張玉 朱振剛

支氣管哮喘是一種慢性肺部疾病,由血漿外滲和炎性細胞(如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和肥大細胞)內(nèi)流引起的慢性氣道炎癥所致,支氣管哮喘通常被定義為可逆性氣道阻塞,但它可以演變?yōu)椴豢赡娴姆喂δ軗p害[1-2]。根據(jù)涉及的主要免疫-炎癥途徑,哮喘可分為Th2相關(guān)性哮喘、非Th2相關(guān)性哮喘和混合型。據(jù)報道,嗜酸性粒細胞浸潤肺粘膜和間質(zhì)與2型免疫反應(yīng)導(dǎo)致的哮喘的嚴重程度密切相關(guān)[3-4]。其中,Th2相關(guān)性哮喘的典型特征是氣道嗜酸性粒細胞計數(shù)升高,非Th2相關(guān)性哮喘的典型特征是氣道嗜酸性粒細胞計數(shù)正常,但氣道中性粒細胞計數(shù)升高[5]。目前人們對哮喘的分子和細胞機制已經(jīng)有了較好的認識,但仍尚未完全了解。嗜酸粒細胞胞外陷阱(eosinophil extracellular trap,EET),由活化的嗜酸性粒細胞釋放DNA纖維以及顆粒蛋白組成,并在宿主的防御中發(fā)揮效應(yīng)功能,促進炎癥和/或有效消除病原體[6-7]。有實驗表明,所有哮喘患者的肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中均觀察到了EET,并且其數(shù)量與嗜酸性粒細胞相關(guān)[8]。那么究竟EET能否成為哮喘治療新的靶點,本文就嗜酸性粒細胞胞外陷阱與哮喘的關(guān)系進行綜述。

一、嗜酸性粒細胞胞外陷阱(EET)

1 嗜酸性粒細胞以及EET

科學(xué)家將嗜酸性粒細胞最早描述為炎癥滲出液中的“顆粒細胞”,而“嗜酸性粒細胞”這個名稱則首次見于名為《關(guān)于血液的特定顆粒》的論文中。人類嗜酸性粒細胞是骨髓來源的白細胞,具有特異性的形態(tài)學(xué)特征,包括雙葉核和充滿細胞毒性和免疫調(diào)節(jié)蛋白的細胞質(zhì)顆粒,他們在骨髓中發(fā)育并可釋放到外周血和相應(yīng)的組織中,嗜酸性粒細胞通常只占外周血白細胞的1%至3%[9-10]。

嗜酸性粒細胞通過三種主要機制(包括胞吐、細胞溶解和碎片脫顆粒)對不同刺激作出反應(yīng)而脫顆粒。最近,除了脫顆粒外,嗜酸性粒細胞釋放細胞外DNA陷阱(EET釋放)的過程被描述為不同炎癥條件下嗜酸性粒激活的重要機制[11]。

EET首次由Shida Yousefi等[12]報道,當嗜酸性粒細胞被激活后,會以活性氧依賴的方式釋放DNA結(jié)構(gòu),DNA結(jié)構(gòu)和顆粒蛋白會在胞外空間形成能夠在體外和體內(nèi)炎癥條件下結(jié)合和殺死細菌的細胞外結(jié)構(gòu),但當其釋放過多時,則具有一定的致病性。據(jù)報道,EET有兩種形成方式,一種快速形成,另一種是緩慢形成。快速形成的EET由線粒體DNA網(wǎng)組成,含有陽離子蛋白,通常儲存在嗜酸性粒細胞的細胞質(zhì)次級顆粒中;緩慢形成的EET由富含組蛋白的核DNA組成,其缺乏游離陽離子蛋白[13]。

