董麗娟,楊少華,王 廣,沙日阿康,屈穎新,任新陽,黨彬州,李 廣,*

(1.陜西隴縣畜牧工作站,陜西 隴縣 721200;2.隴縣獸醫(yī)工作站;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院;4.隴縣固關(guān)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人畜共患疾病,被列為人類和動(dòng)物的第二類感染。家畜中牛、羊等動(dòng)物流動(dòng)性較其它動(dòng)物強(qiáng),臨床特征是主要侵害家畜的生殖系統(tǒng)。對(duì)母畜來說,該病的潛伏期為14～180 d,母畜最顯著的癥狀是流產(chǎn),發(fā)生時(shí)間不固定,常發(fā)生于第六到第八個(gè)月,大多數(shù)在第一次流產(chǎn)后則不再流產(chǎn),公畜則多出現(xiàn)睪丸炎,此病嚴(yán)重危害人和動(dòng)物健康,被OIE列為B類動(dòng)物疫病。該病在世界各地流行范圍十分廣泛,在很多國(guó)家和地區(qū)的家畜中廣泛報(bào)道,其中100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有人感染布氏桿菌病。我國(guó)多年堅(jiān)持檢疫和淘汰撲殺措施,使該病曾一度得到控制,但由于該病傳染性強(qiáng),且養(yǎng)殖人員防護(hù)意識(shí)較低,防控體系較薄弱,資金方面也是一筆不小的數(shù)目,所以當(dāng)前我國(guó)布病防控形勢(shì)依舊十分嚴(yán)峻。另一個(gè)新的流行病學(xué)趨勢(shì)是布魯氏菌病從牧區(qū)向農(nóng)區(qū)蔓延,以點(diǎn)狀散發(fā)或點(diǎn)狀暴發(fā)的形式流行。國(guó)外的布病檢測(cè)最早是在1976年Garin-Bastuji等首次用ELISA檢測(cè)布魯桿菌抗體,并發(fā)現(xiàn)其敏感性比試管凝集反應(yīng)要高10～100倍,在此基礎(chǔ)上,后面的研究者不斷地推出新的檢測(cè)方法和檢測(cè)工具。近年來,許多地區(qū)人畜間布病的發(fā)病率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。人類是布氏桿菌的終末宿主,可通過喝生乳,吃生肉或半熟的肉感染,或者飲用被病畜污染的水感染,也會(huì)通過吸入空氣中帶有布氏桿菌的塵埃,飛沫而感染,還可以通過創(chuàng)傷的皮膚而感染,從而危害人的健康。因此,加強(qiáng)布病的防控勢(shì)在必行。為了有效防控布病,必須嚴(yán)格執(zhí)行國(guó)家對(duì)該病的防控規(guī)定:非疫區(qū)通過監(jiān)測(cè)方法;穩(wěn)定控制區(qū)采用監(jiān)測(cè)凈化的方法;在控制區(qū)和疫區(qū)采用監(jiān)測(cè)、撲殺和免疫相結(jié)合的防控措施。控制本病傳染的最好的辦法就是堅(jiān)持自繁自養(yǎng),若要引入牛羊,一定要加強(qiáng)檢疫,避免引進(jìn)患病牛羊,如果牛羊已經(jīng)患有布病,應(yīng)及時(shí)進(jìn)行淘汰,做好消毒措施。疫苗接種也是預(yù)防本病的最有效措施。

