么麗梅 郭銳 楊俊曄 史麗 謝云富 李天君△ 楊文玲

(1.天津市臍帶血造血干細(xì)胞庫，天津 300384；2.協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司)

臍帶血作為造血干細(xì)胞的重要來源，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于臨床，是寶貴的人類生物資源。 為了保證臍帶血造血干細(xì)胞的安全和質(zhì)量，臍帶血需要進(jìn)行安全性和有效性檢測合格后長期凍存。 安全性的檢測項(xiàng)目包括梅毒螺旋體特異性抗體(抗-TP)、人類免疫缺陷病毒抗原抗體(HIV-Ag/Ab)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)、巨細(xì)胞病毒IgM 抗體(CMV-IgM)及細(xì)菌檢測等。 目前我國按照《血站技術(shù)操作規(guī)程》(2019 版)(國衛(wèi)醫(yī)函[2019]98 號(hào))和《臍帶血造血干細(xì)胞技術(shù)規(guī)范》(試行)(衛(wèi)辦醫(yī)發(fā)〔2002〕80號(hào))開展臍帶血安全性病原微生物檢測。 現(xiàn)將2012—2021年本地區(qū)64 077 例臍帶血、母血病原微生物檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2012—2021 年天津市臍帶血造血干細(xì)胞庫采集并分離的臍帶血樣本檢測結(jié)果64 077 例及其對(duì)應(yīng)的母血，所有樣本采集均按照《臍帶血造血干細(xì)胞庫技術(shù)規(guī)范(試行)》簽署知情同意書。 留取制備后、有核細(xì)胞(NC)濃縮完成前含有檸檬酸鹽抗凝劑的血液保存液的臍帶血血漿3 ～5 mL用于輸血傳染性病原體檢測；取臍帶血血漿12 mL，厭氧瓶中加入6 mL，需氧瓶中加入6 mL，進(jìn)行細(xì)菌檢測。 含有檸檬酸鹽抗凝劑的母血，經(jīng)1 760 g，離心15 min 后取其血漿進(jìn)行輸血傳染性病原體檢測。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 Hamilton E-STAR 全自動(dòng)酶免分析儀、Hamilton STAR8CH 酶免分析加樣系統(tǒng)，Hamilton FAME24/30 全自動(dòng)酶免分析儀、BacT/Alert 3D 血培養(yǎng)系統(tǒng)。

1.2.2 試劑 需氧菌及厭氧菌培養(yǎng)瓶(生物梅里埃公司)；HBsAg(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司、上海榮盛生物藥業(yè)股份有限公司、英科新創(chuàng)廈門科技股份有限公司)；抗-HCV(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司、上海榮盛生物藥業(yè)股份有限公司、英科新創(chuàng)廈門科技股份有限公司)；HIV-Ag/Ab(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司、上海榮盛生物藥業(yè)股份有限公司、英科新創(chuàng)廈門科技股份有限公司)；抗-TP(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司、上?？迫A生物工程股份有限公司、英科新創(chuàng)廈門科技股份有限公司)；CMV-IgM(北京貝爾生物工程股份有限公司、北京現(xiàn)代高達(dá)生物技術(shù)有限責(zé)任公司、鄭州安圖生物工程股份有限公司)。 以上所有篩查試劑均經(jīng)國家批檢合格并在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌檢測 將接種臍帶血血漿的厭氧菌培養(yǎng)瓶和需氧菌培養(yǎng)瓶放置在BacT/Alert 3D 血培養(yǎng)系統(tǒng)中(35±1)℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)限為7 d，陽性報(bào)警標(biāo)本進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。 假陽性標(biāo)本需進(jìn)行轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，最終以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)。 臍帶血細(xì)菌培養(yǎng)檢測單一項(xiàng)陽性或兩項(xiàng)目檢測均陽性時(shí)，記為1 例陽性。

