聯(lián)合代謝產(chǎn)物和重要農(nóng)藝性狀鑒定不同雪茄煙品系

李雪山 黃德文 呂芳 周會(huì)娜 李洋洋 任云見 豆長輝 晏劍 寧揚(yáng) 戴培剛 張興偉

摘 ?要：基于代謝組學(xué)技術(shù)，篩選與優(yōu)良感官質(zhì)量相關(guān)代謝物豐富、具有優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)潛力的雪茄煙品系。以7個(gè)不同雪茄煙品系為材料，在湖南桂東調(diào)查了其田間農(nóng)藝性狀，分析了其代謝物組成及其積累差異。結(jié)果表明，QX104和QX106在農(nóng)藝性狀上優(yōu)于其他5個(gè)品系，葉長、葉寬和可采葉片數(shù)優(yōu)勢明顯，更符合高產(chǎn)的種植目的，在代謝物積累水平上也與其他品系存在顯著差異。在定性檢測到的183種代謝物中，與其他品系相比，QX104有36%的代謝物上調(diào)，QX106有24%的代謝物上調(diào)，上調(diào)的代謝物主要包括有機(jī)酸、醇類、酮類、糖類等物質(zhì)，有助于提升煙葉感官質(zhì)量。研究表明QX104和QX106農(nóng)藝性狀優(yōu)良，與優(yōu)良感官質(zhì)量相關(guān)的代謝物質(zhì)豐富，為湖南煙區(qū)具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)前景的雪茄煙品系。

關(guān)鍵詞：雪茄煙；代謝組學(xué)；農(nóng)藝性狀；差異代謝物；通路分析

中圖分類號：TS424?????????????????????????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ????????????????????文章編號：1007-5119（2023）05-0094-09

Identification of Different Cigar Lines?by Combined Analysis of?Metabolites and Important Agronomic Traits

LI Xueshan， HUANG Dewen， LYU?Fang， ZHOU Huina， LI Yangyang， REN YunJian， DOU ChangHui，

YAN Jian， NING Yang， DAI Peigang， ZHANG Xingwei

（1. Institute of Tobacco Research of CAAS， Qingdao 266101， China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China; 3. Guidong Branch， Hunan Tobacco Company of CNTC， Chenzhou， Hunan 423500， China; 4. Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC， Zhengzhou 450001， China; 5 Hunan Tobacco Research Institute， Changsha 410004， China; 6. Pengshui Branch， Chongqing Tobacco Company of CNTC，?Chongqing 409600， China）

?Based on metabolomics technology， cigar lines with high quality and high yield potential with rich metabolites related to good sensory quality were screened. The field agronomic characteristics of 7 cigar lines were investigated in Guidong， Hunan Province， and the differences of metabolic product?composition and accumulation were analyzed.?The results showed that QX104 and QX106 were superior to the other five lines?in agronomic traits， with obvious advantages in leaf length， leaf width and number of available leaves， which were more in line with the planting purpose of high yield， and there were significant differences in metabolite accumulation levesl with other lines.?Among the 183 metabolites qualitatively detected， 36% of the metabolites in QX104 and 24% in QX106 were up-regulated compared with the other lines. All the up-regulated metabolites were helpful in?improving?the smoking quality of tobacco leaves. The results showed that QX104 and QX106 had excellent agronomic properties and abundant organic acids， alcohols， and carbohydrate metabolites. They were cigar lines with high yield and high-quality production prospects in Hunan tobacco areas.

cigar; metabolomics; agronomic traits; differential metabolite; path analysis

基金項(xiàng)目：中國煙草總公司重大科技項(xiàng)目[110202101011（XJ-03）]；湖南省煙草公司郴州市公司項(xiàng)目（2021431027240001）；湖南省煙草公司項(xiàng)

目（HN2022KJ15）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC01）；山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ZR2022MC145）

作者簡介：李雪山（1998-），碩士研究生，研究方向?yàn)檠┣褵熯z傳育種。E-mail：82101215174@caas.cn

*通信作者。E-mail：戴培剛，daipeigang@caas.cn；張興偉，zhangxingwei@caas.cn

收稿日期：2023-05-06????????????????修回日期：2023-09-19

雪茄是一種全部用煙葉卷成的煙草產(chǎn)品。國內(nèi)雪茄煙市場不斷擴(kuò)大，雪茄消費(fèi)正從少數(shù)人群逐漸向大眾群體延伸。培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)且符合國內(nèi)生態(tài)環(huán)境的雪茄煙新品種，是解決雪茄生產(chǎn)水平不足的重要方式，也是國產(chǎn)雪茄煙高質(zhì)量發(fā)展的必由之路。由于受氣候、土壤、地形和種植經(jīng)驗(yàn)的影響，只有少數(shù)國家少數(shù)地區(qū)才能生產(chǎn)出高品質(zhì)的雪茄煙葉。湖南桂東與古巴氣候相似，具有生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雪茄的潛力，可作為發(fā)展雪茄生產(chǎn)的區(qū)域之一。

