液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測信陽水牛乳中唾液酸含量

張彩芳，徐 佳，張瑞廷，2

（1.漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南漯河 462333；2.漯河市食品研究院有限公司，河南漯河 462300）

中國是世界第三大水牛養(yǎng)殖大國，信陽水牛作為中國水牛地方優(yōu)良品種之一，主產(chǎn)于河南省信陽市，中心產(chǎn)區(qū)為信陽市的光山、羅山、新縣等縣區(qū)[1]。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)機械的發(fā)展，信陽水牛逐步從單純的役用向乳用、肉用方向轉(zhuǎn)化[2]。信陽水牛產(chǎn)乳性能較好，且乳脂率高達5%～10%，泌乳期一般7～8 個月，也有長達10 個月以上的，平均日產(chǎn)乳量3～5 kg。

水牛乳作為世界第二大乳源，具有良好的食用安全性[3]，其蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等含量遠高于奶牛乳，免疫球蛋白G、溶菌酶等生物活性物質(zhì)含量達到奶牛乳的5～10 倍[4]。同時，水牛乳中的維C、維E 等含量均高于奶牛乳。陳瑞芳[5]研究結(jié)果表明，水牛初乳中的免疫球蛋白G（lgG）、免疫球蛋白A（lgA）、類胰島素生長因子（IGF-1） 含量分別是常乳的41.83，12.44，3.07 倍，說明水牛乳含有生物活性成分。Saksena R 等人[6]從水牛乳低聚糖中分離得到一種新型戊糖，具有免疫刺激活性，可提高免疫應(yīng)答反應(yīng)。羅曾玲等人[7]均對水牛乳中過敏原進行了相關(guān)研究，用益生菌水牛酸奶飼喂大鼠，發(fā)現(xiàn)益生菌水牛酸奶具有清除自由基的作用[8-9]。李玲等人[10]研究表明，水牛乳多肽具有抗氧化作用。Clare D A 等人[11]的研究顯示，水牛乳中具有抗血栓肽作用的κ- 酪蛋白。潘健存[12]研究結(jié)果顯示水牛初乳不僅能增強機體的免疫力，且有降糖降脂作用。水牛乳中的中鏈脂肪酸含量較飲用牛乳高，飲用水牛乳能使老年人的膽固醇水平降低，可預(yù)防老年性疾病[13-14]。Colarow L 等人[15]研究結(jié)果均表明，水牛乳具有抗炎、抗菌活性作用。以上研究結(jié)果均表明水牛乳具有一定的增強免疫力、抗氧化等功能特性，作為高級營養(yǎng)食品之一，水牛乳正逐漸成為人們消費的“新寵”[16-18]，前述研究均集中在水牛乳的營養(yǎng)和功能特性方面，少見對水牛乳中唾液酸的相關(guān)研究。

唾液酸（Sialic acid，SA） 是一種天然的碳水化合物，從唾液腺黏蛋白中提取分離得到[19]，故以唾液酸命名。唾液酸是高等動物和某些微生物具有的重要分子，在自然界分布很廣，可作為重要物質(zhì)基礎(chǔ)實現(xiàn)糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)及功能多樣化[20]，保護了生物大分子和細胞免受酶和免疫的攻擊。2017 年，國家衛(wèi)健委7 號文將N- 乙酰神經(jīng)氨酸批準為新食品原料。目前，唾液酸生物學(xué)功能以及其應(yīng)用于疾病預(yù)防與治療方面的研究日益受到重視。動物試驗結(jié)果顯示，在仔豬膳食中添加唾液酸，可使大腦額葉皮質(zhì)中唾液酸的含量增加，提高與學(xué)習(xí)相關(guān)的2 個基因的表達[21]。同時也有研究表明，SA 作為腦部營養(yǎng)素的一種，能促進嬰幼兒大腦發(fā)育、增強學(xué)習(xí)能力、發(fā)育能力[22]。

測定SA 含量的方法種類眾多，目前主要有分光光度法、色譜法（高效液相色譜法及氣相色譜法）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、核磁法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS） 等方法?；赟A 的化學(xué)性質(zhì)，其容易與樣品基質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致前處理過程中純化難度增加，由于SA 含量差異較大，要求檢測方法的線性范圍寬，抗干擾能力強。分光光度法存在敏感度不高、定量不夠準確等問題。酶聯(lián)免疫法成本較高且操作復(fù)雜。因液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法無需衍生即可對SA 定性定量測定且靈敏度高，采用超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法定性定量測定水牛乳中的SA 含量，為進一步研究水牛乳中的SA 提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 6470 型液相色譜- 三重四極桿質(zhì)譜儀；ML204T 型電子分析天平，梅特勒- 托利多儀器，上海有限公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器，廣東晉元科技有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q 型超純水儀，美國Millipore 公司產(chǎn)品；氮吹儀，美國Organomation 公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph 公司產(chǎn)品。