1.3.2 輸血傳染性病原體檢測 臍帶血及其對(duì)應(yīng)母血血漿標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行檢測，所有標(biāo)本進(jìn)行HBsAg、抗-HCV、HIV-Ag/Ab、抗-TP、CMV-IgM 項(xiàng)目篩查，所有檢測項(xiàng)目參照試劑盒說明進(jìn)行操作。 所有標(biāo)本均采用兩種不同廠家試劑進(jìn)行檢測。 其中HIV-Ag/Ab 項(xiàng)目采用不同廠家的三代和四代試劑盒進(jìn)行檢測。 初次檢測呈反應(yīng)性標(biāo)本，采用原試劑進(jìn)行雙孔復(fù)試。 復(fù)試后至少1 孔呈反應(yīng)性判定該試劑有反應(yīng)性；兩種試劑中任意1 種呈現(xiàn)反應(yīng)性，則判定該標(biāo)本結(jié)果為有反應(yīng)性。 HIV 檢測初篩有反應(yīng)性標(biāo)本送檢天津市疾病預(yù)防控制中心采用蛋白印跡方法進(jìn)行確認(rèn)。1.4 數(shù)據(jù)分析 采用GraphPad.v6.01 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用n(%)表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌檢測結(jié)果 2012—2021 年臍帶血細(xì)菌培養(yǎng)陽性率呈下降趨勢，每年陽性率有差異(P＜0.05)，厭氧菌陽性率高于需氧菌陽性率及需、厭氧雙陽性率(P＜0.05)，具體檢測結(jié)果見表1、圖1。

圖1 臍帶血細(xì)菌檢測不同類型陽性率趨勢圖

表1 2012—2021 年64 077 份臍帶血細(xì)菌培養(yǎng)檢測結(jié)果比較n(%)

2.2 細(xì)菌陽性鏡檢結(jié)果 2012—2021 年細(xì)菌陽性標(biāo)本經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢檢出率G－桿菌依次高于G＋桿菌、G＋球菌、G－球菌及其他。 具體檢測結(jié)果見表2。

表2 2012—2021 年2 072 例細(xì)菌培養(yǎng)陽性臍帶血鏡檢結(jié)果比較 n(%)

2.3 輸血傳染性病原體檢測結(jié)果 2012—2021 年64 077 例臍帶血及對(duì)應(yīng)母血輸血傳染性病原體檢測結(jié)果，臍帶血檢測結(jié)果反應(yīng)性169 例(0.26%)，母血檢測結(jié)果反應(yīng)性1 231 例(1.92%)。 另外臍帶血及母血HIV 檢測初篩反應(yīng)性共14 例，其中母血11 例，臍血3 例，經(jīng)外送確認(rèn)后，母血不確定1 例，其余均為陰性。 其他輸血傳染性病原體檢測結(jié)果見表3、圖2。

圖2 輸血傳染性病原體檢測結(jié)果趨勢圖

表3 2012—2021 年64 077 例臍帶血及對(duì)應(yīng)母血輸血傳染性病原體檢測反應(yīng)性結(jié)果比較n(%)

3 討論

臍帶血作為造血干細(xì)胞的重要來源，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于臨床。 臍帶血檢測是保障臍帶血移植用血安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，要提高臍帶血移植的安全性，應(yīng)在臍帶血的采集、運(yùn)輸、分離、凍存等處理過程中盡量避免病原微生物污染[1-3]，不斷完善臍帶血和母血檢測技術(shù)，提高檢測準(zhǔn)確性和靈敏度以保證臍帶血的質(zhì)量。

從結(jié)果可以看出，本次篩查2012—2021 年臍帶血細(xì)菌陽性率3.23%，臍帶血輸血傳染性病原體總反應(yīng)率0.26%，母血輸血傳染性病原體總反應(yīng)率1.92%，基本上呈下降趨勢，這與我國和本地區(qū)總體的醫(yī)療水平和輸血傳染病防控措施不斷提高有直接關(guān)系。 輸血傳染性病原體檢測一直是我國重點(diǎn)強(qiáng)化的課題，我國臍帶血檢測依據(jù)一般血站血液檢測策略開展，從采用雙試劑檢測到核酸檢測，不斷減少臍帶血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步保障了臍帶血造血干細(xì)胞的安全[4]。

