鄭二帥,曹 猛,李 孌,梁蘭蘭,廖熙娜
(廣東美味鮮調味食品有限公司,廣東中山 528400)
大腸菌群作為食品安全控制環(huán)節(jié)中重要指標之一,GB 4789.3—2016 中提供了2 種方法,分別為第一法(MPN 法) 與第二法(平板計數法)[1],不同的企業(yè)會根據自身的試驗室設備、試劑、人員技能、樣品種類及對檢測結果交期的需求。自主選擇第一法(MPN 法) 或第二法(平板計數法) 進行檢測,對于2 種方法檢測靈敏性,不同類型樣品最適的檢測方法,以確保結果的符合性研究的較少。規(guī)范不同類產品最適宜的檢測方法,把好質量關,確保生產產品的食品安全性,是作為食品生產品控工作者的核心職責。
通過對不同類型樣品同時用2 種檢測方法進行檢測,對比檢測結果差異性,對差異性原因進行調查研究,為不同樣品選擇檢測方法提供指導依據[2]。
大腸菌群測定第一法(MPN 法),采用以月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST) 為主要試劑的檢測方法,通過在(36±1) ℃培養(yǎng)24~48 h,對產氣發(fā)酵管,轉接到煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB) 管中,(36±1) ℃培養(yǎng)條件下進行驗證試驗,確定樣品中大腸菌群最大可能數MPN 值。
GB/T 4789.3—2016 大腸菌群測定第二法(平板計數法),采用結晶紫中性膽鹽瓊脂(VRBA) 主要試劑,以通過在(36±1) ℃培養(yǎng)24~48 h,挑取典型和可疑菌落至煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB) 管中,(36±1) ℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24~48 h 進行復發(fā)酵驗證試驗。
1.1.1 材料
抽取兩類典型樣品,A:某公司經生產加工產品,細胞遭受破損的樣品,分別為醬料半成品樣200 份和腐乳半成品樣220 份;B:某公司員工手部、工作服擦拭抽樣,菌落細胞未經物理化學破壞的樣品,共150 份。
1.1.2 試劑
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)、煌綠乳糖膽鹽(BGLB)、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)、無菌磷酸鹽緩沖液(KHPO)、無菌生理鹽水、1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl 溶液。
依據標準:GB 4789.3—2016 的方法要求,分別采用第一法(MPN 法) 和第二法(平板計數法) 對樣品進行檢測,依據產品內控標準,對照檢測結果對產品進行合格率判定。
樣本的大腸菌群數合格判定標準依據企業(yè)標準制定,大腸菌群數<3.6 MPN/g 或者<3.6 CFU/g。
樣品檢測均使用同一品牌同一批次的試劑,消除試劑的誤差影響,檢測人員為同一組2 名人員,均為檢測經驗3 年以上人員,以消除檢測過程的人員操作誤差。
第一法(MPN 法) 和第二法(平板計數法) 的檢測結果比較見表1,不同檢測方法樣品不合格率對比見圖1。
圖1 不同檢測方法樣品不合格率對比
表1 第一法(MPN 法) 和第二法(平板計數法) 的檢測結果比較
2.2.1 結果分析
由表1 可知,采用GB 4789.3—2016 檢測腐乳、醬料半成品樣、員工手部、工作服擦拭樣的不合格率經統(tǒng)計學分析(X2=0.076,p>0.05) 差異無顯著性,在總計570 份樣品,第一法(MPN 法) 檢測結果超出內控標準樣品數為44 個,占比7.72%。第二法(平板計數法) 檢測結果超出內控標準樣品數為33 個,占比5.79%。第二法(平板計數法) 與第一法(MPN 法) 相比,絕對偏低1.93%,同比相對偏低25.0%。
