期）均為最高（3.76%、12.62%）（表2）。

表2 不同發(fā)酵階段基于屬水平的種群基因豐度Table 2 Communities gene abundance based on the genus level at different fermentation stages %

圖2 不同發(fā)酵階段基于屬水平的微生物種群結構變化Fig.2 Microbial communities changes at the genus level at the different fermentation stages

2.3 黃曲霉毒素含量與不同階段相關微生物基因豐度變化的相關性分析

為了進一步探究黃曲霉毒素含量與優(yōu)勢菌群之間的關系，對在T1、T2、T3、T4、T5 時期檢測到的黃曲霉毒素含量與各階段相對豐度較大的優(yōu)勢屬基因豐度進行Pearson 相關性分析。由表3 可知，AFM1 含量與不動桿菌屬、乳酸桿菌屬均呈極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.961、0.765；AFG2 含量與不動桿菌屬、乳酸桿菌屬均呈極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.960、0.764；AFM1 和AFG2 含量與高溫雙岐菌屬、假黃色單胞菌屬、海洋擬諾卡氏菌屬、類芽胞桿菌屬、藤黃單胞菌屬、直絲菌屬、黃單胞菌屬呈顯著或極顯著負相關。

表3不同生長時期黃曲霉毒素含量與微生物種群基因豐度的相關性分析Table 3 Correlation between aflatoxin content and gene abundance of microbial communities during different growth periods

對藤黃單胞菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌屬、分枝桿菌屬、芽孢桿菌屬、類芽胞桿菌屬等可有效去除黃曲霉毒素的種屬進行進一步分析。結果見圖3，在T1～T3 階段，類芽孢桿菌屬基因豐度呈增加趨勢，在T4～T5 階段，其基因豐度呈降低趨勢，在T3期，基因豐度最高；T3～T5 階段，假黃色單胞菌屬、高溫雙岐菌屬為優(yōu)勢屬，且假黃色單胞菌屬呈增加趨勢，高溫雙岐菌屬在T4 期基因豐度達到最高，在T5 期大幅下降，但是這幾種屬未見有降解黃曲霉毒素的報道。

圖3 不同發(fā)酵階段降解黃曲霉毒素相關屬種群結構變化Fig.3 Histogram of communities changes of aflatoxin-related genera at different fermentation stages at the genus level

3 討論與結論

筆者研究發(fā)現(xiàn)，在平菇發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中T1、T2、T3、T4、T5 時期共檢測到兩類黃曲霉毒素，分別為AFM1、AFG2，含量在發(fā)酵初期較高，發(fā)酵中后期檢測含量為0。李亞莉等[29]接種產(chǎn)毒黃曲霉進行模擬普洱茶發(fā)酵試驗，結果表明，發(fā)酵初期，黃曲霉在茶葉中生長較快，至發(fā)酵4 d 時，茶葉中已有大量的黃曲霉生長，但到發(fā)酵后期（8 d 以后）長勢變?nèi)?，發(fā)酵終止時，未檢測到黃曲霉毒素，與筆者的研究結果基本一致。

通過對黃曲霉毒素含量與不同階段曲霉屬基因相對豐度變化的相關性分析，表明AFM1 和AFG2 含量與曲霉屬呈顯著正相關，與不動桿菌屬、乳酸桿菌屬呈極顯著正相關；與高溫雙岐菌屬、假黃色單胞菌屬、海洋擬諾卡氏菌屬、類芽胞桿菌屬、藤黃單胞菌屬、直絲菌屬、黃單胞菌屬呈極顯著負相關，推測呈負相關的這些菌群可能與抑制/降解黃曲霉毒素AFM1、AFG2 有關。研究發(fā)現(xiàn)藤黃單胞菌屬的Luteimona ssp.CW574、類芽胞桿菌屬有高效地降解黃曲霉毒素的能力[12,18]，但高溫雙岐菌屬、假黃色單胞菌屬、直絲菌屬、黃單胞菌屬是否能降解黃曲霉毒素尚未見報道，可推測類芽胞桿菌屬、藤黃單胞菌屬是降解平菇發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中黃曲霉毒素AFM1 和AFG2 的主要菌群。

黃曲霉毒素的污染主要在溫度高、濕度大、通風透氣條件不良等條件下產(chǎn)生[29]，在平菇發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中，T2 期料溫由30 ℃升至55 ℃，含水量68%，且在T2 期，曲霉屬相對基因豐度最高，為2.00%，導致黃曲霉毒素含量增加。盡管在T1～T2期，存在類芽胞桿菌屬、黃單胞菌屬菌群，但由于其基因豐度較低，并未發(fā)揮作用。T3～T5 期，料溫升至70 ℃左右，不利于黃曲霉菌群的繁殖，曲霉屬相對基因豐度極顯著降低，同時類芽胞桿菌屬、藤黃單胞菌屬、海洋擬諾卡氏菌屬基因豐度均增加，藤黃單胞菌屬為優(yōu)勢屬，但海洋擬諾卡氏菌屬基因豐度較低，這些菌群均具有降解黃曲霉毒素的功能，因此推測平菇發(fā)酵培養(yǎng)料發(fā)酵過程中藤黃單胞菌屬和類芽胞桿菌屬是主要的黃曲霉毒素降解菌。

綜上所述，藤黃單胞菌屬和類芽胞桿菌屬是平菇發(fā)酵培養(yǎng)料發(fā)酵過程中降解黃曲霉毒素AFM1和AFG2 的主要降解菌，后續(xù)還需要進一步分離相關菌株進行驗證。