血液細(xì)菌污染危害大，嚴(yán)重者可導(dǎo)致休克、多臟器衰竭等一系列臨床癥狀。 作為造血干細(xì)胞來源的臍帶血，須保證無菌生長才能臨床應(yīng)用。 臍帶血污染與采集、運(yùn)輸和分離制備等過程無菌操作有關(guān)[5-6]。 有資料顯示臍帶血細(xì)菌污染中，厭氧菌多于需氧菌，主要污染菌屬有埃希菌屬、擬桿菌屬、乳桿菌屬、糞腸球菌及表皮葡萄球菌，與本地區(qū)細(xì)菌檢出情況及鏡檢結(jié)果基本一致[7-8]。 劉頡等曾報(bào)道廣東省臍帶血細(xì)菌污染率為3.1%[9]，從結(jié)果可以看出，本地區(qū)2012—2021 年臍帶血細(xì)菌總陽性率3.23%，并呈下降趨勢(P＜0.05)，這與本地區(qū)臨床胎兒分娩、實(shí)驗(yàn)室操作無菌技術(shù)和相關(guān)操作進(jìn)一步規(guī)范等有較大關(guān)系。

乙型肝炎病毒(HBV)感染有血液傳播、母嬰傳播等多種方式，母嬰傳播是新生兒感染的主要傳播途徑，全國約有30%～50%的HBV 攜帶者是由母嬰垂直傳播導(dǎo)致的[10]。 從結(jié)果看出，采集臍帶血的產(chǎn)婦HBsAg 有反應(yīng)性率為1.38%，陽性率呈下降趨勢，采集的新生兒臍帶血HBsAg 有反應(yīng)性率僅為0.03%。 近年來國家衛(wèi)生防疫機(jī)構(gòu)大力宣傳和推廣對(duì)乙肝的預(yù)防和阻斷，加大乙肝疫苗接種力度，及時(shí)為新生兒接種乙肝疫苗，乙肝感染率有所下降。

丙型肝炎主要的傳播方式包括血液傳播，性傳播及母嬰傳播3 種。 HCV 感染后缺乏有效的保護(hù)性免疫，母嬰傳播缺乏有效的阻斷措施，因目前尚無可用的丙肝疫苗進(jìn)行有效的預(yù)防，母嬰傳播是造成我國HCV 感染持續(xù)存在原因之一。在我國一般人群抗-HCV 陽性率為0.60%(0.40%～0.79%)，兒童中抗-HCV 陽性率為0.09%～0.26%，孕產(chǎn)婦中抗-HCV陽性率為0.08%～0.50%[11]。 從結(jié)果可以看出，本地區(qū)10 年來臍帶血及其母血抗-HCV 有反應(yīng)性率分別為0.11%、0.12%，與我國兒童及孕產(chǎn)婦HCV 流行病學(xué)相一致。 臍帶血與母血抗-HCV 檢測結(jié)果無差異(P＞0.05)，這也進(jìn)一步說明目前HCV 感染產(chǎn)婦所娩新生兒尚無有效的阻斷方法[12]。

梅毒主要傳播途徑為性傳播，其他傳播途徑還有血液傳播、母嬰傳播等。 抗-TP 篩查是安全輸血的重要指標(biāo)之一。連宏宇等[13]曾報(bào)道舟山市梅毒檢出率為0.72%，2013—2016 年天津市梅毒初篩陽性率0.21%[14]。 本文結(jié)果顯示2012—2021 年臍帶血及母血抗-TP 檢測有反應(yīng)性率分別為0.12%、0.13%，臍帶血與母血抗-TP 有反應(yīng)性率基本一致(P＞0.05)。 除2021 年外，2012—2020 年臍帶血及母血抗-TP 檢測有反應(yīng)性率呈下降趨勢(P＜0.05)。 這與國家及地方加大預(yù)防梅毒傳播宣傳、對(duì)妊娠期梅毒患者采取有效的干預(yù)、梅毒篩查等措施的執(zhí)行有很大關(guān)系。

