韓佳雯 蘇婷婷 徐元兵 綜述 胡超華 審校

目前，隨著乳腺癌的發(fā)病率在全球范圍內不斷增加，已成為全世界女性癌癥死亡的主要相關因素之一[1]。其中三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）均不表達的一種乳腺癌亞型，由于暫無明確的分子靶點治療，化療是其主要的治療方式[2]。TNBC是乳腺癌中極具侵襲性的一種類型，占浸潤性乳腺癌的10%～20%[3]，通常治療選擇有限且復發(fā)率高，較其他亞型乳腺癌預后差[4]。近年來，越來越多學者關注到腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）在腫瘤免疫抑制、遠處轉移、局部耐藥和靶向治療反應中的重要作用[5]。而腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs ）作為TME 的重要組成部分，尤其在HER-2 陽性和TNBC 中高度表達。有研究對國內360 例TNBC 患者的腫瘤樣本分析發(fā)現，TNBC進一步細分為管腔雄激素受體（luminal androgen receptor，LAR）為23%、免疫調節(jié)型（immunomodulatory，IM）為24%、基底樣免疫抑制型（basal-like immunosuppressed，BLIS）為39% 和間充質型（mesenchymal，MES）為15%4種不同的亞型[6]。該研究進一步提出將TNBC 進行“分型而治”，通過分析465 例原發(fā)性TNBC 發(fā)現TNBC 中IM 亞型的TILs 比例明顯高于其他亞型，預后較其他亞型更好，認為“分型而治”具有重要臨床意義。因TNBC 復發(fā)轉移的風險較高，且缺乏靶向治療的作用靶點，使TNBC 患者的治療方案相對局限，缺乏有效預測療效及預后的分子標志物。本文主要針對TILs 作為生物標志物，對TNBC 的新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）療效及預后的預測價值進行闡述。

1 腫瘤浸潤淋巴細胞

癌癥是一種基因組疾病，由于基因組的不穩(wěn)定性，許多點突變在腫瘤進展過程中積累,從而導致基因組和表觀遺傳學產生表型變異[7]，引起免疫系統(tǒng)識別產生非自身抗原并引發(fā)細胞免疫反應[8]。正常機體由于免疫監(jiān)視功能可以識別并清除 TME 中的異常增殖細胞，有助于調節(jié)腫瘤的進展[9]。TME 主要由腫瘤細胞、TILs，如巨噬細胞、淋巴細胞、自然殺傷細胞等，腫瘤相關基質細胞[腫瘤相關的成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）]、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）以及多種信號分子等相互作用共同構成[10]。有研究表明，TILs 可能影響TME 中的組成成分改變，進而促進或抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11]。2014 年，國際免疫腫瘤生物標記物工作組對TILs 定義/檢測方法及判讀標準進行了詳細描述，TILs 分類及作用在不同類型的癌癥類型中，各種細胞的組成部分和作用機制存在較大差異性（圖1）[12]。TME 可大致分為免疫微環(huán)境和非免疫微環(huán)境，以免疫微環(huán)境為主，其中的免疫微環(huán)境主要由TILs 構成，并根據其在TME 中分布位置的位置不同，將TILs 進一步分為間質腫瘤浸潤淋巴細胞（stromal tumor-infiltrating lymphocytes，sTILs）和瘤內腫瘤浸潤淋巴細胞（intratumoral tumor-infiltrating lymphocytes，iTILs）[13]。其中大部分TME 中TILs以sTILs 為主，大多數sTILs 分布于浸潤性腫瘤細胞附近，常被認為是真正的TILs。有研究表明，在乳腺癌TILs 檢測中，75% 以T 淋巴細胞為主，20% 為B淋巴細胞，5%左右為其他類型細胞[14]。有研究進一步表明，在不同分子亞型中TNBC 的腫瘤浸潤免疫細胞檢出比例較高[15]。

圖1 腫瘤浸潤淋巴細胞分類及作用[12]

目前，TILs 檢測方法主要通過病理檢查中標準的蘇木精和曙紅（haemotoxylin and eosin，H&E）染色或免疫組織化學法染色。近年來，細胞流式技術、組織芯片或組織微陣列技術（tissue microarray，TMA）、多重熒光免疫組織化學（multiplex immunohistochemistry，mlHC）及單細胞DNA 測序等技術均可用于TILs 的分類和計數。目前，常用免疫組織化學法或熒光染色法檢測腫瘤組織中的TILs，不僅易于重復檢測，而且價格低廉，被廣泛應用于臨床實踐中TILs[16]。在2016 年生物標記物工作組指南中，建議使用sTILs 的百分比來評估TILs 的表達水平，而不是對所有的TILs 進行評估[17]。TILs 評估主要集中于sTILs 與iTILs 有效的檢測，iTILs 檢測是目前研究的熱點之一。乳腺癌中iTILs 檢測的難點主要包括下述幾個方面：樣本取材難度大，乳腺癌組織通常表現為不規(guī)則、碎片化的形態(tài)，取材難度較大，需要高質量、完整的組織樣本才能得到可靠的iTILs 檢測結果。對于iTILs 檢測的評估標準尚未統(tǒng)一，包括可見度、計數方法、評估指標等均存在差異，導致iTILs 結果的可靠性和可比性有待進一步提高，目前大部分研究集中于便于檢測的sTILs。