隨著陜西省奶山羊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,奶山羊引進(jìn)頻率不斷增加,引入及外購奶山羊是引起本病傳播的主要途徑,所以引進(jìn)羊只時(shí)必須加強(qiáng)做好布病檢測(cè)工作?，F(xiàn)行的布病檢測(cè)還是停留在血清學(xué)布魯氏菌病抗體檢上,羊感染了布魯氏菌病后機(jī)體產(chǎn)生抗體后才能檢測(cè)出羊是否患有布氏菌病,在產(chǎn)生抗體之前著很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)很難檢測(cè)出來,但羊已感染布魯氏菌病,布魯氏菌病病菌已在羊群中開始轉(zhuǎn)播,待羊產(chǎn)生抗體再檢測(cè)出陽性個(gè)體,羊群中已感染很多,造成重大經(jīng)濟(jì)損失。為此,本研究采用布魯氏菌病抗原與抗體雙檢測(cè)方法對(duì)某地奶山羊場(chǎng)進(jìn)行了檢測(cè)分析,為奶山羊布魯氏菌病的凈化與防控相關(guān)的研究工作提供一定的理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 在隴縣選擇2家奶山羊養(yǎng)殖戶作為試驗(yàn)場(chǎng),試驗(yàn)用奶山羊514只。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 布病抗原、抗體檢測(cè)卡,由深圳芬德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 布魯氏功病抗原檢測(cè)卡檢測(cè) 布病抗原檢測(cè)卡通過膠體金免疫層析試驗(yàn)(GICA)方法制成,樣品加入至加樣孔后與膠體金標(biāo)記物同時(shí)沿層析膜下移,若樣品中的布病抗原與膠體金標(biāo)記物和檢測(cè)線的撲捉物結(jié)合從而顯示紫紅色,若樣品中不存在布病抗原,則不產(chǎn)生紫紅色反應(yīng),布病抗原檢測(cè)卡主要用于檢測(cè)血液中的布病抗原。

1.2.2 布魯氏菌病抗體檢測(cè)卡檢測(cè) 布病抗體檢測(cè)卡利用膠體金免疫試驗(yàn)(GICA)方法制成,樣品加入至加樣孔后與膠體金標(biāo)記物同時(shí)沿層析膜下移,若樣品中布病抗體與膠體金標(biāo)記物和檢測(cè)線的抗原結(jié)合從而顯示紫紅色,若樣品中不存在布病抗體,則不產(chǎn)生紫紅色反應(yīng)。布病抗體檢測(cè)卡主要用于檢測(cè)血清中的布病抗體。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 布魯氏菌病檢測(cè)結(jié)果與分析

2010年陜西某養(yǎng)羊場(chǎng)在引入羊只時(shí)不慎將布魯氏菌病羊引入,利用抗體單一布病檢測(cè)法發(fā)檢測(cè)了全群228只羊已感染36只,陽性率為15.79%,并對(duì)感染羊只進(jìn)行了無害化處理,羊場(chǎng)緊急進(jìn)行了清洗消毒;同時(shí)為了有效控制疫病的傳播,3個(gè)月后對(duì)剩余的192只羊有進(jìn)行了一次全群檢測(cè),結(jié)果檢測(cè)出18只陽性羊,陽性率為9.38%,同樣又在6個(gè)月后對(duì)剩余的174只羊采用抗原與抗體雙檢測(cè)方法,布病抗體單一檢測(cè)法檢出8只陽性羊,陽性率為4.60%,同樣的進(jìn)行進(jìn)化消毒;布病抗原檢測(cè)卡檢測(cè)檢測(cè)出10只羊,而且用布病抗體檢測(cè)卡和布病抗原檢測(cè)卡檢測(cè)出來的羊只編號(hào)完全不同,隨將18只羊全部進(jìn)行了無害化處理,6個(gè)月后對(duì)剩余的156只羊進(jìn)行布病抗原與抗體雙檢檢測(cè),結(jié)果僅檢查出1只陽性羊,陽性率為0.64%;6個(gè)月后對(duì)剩余的155只羊進(jìn)行同樣的方法進(jìn)行檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)布病陽性羊;繼續(xù)在3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行檢測(cè),均未發(fā)現(xiàn)陽性羊。某奶山羊場(chǎng)布病抗體單一檢測(cè)法和抗原與抗體雙檢測(cè)分析結(jié)果見表1。

