李慧宇 崔彤 李詩(shī)佳 周士源 朱文娟 李靜 馬驍 吳小津

(國(guó)家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 江蘇省血液研究所國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)血栓與止血重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215006)

急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)是1 種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以淋巴細(xì)胞惡性增殖為特點(diǎn)。 異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是惡性血液腫瘤的重要治療手段，接受allo-HSCT 的患者因移植前長(zhǎng)期激素治療、免疫抑制、術(shù)后粒缺期長(zhǎng)、留置導(dǎo)管等原因，易合并血流感染，以及各種病毒尤其是CMV、EBV 等的感染。 allo-HSCT 后免疫重建與臨床預(yù)后密切相關(guān)[1-2]，免疫監(jiān)測(cè)和免疫調(diào)控治療是未來(lái)的發(fā)展方向。 淋巴細(xì)胞是構(gòu)成人體免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞，血液系統(tǒng)腫瘤患者在病程中免疫微環(huán)境發(fā)生一定變化，影響免疫細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖及分化，同時(shí)異常的淋巴細(xì)胞亞群影響患者的預(yù)后，多項(xiàng)研究提示CD4＋T 淋巴細(xì)胞、CD8＋T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞在allo-HSCT 后可能影響患者aGVHD、復(fù)發(fā)等治療結(jié)局[3-6]。 ALL 患者預(yù)后差，生存期短，早期、積極的監(jiān)測(cè)免疫重建情況可能有利于預(yù)測(cè)患者移植后合并癥發(fā)生情況。 我們旨在分析接受allo-HSCT 的ALL 患者移植術(shù)后早期免疫重建的情況及并發(fā)癥發(fā)生情況。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2018 年12 月至2022 年2 月本院接受allo-HSCT 的99 名ALL 患者，隨訪時(shí)長(zhǎng)為移植后1 年。

1.2 方法

1.2.1 干細(xì)胞的動(dòng)員及采集 供體接受重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rh G-CSF)5μg/kg bid 皮下注射，連續(xù)注射5 d，d 5在全身麻醉下采集骨髓，或接受rh G-CSF 動(dòng)員5 d 后采集外周血干細(xì)胞。 光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)采集物中單個(gè)核細(xì)胞數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)采集物中CD34＋細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 預(yù)處理方案 改良BUCY 為主的預(yù)處理:司莫司汀(Me CCNU) 250 mg/m2·d，－10 d；羥基脲(Hu) 40mg/kg，q12h，－10 d；阿糖胞苷(Ara－C) 2g/m2·d，－9，－8 d；馬利蘭(Bu) 0.8mg/kg，q6h，－7，－6，－5 d；環(huán)磷酰胺(CTX) 1.8g/m2·d，－4，－3 d；－2、－1 d 休息，0 d 回輸造血干細(xì)胞。

1.2.3 HSCT 期間移植物抗宿主病(GVHD)的預(yù)防 采用環(huán)孢素A(cyclosporin A，CSA)、麥考酚嗎乙酯(MMF)及短程甲氨喋呤(methotrexate，MTX)預(yù)防GVHD。 親緣同胞全相合HSCT 者不用MMF。 HLA 不全相合的親緣及無(wú)關(guān)供體全相合移植患者，預(yù)處理過(guò)程中加抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)、預(yù)防GVHD。

1.2.4 感染預(yù)防及治療 所有患者入倉(cāng)前均備皮并予藥浴，環(huán)丙沙星腸道準(zhǔn)備，移植預(yù)處理及造血重建前，均住百級(jí)層流病房，無(wú)菌飲食。 患者移植前予更昔洛韋預(yù)防病毒激活，入倉(cāng)后密切觀察體溫等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)感染征象時(shí)，立即予血培養(yǎng)，同時(shí)經(jīng)驗(yàn)性予抗生素治療。 發(fā)生敗血癥即血培養(yǎng)陽(yáng)性者根據(jù)藥物敏感調(diào)整抗菌藥物，并定期復(fù)查轉(zhuǎn)陰。 對(duì)于既往有侵襲性真菌感染的患者，在患者血象下降時(shí)開(kāi)始使用伊曲康唑針劑進(jìn)行二次預(yù)防，直至血象恢復(fù)。