并非所有的EET都是通過細胞裂解釋放的。一方面,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞中的EET釋放涉及其雙葉核的溶解,核膜的破裂,胞質(zhì)成分的混合和細胞膜的破裂,因此EET最終可能以細胞死亡的方式結(jié)束[14]。但另一方面,亦有研究表明,肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid,BALF)中的嗜酸性粒細胞產(chǎn)生EET后卻沒有顯示任何凋亡或壞死的跡象,均保持較高的活力,這表明DNA釋放是一個活躍的過程,不引起細胞的凋亡或壞死[15]。Rodrigo-Muoz等[16]亦已經(jīng)表明,嗜酸性粒細胞在面對細菌或真菌時能夠排出其線粒體DNA而不會死亡?，F(xiàn)在人們已經(jīng)認識到所有EET的產(chǎn)生都是不同的,有些可能是從活細胞中釋放出來的,有些則是從溶解(壞死)細胞中產(chǎn)生的。

2 影響因素

據(jù)報道,眾多因素或物質(zhì)會影響EET的形成,或抑制或參與EET的釋放。對于抑制其形成的物質(zhì),如表面活性劑蛋白-D(SP-D),這是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的氣道上皮細胞的產(chǎn)物,SP-D可以直接結(jié)合到嗜酸性粒細胞膜上,并以濃度依賴性方式抑制人和鼠嗜酸性粒細胞的細胞外DNA陷阱形成。SP-D還抑制嗜酸性粒細胞陽離子蛋白誘導(dǎo)的遷移、脫顆粒[17]。而參與EET形成過程的則有自噬、活性氧(ROS)、重組人脫氧核糖核酸酶(rhDNase)、溶血磷脂酰絲氨酸(LysoPS)等。其中,細胞自噬會參與EET釋放及肺部炎癥。Silveira等人證明,當小鼠用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)治療可減少氣道中EET的形成,因此研究者認為3-MA治療可以成為減少哮喘中肺部炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體損傷和EETs形成的一種替代方案[18]。此外,Silveira等人還發(fā)現(xiàn)活性氧(ROS)是哮喘中EETs形成所必需的,當用卵清蛋白(OVA)鼻內(nèi)激發(fā)之前,用兩種活性氧抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)或二苯碘(DPI)治療小鼠時,發(fā)現(xiàn)DPI和NAC治療可降低肺嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)以及各種促炎細胞因子,并且減少了氣道中的EET釋放[19]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽以氧化酶依賴性方式誘導(dǎo)EET形成[20]。最近有實驗證明,重組人脫氧核糖核酸酶(rhDNase)改善了肺功能和DNA細胞外陷阱,rhDNA酶顯著降低了氣道阻力,減少了EETs的形成和球狀細胞增生[21]。

Kim等[22]的研究則表明溶血磷脂酰絲氨酸(LysoPS)誘導(dǎo)的EET與所檢測的幾種信號通路(如EGFR-MAPKs、PI3K、NF-γB)無關(guān),但依賴于精氨酸脫氨酶蛋白4(PAD4);并且LysoPS以濃度依賴而不是時間依賴的方式誘導(dǎo)EET。除此之外,不同濃度的胸腺基質(zhì)淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin ,TSLP)刺激純化的血液嗜酸性粒細胞時,發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞以時間和濃度依賴的方式釋放細胞外DNA[23]。