2 TNBC 的NAC 新輔助化療的預測評估體系

由于TNBC 作為無特定的分子治療靶點的乳腺癌亞型，NAC 常為TNBC 標準治療，使腫瘤降期保乳、因并發(fā)癥不可手術患者在接受NAC 后可行手術治療，以及根據患者對化療藥物的敏感性對改變治療策略等起著重要作用。病理完全緩解（pathologic complete response，pCR）是NAC 療效評估的常見有效方法。有研究通過Meta 分析表明，達到 pCR 的乳腺癌患者的生存結局顯著改善，且達到pCR 的患者比未達到pCR 患者的無事件生存期（event-free survival，EFS）和總體生存期（overall survival，OS）明顯延長。因而手術中達到pCR 通常被認為是長期生存的替代指標[18]。盡管如此，有研究表明，提高pCR 率并不一定能改善預后[19]，仍有少部分達到pCR 的患者發(fā)生遠處轉移[20]?；颊咭蛐蠳AC 2 個周期內的治療療效未知，對于化療藥物敏感性低的患者可以更改治療方案，從而避免無效治療產生的不良反應[21]。該研究還發(fā)現，若通過評估患者對NAC 療效不佳，對NAC 療效的早期評估預測可避免患者錯過最佳手術時期。因此，NAC 療效及預后的預測需要更全面的分析。

目前，臨床上對TNBC 新輔助療效的預測手段有多種手段，主要集中在影像學、分子病理學及組學等。影像學中常用的乳房超聲檢查、乳房數字乳腺X 光攝影（digital mammography，DM）/數字乳腺斷層合成（digital breast tomosynthesis，DBT）均具有一定的預測價值；集成正電子發(fā)射斷層掃描-計算機斷層掃描（positron emission tomography computed tomography，PET-CT），以及最新的混合集成正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）/磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）掃描儀均具有一定的預測價值；其中MRI 通常在影像學評估中具有更加客觀準確的價值[22]。分子生物標記物主要集中于TILs 檢測、Ki-67 高表達、PD-L1 表達。組學主要集中于BRCA 基因、ITPKC 基因、DNA 甲基化、循環(huán)腫瘤DNA 的探索研究，每一種評估模式均具有相應的優(yōu)缺點。

3 TILs 在TNBC 的NAC 預測價值

近年來，關于TILs 作為TNBC 的NAC 療效預測的分子標記物開展了大量探索性研究。Denkert 等[23]首次報道了TILs 可作為乳腺癌NAC 反應的獨立預測因子，TILs 表達水平與新輔助治療pCR 率密切相關。TILs 高表達的乳腺癌患者，pCR 率維持在40%～42%。然而，該研究TILs 無表達的患者pCR率分別為3%～7%。結果表明，sTILs 表達水平與乳腺癌患者pCR 率密切相關。Ono 等[24]研究顯示，180例行NAC 乳腺癌患者同樣證實了TILs 的表達水平，在TNBC 對NAC 預后預測發(fā)揮重要作用，TNBC 達到pCR 的發(fā)生率（32%）較HER-2 陽性乳腺癌（21%）和HR 陽性/HER-2 陰性乳腺癌（7%）pCR 的發(fā)生率高于其他亞型乳腺癌。且在TNBC 患者中接受NAC 后，TILs 呈高表達水平的患者有近37% 達到pCR，而TILs 呈低表達水平的患者有近16% 達到pCR。Adams 等[25]通過對481 例TNBC 患者NAC 進行評估，發(fā)現大多數乳腺癌腫瘤組織中TILs 能正常表達，其中sTILs 表達水平與預后呈正相關。sTILs 作為連續(xù)變量與TNBC 的預后更好相關。該研究提示sTILs 表達水平每增加10%，腫瘤遠處復發(fā)風險降低18%（P=0.04），患者死亡風險降低19%（P=0.01）。