1.2.5 支持治療 當(dāng)血小板計(jì)數(shù)＜20×109/L 時(shí)輸注血小板懸液，血紅蛋白濃度＜60 g/L 時(shí)輸注紅細(xì)胞懸液。 如供受者血型相合，則輸注同型血制品，如血型不合，則輸洗滌去白“O”型紅細(xì)胞懸液及輻照“AB”型血小板懸液。 患者預(yù)處理及造血干細(xì)胞輸注過(guò)程中，予水化堿化，注意出入量平衡，必要時(shí)予速尿利尿。

1.3 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 收集患者移植前(預(yù)處理前1 ～3周內(nèi))及移植后30 d、60 d、90 d 外周血，采用流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)移植前，移植后30 d、60 d、90 d 的CD3＋T， CD3＋CD4＋T， CD3＋CD8＋T， CD3＋CD19＋B 細(xì)胞及CD3－CD16＋CD56＋NK 細(xì)胞比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 26.0 及R 語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，圖像繪制應(yīng)用prism 8.0 軟件完成。 計(jì)量資料用中位數(shù)(范圍)或中位數(shù)[P25；P75]表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，Kaplan-Meier 用于計(jì)算總生存(overall survival，OS)率和無(wú)病生存(disease free survival，DFS)率，競(jìng)爭(zhēng)風(fēng)險(xiǎn)模型用于計(jì)算復(fù)發(fā)率和非復(fù)發(fā)死亡率(non-relapse mortality，NRM)。 因素分析利用Cox 回歸及Logistic 回歸分析。 以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01 為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征和臨床結(jié)果 共收集99 名ALL 患者，患者臨床特征見(jiàn)表1。 粒系中位植入時(shí)間11(8～28)d，巨核系中位植入時(shí)間14(10～120)d。 11 例患者在移植后30 d 內(nèi)發(fā)生血流感染(BSI)，累積發(fā)生率為11.10%，其中8 名感染菌種為肺炎克雷伯菌，3 名為銅綠假單胞菌。 移植后100 d 內(nèi)，40 名患者感染CMV，累積發(fā)生率為40.40%。 7 名患者感染EBV，累積發(fā)生率為7.10%。 22 名患者發(fā)生急性移植物抗宿主病(aGVHD)，累積發(fā)生率22.30%。 移植后1 年內(nèi)發(fā)生廣泛慢性移植物抗宿主病(cGVHD) 患者14 名，累積發(fā)生率16.20%。 13 名患者在移植后1 年內(nèi)復(fù)發(fā)，1 年累積復(fù)發(fā)率13.84%。 9 名患者死亡，2 名為復(fù)發(fā)后死亡，7 名為非復(fù)發(fā)死亡，非復(fù)發(fā)死亡事件主要為器官功能衰竭(n＝5)、細(xì)菌感染(n＝2)。 所有患者1 年累積無(wú)病生存率(DFS)為80.60%，1 年總生存(OS)為90.30%。

表1 患者臨床特征 (n，%)