3 DNA的來源

對于EET釋放DNA的來源一方觀點認為來自于線粒體DNA,一方認為來自于核DNA。更早之前的研究認為其是線粒體來源[24],學(xué)者發(fā)現(xiàn)當哮喘小鼠感染呼吸道合胞病毒(RSV)時,可以在體外肺泡灌洗液中誘導(dǎo)EET,并且RSV以濃度依賴性方式誘導(dǎo)EET的釋放,并且證明其釋放的DNA為線粒體起源[25];近年來,多數(shù)研究學(xué)者證明大多數(shù)EET由起源于細胞核的組蛋白結(jié)合DNA組成,人類嗜酸性粒細胞含有很少的線粒體,表明可以釋放的線粒體DNA很少[26]。亦有研究表明,EET-DNA含有(8.72±1.99)%的線粒體DNA,表明EET-DNA主要來源于染色體DNA[4]。半乳糖凝集素-10的帽樣積累出現(xiàn)在嗜酸性粒細胞的核葉前,很可能是為了準備與DNA相關(guān)的半乳糖凝集素-10的噴射記錄噴射的EET含有組蛋白,進一步證實EET由核而不是線粒體DNA組成[13]。而Kim等[22]人的實驗發(fā)現(xiàn)即使在EET形成后,完整的線粒體也僅存在于細胞內(nèi)部,釋放的DNA中發(fā)現(xiàn)瓜氨酸H3,表明染色質(zhì)去凝聚,線粒體DNA 不太可能存在于EET中。盡管目前研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了EET中DNA結(jié)構(gòu)的釋放可能來源于不同的結(jié)構(gòu),但嗜酸性粒細胞究竟在何種刺激下有選擇的釋放DNA機構(gòu),仍需要進一步的研究探索。

4 嗜酸性粒細胞陷阱與中性粒細胞陷阱

胞外陷阱包括中性粒細胞胞外陷阱、嗜酸性粒細胞胞外陷阱、嗜堿性粒細胞胞外陷阱、肥大細胞胞外陷阱、巨噬細胞胞外陷阱、單核細胞胞外陷阱以及漿細胞樣樹突狀細胞胞外陷阱[27],目前的研究發(fā)現(xiàn)中,與哮喘聯(lián)系較多的當屬中性粒細胞胞外陷阱與嗜酸性粒細胞胞外陷阱。那么二者在形成過程中究竟有何異同呢?

Brinkmann及其同事[28]首次在中性粒細胞中描述了DNA胞外陷阱釋放(neutrophil extracellular traps, NETs)現(xiàn)象。NET是由脫縮染色質(zhì)組成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),裝飾有抗菌顆粒成分,包括中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和髓過氧化物酶(MPO),在NET形成過程中,核染色質(zhì)被縮聚,加載顆粒狀蛋白質(zhì)并最終釋放到細胞外空間[29]。

NET和EET在穩(wěn)定性方面具有不同的屬性,與中性粒細胞相比,嗜酸性粒細胞含有更少的蛋白酶,因此嗜酸性粒細胞染色質(zhì)免于內(nèi)源性蛋白酶消化[30],性質(zhì)較為穩(wěn)定。亦有研究稱,由于嗜酸性粒細胞顆粒中蛋白酶的活性較低,這些嗜酸性粒細胞DNA纖維比中性粒細胞更厚、更穩(wěn)定,這表明EETs可能比NETs產(chǎn)生更持久的效果[31]。

在結(jié)構(gòu)上,中性粒細胞DNA陷阱中DNA絲的直徑為15～17nm,許多直徑約為25nm的球形物質(zhì)(很可能是蛋白質(zhì))與DNA結(jié)合[32],相比之下,嗜酸性粒細胞DNA陷阱主要由25～35nm染色質(zhì)纖維組成,核心組蛋白是DNA陷阱中最豐富的蛋白質(zhì),將近2米的DNA包裝成一個小細胞核,是豐富酶的靶標[33]。

完整顆粒的釋放而非顆?；鞍椎尼尫疟徽J為是嗜酸性粒細胞和中性粒細胞DNA陷阱的主要區(qū)別[22]。

二者除不同點外還存在著一些共性。研究發(fā)現(xiàn),嗜酸性粒細胞和中性粒細胞都通過釋放細胞毒性蛋白、活性氧,以及可能的細胞外陷阱參與氣道上皮損傷。并且NETs和EETs均具有抗感染和促炎特性的網(wǎng)狀DNA結(jié)構(gòu),其都會參與哮喘的病理生理學(xué)[34]。而且EET和NET的形成都取決于NADPH氧化酶的活化[35]。