不同類樣品檢測結果差異性較大,其中腐乳、醬料半成品樣品,第一法(MPN 法) 的檢測結果依據內控標準判定不合格率,分別為8.18%,5.50%;第二法(平板計數法) 檢測結果依據內控標準判定不合格率分別為5.45%,3.50%。第二法(平板計數法) 與第一法(MPN 法) 相比,分別絕對偏低2.75%,2.00%,同比相對偏低33.6%,36.4%;2 種方法的檢測結果偏差比較大,第二法(平板計數法) 檢測量明顯低于第一法(MPN 法) 的檢出量。
員工手部、工作服抽樣品,第一法的檢測結果依據內控標準判定不合格率為10.0%,第二法(平板計數法) 的檢測結果依據內控標準判定不合格率為9.3%,第二法(平板計數法) 與第一法(MPN 法)相比,絕對偏低0.7%,同比相對偏低7%;2 種方法的檢測結果偏差不明顯。
2.2.2 原因分析
(1) 樣品的差異性- 細胞破損程度。腐乳、調味醬樣品中存在的鹽分、香辛料、防腐劑等抑菌物質會使微生物生長受到抑制,導致微生物代謝緩慢、代謝速率不一致。同時,調味醬樣品中存在的油脂會包埋微生物,影響生長。該類產品經歷了物理打磨、加熱等生產加工破壞,部分細胞處于受損狀態(tài),活性不足。需要在修復受損細胞后方能進入對數生長期進行繁殖生長。
設備、容器工器具表面、手部表面取樣,通過涂抹、擦拭或沖洗取得的樣品中,含量微生物大多處于完好活躍狀態(tài),在適宜條件下能夠快速進入對數生長期進行繁殖,在檢測過程中顯化出來。
(2) 檢測方法差異性。第一法(MPN 法) 中,初發(fā)酵試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白豚肉湯(LST) 中含有磷酸氫二甲和磷酸二氫鉀是較好的緩沖劑,能夠較好維持LST 肉湯的PH 處于相對穩(wěn)定狀態(tài),更適合大腸菌群生長[3]。第一法(MPN 法) 的初發(fā)酵時間是24~48 h,相對延長的初發(fā)酵時間,可使受損的細胞得到較為充分的恢復時間。因為加工食品大多經過磨碎、高溫或冷凍等處理,大部分細菌的細胞處于受損狀態(tài),細胞修復恢復活性需要時間較長,延長到48 h,可以使細胞得到較為充分的恢復時間,進入對數生長期后積累一定的量,使檢測結果顯化出來,從而使初發(fā)酵管呈陽性,降低漏檢幾率。
第二法(平板計數法) 中,在結晶紫中性紅膽鹽瓊脂的培養(yǎng)時間為18~24 h,此過程中,部分受損的細胞尚未修復完畢進入對數生長期[4]。沒有充足的時間在平板上形成菌落形態(tài),檢測操作時覆蓋的瓊脂厚薄程度存在差異,也會造成菌落呈現的不一致性,存在一定數量的漏檢菌落群,因此結果偏低[5]。
(1) 對于經過破壞性生產加工的樣品,使用第一法(MPN 法) 檢測的檢出量要平均高于第二法(平板計數法) 的檢出量。第一法(MPN 法) 的檢測靈敏性更高一些。
(2) 對于一般性表面擦拭抽取樣品,如設備、容器工器具表面、手部表面取樣等,第一法(MPN法) 和第二法(平板計數法) 的檢測量水平基本一致,無明顯差異性。2 種方法檢測靈敏性無明顯差異性。
在方法優(yōu)劣性對比,第一法(MPN 法),優(yōu)點:檢測靈敏度高,準確性更強,檢測操作過程相對比較簡便,對人員操作技能要求相對較低;缺點:耗時長,需要72~96 h。第二法(平板計數法)[6],優(yōu)點:耗時短,需要48~72 h;缺點:相對第一法的靈敏度要略低,檢測操作步驟多,操作比較繁瑣,對平板典型菌落的判定和計數需要較高的認知能力,對檢測人員技能要求高,檢測成本高。
在方法選擇上,可以按照如下原則選擇:
(1) 對于生產過程半成品及終產品等經歷破壞性加工的樣品,可優(yōu)先選擇第一法(MPN 法) 進行檢測,以確保檢測結果接近的真實水平的符合度。
(2) 對于一般性表面擦拭抽取樣品,如設備、容器工器具表面、手部表面取樣等,第一法(MPN法) 和第二法的檢測量水平基本一致,無明顯差異性。試驗室可根據自身的試劑、儀器及交期要求自由選擇檢測方法。
(3) 對于部分樣本目標菌含量較高,需要盡快了解樣本目標菌群大致含量的,可采用第二法(平板計數法) 進行檢測,通過平板上的典型菌落,做出大致性的初步結果報告,然后復發(fā)酵進一步長期驗證試驗。
建立在選取的2 種典型樣本類型基礎上做的分析結論,作為指導性的建議,并無絕對的要求,各實驗室需要綜合根據試驗條件、檢驗交期、成本控制、人員技能等方面進行綜合判斷,選擇檢測方法。