2.2 淋巴細(xì)胞亞群免疫重建 以我國(guó)九省健康成人淋巴細(xì)胞檢測(cè)參考區(qū)間中的中位數(shù)為對(duì)照[7]，我們比較了移植前和移植后30 d，60 d 和90 d 淋巴細(xì)胞亞群比例的變化，ALL 的患者移植前CD4＋T 淋巴細(xì)胞比例中位數(shù)33.58% [24.44%；41.46%]，顯著低于正常人群36.66% [24.01%；49.05%]，CD8＋T 淋巴細(xì)胞比例中位數(shù)46.34% [34.03%；61.86%]高于正常人群25.40% [15.71%；38.24%]，CD4＋/CD8＋比值中位數(shù)0.7294 [0.460 4；1.017 9] 低于正常人群1.531 6[1.315 3；1.760 1]，CD16＋CD56＋NK 比例中位數(shù)10.25%[5.65%；14.25%] 也低于正常人群18.37% [6.37%；34.83%]。 相對(duì)于移植前，CD4＋T 淋巴細(xì)胞比例在移植后30、60、90 d 均下降(P＜0.01)，CD8＋T 淋巴細(xì)胞比例在移植后30 d 下降(P＜0.01)，在移植后90 d 上升(P＜0.05)，移植后60 d 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD4＋/CD8＋比值在移植后30、60、90 d 均下降(30 d，P＜0.05；60、90 d，P＜0.01)，CD16＋CD56＋NK 細(xì)胞比例在移植后30、60、90 d 均升高(P＜0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 患者淋巴細(xì)胞亞群變化

2.3 移植后各事件發(fā)生與淋巴細(xì)胞免疫重建 我們比較了移植后30 d，60 d，90 d 各時(shí)間點(diǎn)淋巴細(xì)胞亞群重建與100 d內(nèi)aGVHD，CMV，EBV 等并發(fā)癥的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CD4＋/CD8＋比值與aGVHD 的發(fā)生正相關(guān)(OR 1.21，95CI 1.01～1.45，P＜0.05)。 移植前及移植后30 d，無(wú)BSI 發(fā)生組CD16＋CD56＋NK 細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)高于BSI 組，P＜0.05；移植后60 d 和90 d，CMV 組CD4＋T 細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)均低于無(wú)CMV 感染組，P＜0.05。 同時(shí)，移植后90 d，CMV 組CD4＋/CD8＋T 細(xì)胞比值低于無(wú)CMV 感染組，P＜0.05。 Cox 回歸分析顯示，移植后60 d較高水平的CD4＋T 細(xì)胞是發(fā)生100 d 內(nèi)CMV 感染的保護(hù)性因素(HR 0.91， 95CI 0.84～0.99，P＜0.05)。

3 討論

ALL 的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸與其患者機(jī)體的免疫功能，尤其是細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)[8-9]。 淋巴細(xì)胞是構(gòu)成人體免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞表面的標(biāo)記物和功能可以分為許多不同的群體。 臨床上常用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外周血中的不同群體的淋巴細(xì)胞進(jìn)行鑒別和計(jì)數(shù)，包括CD3＋T 淋巴細(xì)胞，CD4＋輔助/誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞，CD8＋抑制/殺傷T 淋巴細(xì)胞，CD19＋B 淋巴細(xì)胞，CD16＋CD56＋NK 淋巴細(xì)胞等。 ALL 患者在疾病發(fā)展中，免疫微環(huán)境隨之發(fā)生一定變化，疾病的多種因素會(huì)影響免疫細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖及分化，使外周血的淋巴細(xì)胞數(shù)量與功能產(chǎn)生異常[10]，導(dǎo)致免疫功能失調(diào)[11]。

Allo-HSCT 是ALL 患者重要的治療手段，目前廣泛應(yīng)用于臨床。 異基因造血干細(xì)胞移植預(yù)后依賴于造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的恢復(fù)，其中免疫系統(tǒng)的恢復(fù)包括免疫細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù)和功能的重建。 移植后粒系和巨核系容易獲得成功植入，但是移植后免疫活性細(xì)胞的重建遲于造血重建，同時(shí)受到受者基本情況、干細(xì)胞來(lái)源、預(yù)處理方案等多重因素的影響。移植后非特異性免疫細(xì)胞恢復(fù)最早，其中NK 細(xì)胞一般移植后2～3 周即可恢復(fù)[12]，而特異性免疫細(xì)胞重建相對(duì)滯后，CD8＋T 淋巴細(xì)胞一般移植后1 ～3 月逐漸恢復(fù)，CD4＋T 淋巴細(xì)胞恢復(fù)通常需1 年以上，CD19＋B 淋巴細(xì)胞移植后恢復(fù)時(shí)間不定，短至3 個(gè)月，長(zhǎng)至1 年半以上[13]。 本研究中主要檢測(cè)了90 d 內(nèi)的淋巴細(xì)胞亞群，CD19＋B 細(xì)胞在移植后90 d 內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)低水平，沒(méi)有辦法做統(tǒng)計(jì)分析。