1.2 樣品與試劑

水牛乳，采自信陽水牛保種場；甲醇（色譜純），乙酸銨（色譜純），F(xiàn)isher 公司提供；唾液酸標準品（純度大于99%），Sigma 公司提供；HLB 固相萃取柱，Waters 公司提供；三氯乙酸（分析純）、鹽酸（優(yōu)級純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters AtiantisTMT3（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動相：甲醇+0.1%乙酸銨溶液（4+6）；流速0.3 mL/min，進樣量5 μL，柱溫35 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧負離子（ESI-） 模式；離子源溫度150 ℃，毛細管電壓2.8 kV，干燥氣溫度450 ℃，干燥氣流量650 L/h，錐孔反吹氣流量150 L/h，檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（Multi-reaction monitoring，MRM）模式。

唾液酸的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM） 條件見表1。

表1 唾液酸的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM） 條件

1.3.3 標準溶液的制備

精確稱取唾液酸標準品，加入甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，甲醇定容，配制成唾液酸質(zhì)量濃度為1 000 g/L 的標準品儲備液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

標準品溶液系列：用流動相將1 000 g/L 標準品儲備液分級稀釋至10 μg/L，再分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00 μg/mL的標準溶液系列。

1.4 樣品前處理

稱取水牛乳樣品（5.00±0.01） g 于50 mL 離心管中，加入質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液20 mL，渦旋振蕩混勻樣品，超聲10 min，加入質(zhì)量分數(shù)為0.1%的鹽酸溶液5 mL，超聲5 min 后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用超純水多次清洗離心管，清洗液轉(zhuǎn)移至容量瓶并用超純水定容，于80 ℃水浴水解2 h，冰浴至室溫，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心15 min，取1 mL 上清液于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用流動相定容至1 mL 振蕩超聲，0.22 μm 有機濾膜過濾，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜結(jié)果

分別嘗試了正負離子模式，對唾液酸母離子進行全掃描后，發(fā)現(xiàn)正離子模式相比較與負離子模式，不僅母離子豐度偏低，產(chǎn)生的離子碎片更為復(fù)雜，且背景干擾更大，故最終選擇負離子模式。按照儀器條件對水牛乳中唾液酸含量進行測定。

MRM模式下的提取離子流圖見圖1。

圖1 MRM 模式下的提取離子流圖

2.2 定量限和檢測限試驗結(jié)果

以信噪比S/N≥3 計算方法的檢出限為0.3 μg/kg，以信噪比S/N≥10 計算方法的定量限為1.2 μg/kg。該方法靈敏度高，可滿足水牛乳中唾液酸的檢測要求。

2.2.1 回收率試驗結(jié)果

在水牛乳基質(zhì)中分別加唾液酸標準品濃度的50%，100%，150%，重復(fù)測量3 個不同濃度加標量3 次，結(jié)果表明回收率的RSD 值為2.48%，回收率為91.67%～98.15%，平均回收率為95.29%。

樣品加標回收率見表2。

表2 樣品加標回收率

2.2.2 重復(fù)性試驗結(jié)果

重復(fù)性試驗結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果

分別稱取6 份水牛乳樣品，經(jīng)過前處理后進樣分析。由表3 可知，6 份水牛乳樣品中唾液酸含量的RSD 值為3.67%，證明該方法重復(fù)性良好。

2.3 線性回歸試驗結(jié)果

分別取質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00 μg/mL 的標準溶液，不同質(zhì)量濃度標準品進樣3 次。以3 次峰面積的平均值為縱坐標，標準品濃度為縱坐標繪制標準同線，計算標準曲線方程，結(jié)果表明唾液酸標準品在0.01～2.00 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)度為0.999 7。

線性回歸試驗結(jié)果見表4。

表4 線性回歸試驗結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一份水牛乳樣品，經(jīng)過前處理后，分別測定其在放置2，4，6，8，10 h 后的峰面積，RSD 值為2.30%，表示該樣品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.5 樣品測定

分別選取5 種不同存欄期的水牛乳樣品，經(jīng)過前處理后測定其唾液酸含量。

不同存欄期水牛乳中唾液酸含量見表6。

表6 不同存欄期水牛乳中唾液酸含量

3 結(jié)論

唾液酸作為重要的元素參與嬰幼兒大腦發(fā)育和認知發(fā)育。研究采用液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法對信陽水牛乳中唾液酸含量進行初步測定。結(jié)果表明，信陽水牛乳中唾液酸的含量為177～220 mg/kg。劉爽等人[23]2021 年對5 種市售牛乳樣品中的唾液酸含量進行測定，結(jié)果表明5 種市售牛乳中唾液酸的含量為177.6～228.9 mg/L，該研究結(jié)果與之相接近。

該研究建立了液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法測定水牛乳中唾液酸的研究方法，樣品預(yù)處理操作簡單，無需衍生，分析范圍較寬（0.01～2.00 μg/mL），相關(guān)系數(shù)達0.999 7，線性關(guān)系良好。采用該方法，信陽水牛乳樣品的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.2 μg/kg，檢測方法相對靈敏，精密度和準確性良好。信陽水牛乳中唾液酸回收率結(jié)果表明，不同濃度水平的樣品加標回收率均在90%以上，加標回收含量的RSD為2.48%。該方法操作簡單，降低了水牛乳中基質(zhì)的干擾，可準確地測定信陽水牛乳中唾液酸的含量，為信陽水牛乳中唾液酸的測定提供有效可行手段，為信陽水牛的合理保護、乳及乳制品的開發(fā)利用探索更多可能性。