二、EET與哮喘及嚴重哮喘的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn),EETs使用藥物和遺傳方法增強實驗性非感染相關(guān)性哮喘中的杯狀細胞增生、粘液產(chǎn)生、炎癥細胞浸潤和2型細胞因子的表達。多種臨床相關(guān)的變應(yīng)原部分通過體內(nèi)胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素觸發(fā)EET形成。在機制上,EET通過CCDC25-ILK-PKCα-CRTC1途徑激活肺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞,該途徑由嗜酸性粒細胞過氧化物酶增強[36]。在EETs中所含的各種顆粒蛋白中,嗜酸性粒細胞陽離子蛋白能夠引起哮喘患者的組織損傷[37]。

嚴重哮喘(SA)患者的嗜酸性粒細胞比來自非嚴重哮喘(NSA)患者的嗜酸性粒細胞更活躍,形成EET的嗜酸性粒細胞與基線FEV1%呈負相關(guān)預(yù)測值,并與哮喘患者的血清EDN水平呈正相關(guān)。從SA患者中分離的外周血嗜酸性粒細胞在以ROS依賴性方式激活I(lǐng)L-5和LPS后表現(xiàn)出EET產(chǎn)生增加[38]。最近一項研究表明,當哮喘患者分為SA患者和NSA患者時,血清細胞角蛋白(CK)18水平顯著升高,并且SA患者的CK18特異性IgG水平明顯高于NSA患者,CK18特異性抗體能夠誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞脫顆粒,導(dǎo)致EET形成。這些EET進一步刺激AEC釋放CK18,增強SA中的嗜酸性粒細胞炎癥,導(dǎo)致形成惡性循環(huán)[39]。此外,EETs可以通過介導(dǎo)SA的自身免疫反應(yīng)來誘導(dǎo)哮喘進展;從嚴重哮喘患者收集的痰液自身抗體可觸發(fā) SA 患者的嗜酸性粒細胞溶解和EET形成[40]。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn),重癥哮喘患者釋放的EET誘導(dǎo)了上皮細胞衍生的細胞因子,如IL-1α、IL-1β、CXCL-1、CCL24、IL-33和TSLP,而這些因子都會加重哮喘的發(fā)生。此外,EET治療后肺ILC2的數(shù)量及活化增加,通過產(chǎn)生IL-5和IL-13導(dǎo)致2型氣道炎癥[41]。重度哮喘患者的循環(huán)NET水平高于輕度或中度哮喘患者或健康對照組,與NET水平相反,循環(huán)EET水平與哮喘嚴重程度無關(guān)[42]。最近的研究亦表明,嗜酸性粒細胞釋放的細胞外陷阱和囊泡,可以增強與氣道上皮相互作用的2型免疫反應(yīng),在嚴重嗜酸性粒細胞性哮喘的發(fā)病機制中起重要作用[43]。

而EET不僅與哮喘關(guān)系密切,在慢性鼻炎-鼻竇炎[15]、塑型性支氣管炎[44]、特異性皮炎[45]等疾病的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián),這里我們不再一一敘述。

三、結(jié)語

綜上所述,來自活化嗜酸性粒細胞的EET是哮喘診斷和治療的新靶點。進一步了解 EET 的形成機制將有助于更好地診斷和治療哮喘及嚴重哮喘。同時一些研究者也提出了關(guān)于EET的進一步研究方向,如關(guān)于EET的更準確的觸發(fā)因素[47];不同的嗜酸性細胞亞型是否同樣會導(dǎo)致EET的釋放;預(yù)防或溶解EET的方法;EET釋放的DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與蛋白顆粒之間的關(guān)系等,這些問題仍需要進一步探索。而隨著技術(shù)的不斷進步,對EET研究力度的不斷加強,EET可能成為哮喘的新的潛在治療靶點,將更好的指導(dǎo)哮喘的臨床治療。