植物代謝組學(xué)是對植物特定組織中整體代謝水平的檢測，具有整體性、高通量和無偏向性等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物科研領(lǐng)域。鄭慶霞等對煙葉進(jìn)行了代謝水平的檢測并開發(fā)了一系列煙草代謝組檢測和分析方法。李楠芬等、楊榮洲對雪茄煙進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)檢測分析，探究了不同雪茄煙品種代謝物差異及其對雪茄煙質(zhì)量的重要性。然而，目前雪茄煙品種選育未能與代謝組學(xué)深入結(jié)合，通過代謝組學(xué)技術(shù)研究雪茄煙代謝產(chǎn)物積累水平，并結(jié)合重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行品系鑒定和品種選育的報(bào)道較為鮮見。本研究以7個(gè)雪茄煙品系QX103、QX104、QX105、QX106、QX107、QX205、QX208為試驗(yàn)材料，在湖南桂東地區(qū)種植，依據(jù)農(nóng)藝性狀和代謝物進(jìn)行聚類分析，以期篩選出農(nóng)藝性狀好、內(nèi)含代謝物豐富的雪茄煙品系，推動(dòng)雪茄煙育種從表型深入到微觀，為優(yōu)質(zhì)品種篩選提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1??供試材料

7個(gè)來源于國家煙草種質(zhì)資源中期庫的不同雪茄煙品系（表1），于2022年種植于湖南省郴州市桂東縣普樂鎮(zhèn)堡下村。土壤主要理化性狀：pH 4.94，含速效磷92.90 mg/kg、速效鉀106.33 mg/kg、水解氮175.81 mg/kg、有機(jī)質(zhì)25.30 g/kg、氯離子33.72 mg/g、有效硫12.27 mg/kg、全硫867.14 mg/kg。

1.2??試驗(yàn)設(shè)計(jì)

隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每個(gè)品系每個(gè)重復(fù)種植面積200 m，行距110 cm，株距40 cm，茄衣用肥：餅肥1500 kg/hm、碳基肥4500 kg/hm、硝酸鉀330 kg/hm、硝酸鈣450 kg/hm、硝酸鎂300 kg/hm、硫酸鉀600 kg/hm、硼砂15 kg/hm。

1.3 ?試驗(yàn)方法

1.3.1 ?農(nóng)藝性狀調(diào)查 ?在各品系中心花開放期，按照《煙草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查，包括葉長、葉寬、葉片數(shù)、葉片厚度、株高、莖圍、節(jié)距、支脈粗細(xì)、主脈粗細(xì)、支脈數(shù)、主側(cè)脈夾角和莖葉夾角。

1.3.2 ?樣品采集??7個(gè)雪茄煙品系中部葉片采收后在晾房內(nèi)采用“五段式”晾制工藝進(jìn)行晾制。晾制后，每個(gè)品系采集大小、色澤、成熟度一致的中部葉片15～20片，置于40 ℃烘箱中烘干3 h，每2～3片葉片去除主側(cè)脈后混為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，獨(dú)立粉碎研磨后置于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩７謩e利用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-SPME-GC-MS）和柱前衍生化GC-MS技術(shù)對揮發(fā)性和半揮發(fā)性代謝物進(jìn)行檢測。

其中衍生化GC-MS測定設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，不均勻稱取每個(gè)樣本進(jìn)行混合，制成QC樣本。頂空固相微萃取GC-MS測定設(shè)置2個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3 ?煙葉代謝物提取??（1）半揮發(fā)性代謝物提取。取煙葉粉末20 mg于2?mL離心管中，加入1.5?mL由異丙醇、乙腈和水3∶3∶1混合制成的萃取溶劑，冰浴超聲1 h；室溫下14 000 r/min離心10 min；取500 μL上清液至2 mL錐形玻璃進(jìn)樣瓶中，真空濃縮干燥約4 h；加入100?μL的20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液，37?℃?200 r/min下孵育90 min；加入100?μL硅烷化試劑BSTFA，60?℃?200 r/min搖床硅烷化60 min。