表1 某奶山羊場(chǎng)布抗體單一檢測(cè)法與抗原與抗體雙檢測(cè)分析結(jié)果 只,%

3 布魯氏菌病檢測(cè)討論

世衛(wèi)組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織已經(jīng)宣布布病是易被忽視的人畜共患疾病之一,全球100多個(gè)國(guó)家每年約有50多萬新發(fā)布病病例。布魯氏桿菌病一直是我國(guó)存在的持續(xù)性的人畜共患病之一,也是各地養(yǎng)殖場(chǎng)區(qū)突出的公共衛(wèi)生問題,常年來對(duì)牛羊的生長(zhǎng)和繁育工作造成了很大的困擾。通過本次試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)引進(jìn)的羊只使用不同方法的布病檢測(cè),初次檢測(cè)的羊中使用雙抗結(jié)合使用檢測(cè)的陽性率更低為10.36%,比單一使用的檢測(cè)法低了5.45%,說明后者使用效果顯著;同樣的方法,在3個(gè)月后再次對(duì)剩余的健康羊群做布病檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用雙抗檢測(cè)法陽性檢出率降低明顯占健康羊只的0.64%,較抗體單一檢測(cè)法減少了8.74%,說明使用雙抗結(jié)合法檢測(cè)能對(duì)羊群起到較好的的檢測(cè)效果;然后在6個(gè)月后對(duì)第二次健康的羊只進(jìn)行布病檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗體單一檢測(cè)法檢出了8只羊,占全群健康羊只的4.60%,而使用雙抗結(jié)合的檢測(cè)方法沒有檢出陽性羊只,充分說明了使用雙抗檢測(cè)布病法優(yōu)于抗體單一檢測(cè)法,達(dá)到了預(yù)期凈化羊群的目的。羊的布病感染的因素是多方面的,進(jìn)入21世紀(jì)以來,隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高,奶羊產(chǎn)業(yè)逐漸繁榮起來,便捷的交通使人們可以隨處流動(dòng),從而導(dǎo)致布病的發(fā)病率也隨著持續(xù)升高。有研究表明,自2004年以來,布魯氏菌病的牲畜陽性率和感染人的數(shù)量明顯的升高,2014年達(dá)到峰值為57 222。也有大量的研究發(fā)現(xiàn),羊的布病感染率強(qiáng)于牛的。動(dòng)物感染布病的途徑主要是由于接觸感染布氏桿菌的家畜、細(xì)菌排泄物或食用被該菌污染的食物,尤其是綿羊和山羊奶制品。Zurong Y等人的研究表明,氣溫、日照時(shí)間、降雨量、相對(duì)濕度等在人間布氏桿菌病傳播的季節(jié)波動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。人感染本病主要表現(xiàn)為發(fā)熱,呈長(zhǎng)期低熱狀態(tài)或呈波形熱等,急性期患者多汗,最常見癥狀是全身無力,食欲不振類似于感冒,也會(huì)伴隨關(guān)節(jié)炎和生育等問題的出現(xiàn)。布魯氏菌 SAT 是目前診斷布病的確診證據(jù)之一,但不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果相差較大。

現(xiàn)階段,我國(guó)常用的布氏桿菌檢測(cè)的方法有3種:首先是細(xì)菌分離鑒定方法,它是布病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但由于布病的分離培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、檢出率低、檢測(cè)條件高,對(duì)試驗(yàn)技術(shù)人員的危害較大,存在一定的生物安全隱患。其次是血清學(xué)檢測(cè)方法,當(dāng)大規(guī)模檢測(cè)布病時(shí),血清學(xué)檢測(cè)是診斷布氏桿菌病的常用方法,其敏感性較差、易受到非特異性抗體干擾,易發(fā)生溶血、誤差大且操作較為繁瑣,易受肉眼觀察的主觀因素的影響等缺點(diǎn),且存在假陽性和假陰性,確診還需要結(jié)合其他檢測(cè)方法。最后是分子生物學(xué)檢測(cè)方法,隨著分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,PCR技術(shù)成為一種快速簡(jiǎn)便、純度要求低、特異性強(qiáng)、靈敏度高的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)方法,被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物學(xué)、生物學(xué)、食品衛(wèi)生等領(lǐng)域。但也存在一些假陰性、假陽性等問題,同時(shí)其缺乏規(guī)范化的檢測(cè)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。定量PCR易污染、實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所要求較高,限制了其推廣和臨床應(yīng)用,還需進(jìn)一步的優(yōu)化提升其檢測(cè)的穩(wěn)定性和實(shí)用性。

4 布魯氏菌病檢測(cè)結(jié)論

綜上所述,在本次試驗(yàn)條件下,使用單一抗原檢測(cè)發(fā)現(xiàn)假陰性率較高,檢測(cè)的周期也較長(zhǎng),而使用布病抗原檢測(cè)卡和布病抗體檢測(cè)卡兩者有機(jī)的結(jié)合的方法,檢測(cè)出的假陽性率較低,能在較短生長(zhǎng)周期內(nèi)凈化羊群,因此,使用后一種方法能較快檢出陽性率達(dá)到有效凈化奶山羊群體的目的,進(jìn)而對(duì)提高奶山羊養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益和全群羊只健康指數(shù)具有重要意義。