巨細(xì)胞病毒(CMV)最常見的機(jī)會(huì)性感染性病毒，常見于器官移植、骨髓移植和艾滋病患者，對(duì)免疫機(jī)能不全患者可以導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。 CMV 可通過供體器官或血制品感染受者。 移植受者的諸多因素可誘導(dǎo)CMV 從潛伏狀態(tài)被激活。葛俊[15]等的研究中顯示臍帶血血漿可以攜帶并傳播CMV病毒。 因此臍帶血不論是自體移植應(yīng)用還是異體移植應(yīng)用，CMV 的檢測都是必不可少的。 CMV 抗體血清學(xué)檢測是篩查CMV 臨床風(fēng)險(xiǎn)的重要檢測手段之一。 從檢測結(jié)果可以看出，本地區(qū)臍帶血CMV-IgM 的反應(yīng)率(1/64 077)，明顯低于母血CMV-IgM 反應(yīng)率0.29%。 胡云等[16]報(bào)道中提出感染的孕產(chǎn)婦體內(nèi)存在循環(huán)抗體能部分保護(hù)孕期母嬰垂直傳播，周萍等[17]報(bào)道:孕婦血清CMV-IgM 陽性率約為3.1% ～13.44%，新生兒血或臍血CMV-IgM 陽性率約0.6%～8.5%，產(chǎn)婦CMV-IgM 檢測陽性率高于其新生兒臍血陽性率。 藍(lán)陳福等[18]曾報(bào)道的2017—2019 年麗水市孕婦靜脈血CMV-IgM陽性率為0.78%，新生兒CMV-IgM 陽性率為1.14%，左江成等[19]報(bào)道湖北宜昌市孕婦CMV-IgM 陽性率為0.3%，新生兒CMV-IgM 陽性率為0.1%。 這些報(bào)道與本地區(qū)母血及臍帶血CMV-IgM 有反應(yīng)性檢出率不同，可能與檢測方法不同、檢測試劑不同有關(guān)，還可能與種族、地理區(qū)域差異、衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)等因素有關(guān)[20]。

另外，本次調(diào)查2012—2021 年間臍帶血及其母血HIVAg/Ab 檢測初篩有反應(yīng)性標(biāo)本共14 例，經(jīng)蛋白印跡方法確認(rèn)，其中1 例母血結(jié)果報(bào)告為HIV-1 抗體不確定，其余均為陰性。 可能與選擇對(duì)象為孕產(chǎn)婦有關(guān)，一般情況下醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測母親人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性時(shí)不建議儲(chǔ)存臍帶血。 母嬰傳播是HIV 感染的途徑之一，感染了HIV 的女性在妊娠及分娩過程中，可將病毒傳播給胎兒，當(dāng)然母嬰阻斷也起到關(guān)鍵作用。

總之，臍帶血安全無小事，臍帶血造血干細(xì)胞的安全性與病原微生物檢測質(zhì)量直接相關(guān)，為減少臍帶血造血干細(xì)胞移植和輔助移植引發(fā)的傳染病發(fā)生，應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)操作規(guī)范和試劑說明書進(jìn)行檢測，同時(shí)開展實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系建設(shè)可進(jìn)一步提升臍帶血檢測能力。 建議相關(guān)部門科學(xué)設(shè)置臍帶血和母血檢測策略，以及針對(duì)基于血緣關(guān)系的臍帶血，建立差異化的檢測標(biāo)準(zhǔn)，從而進(jìn)一步促進(jìn)我國公共臍帶血庫和自體臍帶血庫的健康發(fā)展，有效地提高國家臍帶血造血干細(xì)胞臨床應(yīng)用和發(fā)展水平。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。