（2）揮發(fā)性代謝物測定中直接稱取1 g煙葉粉末置于頂空-固相微萃取裝置的進(jìn)樣瓶后進(jìn)行萃取和檢測。

1.3.4 ?GC-MS檢測 ?使用Agilent7890/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），色譜條件參考ZHAO等，色譜柱為DB-5MS柱（0.25 μm，0.25 mm×30 m）；載氣為氦氣；柱流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度300 ℃；進(jìn)樣體積1 μL；分流比10∶1；檢測器電壓保持在1.2 kV，選擇電子沖擊（EI）模式以實(shí)現(xiàn)70 eV的電離。質(zhì)譜條件為：離子源為正EI源；離子源溫度230 ℃；采集類型為SIM和掃描模式；掃描起點(diǎn)質(zhì)量33.00 /，掃描終點(diǎn)質(zhì)量600.00 /。每檢測6個(gè)樣品插入一個(gè)QC。

1.4 ?數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)采用Excel方法進(jìn)行分析。

參考鄭慶霞等的方法對代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。使用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對代謝物進(jìn)行定性分析，對80%樣品中均存在的特征峰進(jìn)行提取，并確定代謝物種類。

利用SIMCA14軟件對代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA），對數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別，考察各組樣品代謝物的分離情況。在PCA分析的基礎(chǔ)上，采用偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），再根據(jù)其分組貢獻(xiàn)值（VIP）和組間變化（），以VIP≥1，＞1.5或＜0.67的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物。利用TBtools（v1.082）進(jìn)行熱圖（Heat Map）繪制，MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行相關(guān)通路分析。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?各雪茄煙品系農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果

對農(nóng)藝性狀進(jìn)行方差分析（表2）并依據(jù)農(nóng)藝性狀數(shù)值進(jìn)行聚類熱圖繪制（圖1）。結(jié)果表明，7個(gè)雪茄煙品系中，QX104和QX106聚為一類；QX107、QX208、QX103聚為一類，QX105和QX205聚為一類。QX106的株高、莖圍、可采葉片數(shù)、葉長、葉寬、主側(cè)脈夾角以及葉長支脈比等農(nóng)藝性狀數(shù)值顯著高于其他品系，且葉片最薄、支脈最細(xì)，莖葉夾角適中。QX104在株高、莖圍、葉長、葉寬、葉長支脈比等農(nóng)藝性狀上與QX106以外的品系相比存在顯著差異。兩個(gè)品系在各重要農(nóng)藝性狀上，均優(yōu)于對照品系QX103。

2.2 ?雪茄煙各品系半揮發(fā)性謝物檢測及聚類分析

通過衍生化GC-MS技術(shù)對7個(gè)品系雪茄煙半揮發(fā)性代謝物進(jìn)行定性檢測，共獲得128種代謝物，其中包括41種有機(jī)酸、25種糖類、20種醇類、11種氨基酸類、8種酰胺類、4種酯類、3種酮類以及16種其他類型代謝物。對所有樣本的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析（圖2），QX103、QX107、QX205、QX208、QX105五個(gè)品系雪茄煙在PCA得分圖上呈現(xiàn)一定程度的聚集；而QX104和QX106在PCA得分圖上的位置與其他5個(gè)品系雪茄煙存在一定的位置差異，尤其是QX104的3次重復(fù)明顯與其他品系分散，單獨(dú)聚為一類。

2.3 ?雪茄煙各品系揮發(fā)性代謝物檢測及聚類分析

通過頂空固相微萃取GC-MS技術(shù)對7個(gè)雪茄煙品系易揮發(fā)代謝物進(jìn)行定性檢測，共獲得55種代謝物，其中包括12種酮類、9種烷烴類、7種醇類、6種酯類、5種有機(jī)酸、3種醛類、2種酰胺類、1種醚類以及10種其他類型代謝物。由圖3可知，QX103、QX107、QX205、QX208、QX105五個(gè)雪茄煙品系在PCA得分圖上同樣呈現(xiàn)一定程度的聚集。而QX104和QX106在PCA得分圖上的位置與其他5個(gè)品系雪茄煙同樣存在一定的位置差異，其中QX104的兩次重復(fù)與其他品系存在明顯的分離趨勢。

2.4??QX104和QX106與其他品系的差異代謝物

將柱前衍生化GC-MS和頂空固相微萃取GC-MS代謝物數(shù)據(jù)匯總得到182種代謝物，根據(jù)PLS-DA的VIP和值篩選QX104和QX106與其他5個(gè)品系的差異代謝物。PLS-DA可視化結(jié)果顯示（圖4），QX104和QX106與其他5個(gè)品系雪茄煙在代謝物組成上存在明顯差別，可進(jìn)一步對其進(jìn)行差異代謝物篩選，并分析差異代謝物的類型和功能。

由于QX104和QX106不僅與其他品系在代謝物積累上存在差異，同時(shí)二者相互之間也存在差異，故先將二者分別與其他5個(gè)雪茄煙品系比對，篩選差異代謝物，再綜合二者重合部分來進(jìn)行后續(xù)分析。