NK 細(xì)胞屬于機(jī)體固有免疫系統(tǒng)，其功能依賴活化受體和抑制受體調(diào)節(jié)活性而非抗原提呈過(guò)程，故可以早于適應(yīng)性免疫發(fā)生作用。 NK 細(xì)胞是allo-HSCT 后最早恢復(fù)的細(xì)胞可能與其發(fā)育成熟依賴骨髓微環(huán)境而并非胸腺有一定關(guān)系[14]。 研究提示NK 細(xì)胞功能異常與腫瘤復(fù)發(fā)及病毒感染有關(guān)[15-16]，同時(shí)對(duì)于慢性感染患者具有保護(hù)作用[17-18]。 NK細(xì)胞與感染發(fā)生密切相關(guān)，可對(duì)于真菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、炭疽桿菌或傷寒沙門菌等革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌產(chǎn)生直接殺傷[19-21]。 在造血干細(xì)胞移植過(guò)程中，NK 細(xì)胞移植后早期恢復(fù)有利于鞏固移植物的植入，減少GVHD，并發(fā)揮移植物抗白血病(GVL)作用[22]。 Huttunen 等[23]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)allo-HSCT 治療的患者中，移植32 d NK 細(xì)胞數(shù)量達(dá)到＞120/μL 水平者在移植后3 年內(nèi)具有較高的PFS、較低復(fù)發(fā)率和移植相關(guān)死亡率。 在本研究中，未發(fā)生BSI 組在移植前和移植后30 d CD16＋CD56＋NK 細(xì)胞計(jì)數(shù)高于BSI 組，P＜0.05。ALL 患者由于長(zhǎng)期使用廣譜抗生素、移植后長(zhǎng)時(shí)間處于粒缺期、留置多個(gè)導(dǎo)管等因素，移植后易合并血流感染。 作為天然免疫的重要組成部分，NK 細(xì)胞在早期防御感染方面具有重要的作用，缺乏功能性NK 細(xì)胞的患者相對(duì)于NK 細(xì)胞功能正常的患者更易于感染，如本研究所示，BSI 組患者移植前CD16＋CD56＋NK 細(xì)胞計(jì)數(shù)較未發(fā)生BSI 組顯著偏低，更低的NK 細(xì)胞水平意味著患者早期防御能力較差，提示患者移植后有更大的可能合并BSI。