2.4.1 ?QX104與其他品系的代謝物差異 ?如圖5及表3所示，QX104與其他5個(gè)品系雪茄煙相比，總共有79種差異代謝物。其中包括19種有機(jī)酸、17種醇類、8種酮類、5種烷烴類、5種烯烴類、4種氨基酸類、4種糖類、4種酰胺類、3種酯類、1種醛類、以及9種其他類型代謝物。其中與感官質(zhì)量相關(guān)的代謝物差異情況如表3所示。

2.4.2 ?QX106與其他品系的代謝物差異 ?如表4及圖6所示，QX106與其他5個(gè)雪茄煙品系相比，總共有57種差異代謝物，包括16種有機(jī)酸、11種糖

類、7種醇類、6種酮類、3種酰胺類、3種烷烴類、2種醛類、2種氨基酸類、1種烯烴類以及6種其他類型代謝物。其中與煙草感官質(zhì)量相關(guān)的部分代謝物差異情況如表4所示。

2.4.3??QX104和QX106共有的差異代謝物 ?以VIP≥1，＞1.5或＜0.67的代謝物含量差異倍數(shù)關(guān)系為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異代謝物。QX104和QX106與其他5個(gè)雪茄煙品系相比，共有15種相同的差異代謝物（表5）。其中2-環(huán)己烯-1-酮下調(diào)，其余14種上調(diào)。

2.5??差異代謝物代謝通路分析

為進(jìn)一步了解差異代謝物相關(guān)代謝途徑的變化，將QX104和QX106的共同差異代謝物映射到MetaboAnalyst 5.0的KEGG數(shù)據(jù)庫中。如圖7所示，主要富集到前25%代謝通路為丙酮酸代謝通路、糖酵解/糖新生通路、半乳糖代謝通路、乙醛酸和二羧酸代謝通路、不飽和脂肪酸的生物合成途徑。其中丙酮酸代謝通路值為0.042 4，品系間差異顯著。

3 ?討 ?論

糖類物質(zhì)是煙草中含量和種類最為豐富的香氣前體物質(zhì)，在煙草香氣品質(zhì)形成過程中發(fā)揮著重要作用。酮類物質(zhì)具有顯著致香作用，可以使煙葉具有不同香氣特征。煙葉中含有豐富氨基化合物，會(huì)發(fā)生一系列美拉德反應(yīng)，對煙葉品質(zhì)產(chǎn)生顯著影響，氨基酸含量的高低直接影響到煙的味道和煙氣的豐滿度。醇類物質(zhì)是植物生長的調(diào)節(jié)劑以及煙草香氣物質(zhì)的前體物。與其他5個(gè)品系相比，在定性檢測到的183種代謝物中，QX104總共有79種差異代謝物，其中65種上調(diào)，上調(diào)比例82%，上調(diào)代謝物中主要有17種醇類、9種酮類；QX106

總共有57種差異代謝物，其中44種上調(diào)，上調(diào)占比為77%，上調(diào)代謝組主要包括11種糖類、8種醇類。兩品系在醇類、糖類和酮類代謝物上更為富集。在14種共同上調(diào)代謝物中，鼠李糖主要對香氣質(zhì)、余味和總分指標(biāo)有較大影響；1-戊醇是一種香料成分，在工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用；酮類物質(zhì)作為一種香薰物質(zhì)，被認(rèn)為是許多植物中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物；由于其吸引人的感官特性受到工業(yè)的高度認(rèn)可；咖啡酸及其衍生物可以使植物具有較強(qiáng)的抗菌特性，已被大量當(dāng)作抗菌劑使用。上調(diào)代謝物使得2個(gè)品種更加具有提升雪茄感官質(zhì)量的基礎(chǔ)條件。

煙葉種植的目的是收獲煙草葉片，葉面積和葉片數(shù)是構(gòu)成煙草產(chǎn)量最直接的性狀，與煙農(nóng)經(jīng)濟(jì)收入直接相關(guān)。QX104和QX106在重點(diǎn)關(guān)注的與收獲指標(biāo)相關(guān)的農(nóng)藝性狀上，與對照品系QX103及其他品系相比均具有明顯優(yōu)勢，其中QX106具有24.4片可采葉片數(shù)，葉長和葉寬分別為61.13 cm和38.8 cm，均顯著高于其他品系，具有最大的收獲潛力。從農(nóng)藝性狀角度出發(fā)，QX104和QX106符合高產(chǎn)的種植目的，具有擴(kuò)大種植的價(jià)值。

4 ?結(jié) ?論

湖南桂東的7個(gè)不同雪茄煙品系中，QX104和QX106在重要農(nóng)藝性狀上顯著優(yōu)于其他5個(gè)品系；與優(yōu)良感官質(zhì)量相關(guān)的代謝物積累更為豐富，含量明顯上調(diào)，具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的潛力。

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