T 淋巴細(xì)胞按照其表面標(biāo)志的不同，可分為CD4＋輔助/誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞，CD8＋抑制/殺傷T 淋巴細(xì)胞等亞群。 對(duì)外周血CD4＋、CD8＋T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)可以反映患者免疫功能發(fā)生的改變，輔助診斷腫瘤和機(jī)會(huì)性感染等的發(fā)生。CD4＋、CD4＋/CD8＋比值減小與惡性腫瘤的發(fā)生、病毒感染有關(guān)。 ALL 患者allo-HSCT 后常常免疫功能低下，潛伏的CMV可能會(huì)重新被激活引起活動(dòng)性感染，同時(shí)因非血緣造血干細(xì)胞和單倍體移植預(yù)處理中常規(guī)應(yīng)用ATG，ATG 具有抑制T 淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)GVHD 效應(yīng)的作用[24]，但同時(shí)無(wú)法避免的影響免疫功能恢復(fù)，從而導(dǎo)致移植后患者抗病毒感染能力減弱。CMV 在感染患者機(jī)體后通過(guò)分泌毒性物質(zhì)促進(jìn)抑制免疫效應(yīng)性和輔助性細(xì)胞因子，一方面可阻滯調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞增殖，促使其減弱對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用[25]。 另一方面可間接阻滯活性因子對(duì)T 淋巴細(xì)胞CD3＋和CD4＋亞群的激活作用，導(dǎo)致機(jī)體T 細(xì)胞分化成熟時(shí)出現(xiàn)異常，促使機(jī)體CD3＋和CD4＋T 淋巴細(xì)胞亞群的水平下降，進(jìn)一步導(dǎo)致其對(duì)機(jī)體免疫功能的效應(yīng)與輔助作用減弱，減輕機(jī)體殺傷性免疫細(xì)胞對(duì)CMV的殺傷作用[26]。 本研究中移植后60 d 和90 d， CMV 組CD4＋T 細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)均低于無(wú)CMV 感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多因素分析移植后60 d 較高水平的CD4＋T 細(xì)胞是發(fā)生100 d 內(nèi)CMV 感染的保護(hù)性因素。 因此，移植后低水平CD4＋T 細(xì)胞患者或需加強(qiáng)CMV 感染的預(yù)防與管理。

GVHD 是allo-HSCT 患者需要面臨的重要挑戰(zhàn)。 發(fā)生GVHD 的患者移植相關(guān)死亡率大幅上升，是否能及時(shí)判斷GVHD 的發(fā)生并能進(jìn)行搶先治療大大影響移植成敗。 高炎癥狀態(tài)是GVHD 的主要特點(diǎn)，有學(xué)者提出具有負(fù)調(diào)控炎癥反應(yīng)功能的Treg 細(xì)胞隨GVHD 等級(jí)的增加呈下降趨勢(shì)，有望成為預(yù)測(cè)急、慢性GVHD 的特異性指標(biāo)[27-28]。 本研究中，根據(jù)是否合并急慢性GVHD 分組比較患者的淋巴細(xì)胞亞群，2組患者在CD4＋T、CD8＋T 及CD16＋CD56＋NK 細(xì)胞差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不排除與隨訪時(shí)間較短和病例數(shù)較少有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，移植后30 d CD4＋/CD8＋比值與aGVHD 的發(fā)生正相關(guān)(OR 1.21，95CI 1.01～1.45，P＜0.05)，提示移植后T 淋巴細(xì)胞重建可能影響aGVHD 的發(fā)生。 CD4＋/CD8＋比值是判斷機(jī)體免疫功能的1 項(xiàng)重要臨床指標(biāo)，既往研究已證實(shí)CD4＋T 淋巴細(xì)胞和CD8＋T 淋巴細(xì)胞參與GVHD 的發(fā)生，但細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)的具體機(jī)制有待臨床進(jìn)一步證實(shí)。

機(jī)體的免疫應(yīng)答與淋巴細(xì)胞亞群之間的相互協(xié)作和相互制約關(guān)系密切。 免疫功能失調(diào)一方面可使機(jī)體發(fā)生感染，另一方面可導(dǎo)致自身免疫性疾病和超過(guò)敏反應(yīng)。 T 淋巴細(xì)胞重建可能與移植后CMV 感染的發(fā)生相關(guān)，有助于早期識(shí)別臨床CMV 感染。 更低的NK 細(xì)胞水平意味著患者早期防御能力較差，提示患者移植后有更大的可能并發(fā)BSI。 對(duì)于欲行異基因造血干細(xì)胞移植治療的ALL 患者來(lái)說(shuō)，淋巴細(xì)胞亞群水平監(jiān)測(cè)尤為重要[23，29]，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞亞群水平可評(píng)估患者整體免疫功能水平，有利于移植后并發(fā)癥的監(jiān)測(cè)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。