Denkert 等[26]對TNBC、HER-2 過表達型乳腺癌以及激素受體陽性乳腺癌的TILs 表達研究。在TNBC 患者中，260 例TILs 表達水平較低的患者中有80 例（31%）達到pCR，373 例TILs 患者中有117 例（31%）達到pCR，而TILs 表達水平較高的273 例患者中有136 例（50%）達到pCR。該研究結果表明，TILs表達水平高低與TNBC 患者NAC 的pCR 密切相關。Luen 等[27]探索了TNBC 行NAC 患者殘留病灶TILS 表達水平與殘留癌癥負擔（residual cancer burden，RCB）的關系，發(fā)現將NAC 后的RCB 的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3 類比率分別為11%、50%和39%。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3 類的3 年無復發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）分別為86%（95%CI：76～98）、67%（95%CI：60～74）和26%（95%CI：20～34）。且RD TILs 水平與CD8+T 細胞密度之間呈正相關（P=0.41）。RD 中高表達水平的TILs 與RFS 顯著相關（HR=0.86，95%CI：0.79～0.92，P＜0.001）；高表達水平的TILs與較長 的OS 率（HR=0.87，95%CI ：0.80～0.94，P＜0.001）具有顯著性相關。Bai 等[28]進一步對TNBC 患者NAC 后殘留病灶進行TILs 細胞種類進行分類比較，指出高CD4+TILs 和高CD8+TILs與無病生存期（disease-free survival，DFS）具有顯著性相關。74例TNBC 患者在NAC 后24 例達到pCR，達到pCR率為32.4%。進一步的分析表明，CD4+/CD20+比值＞1 或CD8+/ CD20+比值＞1 是獨立預后因子，殘留腫瘤（residual tumor，RT）的TILs 亞型是NAC 后TNBC 患者生存的潛在預測生物標志物。Lee 等[29]通過比較基線腫瘤標本組織和NAC 手術后標本組織TILs 表達水平的差異性，在TNBC 接受NAC 后43例（41.3%）TILs 呈低表達低,而29 例（27.9%）呈TILs 水平高表達，而32 例（30.8%）未見明顯變化。進一步探討出TILs 表達水平連續(xù)性變化與患者的DFS相關。此外有研究證實，TNBC 患者腫瘤組織中sTILs 的表達水平與NAC 的療效及預后有關，sTILs高表達患者的治療效果和預后較低表達患者更好[30]。

4 TILs 對TNBC 的預后價值

研究表明，TILs 作為NAC 療效預測的有效生物標志物，其對TNBC 的預后值得關注。大型臨床試驗數據表明，TILs 可作為乳腺癌患者NAC 的預后預測生物標志物，尤其是在TNBC 乳腺癌中，TILs 水平升高與RFS 之間存在強線性關系[31]。TILs 可分為T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、NK 細胞等，并以T 淋巴細胞為主[32]。在TILs 中T 細胞可根據其T 細胞受體（T cell receptor，TCR）亞基以及核心系標記CD8 和CD4進行大 致分類，T 細胞主 要可分 為TCRγδ+、TCRαβ+CD4-CD8-雙陰性T 細胞以及TCRαβ+CD4+CD8+雙陽性T 細胞（其中包含CD4highCD8low、CD4highCD8high、CD4medCD8high和CD4lowCD8high）[32]。該研究認為TCRαβCD4+CD8+T 細胞是包括腫瘤組織在內最豐富的T 細胞亞群。CD8+TCRαβT 細胞，簡稱為CD8+T 細胞，有較強的抗病毒和抗腫瘤功能，通常被稱為細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL），CTLs 能夠產生高水平的抗腫瘤細胞因子和細胞毒性分子，如干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、穿孔素和顆粒酶等[33]。因此，通常認為CD8+CTL 表達量與癌癥的預后改善相關[34]。該研究顯示，外周組織駐留記憶（tissue-resident memory T cell，TRM）CTLs 在腫瘤免疫中的作用已成為熱點，在外周組織中的 TRM 細胞表達經典標記CD103，也稱為整合素αE，CD103 通常與整合素β7 復合，形成αEβ7 復合物，這種復合物與腫瘤細胞上表達的E-鈣黏蛋白相互作用。因此，CD103+CTL 與多種實體瘤的生存率提高相關，包括幾種婦科惡性腫瘤、肺癌、乳腺癌、黑色素和幾種頭部腫瘤[35]。B 淋巴細胞在免疫治療中的存在與改善不同癌癥類型的預后有關，B 細胞的促腫瘤作用也已被廣泛應用[36]。有研究發(fā)現，伴隨CD20+B 細胞的CD8+TILs 對預后有利[37]。隨著免疫治療的不斷發(fā)展，近年來中國的乳腺癌免疫治療從分子靶點、藥物研發(fā)到臨床試驗，均取得了突破性的進展。研究表明，TILs 中的細胞亞群具有促腫瘤和抗腫瘤的雙向作用，目前TILs 免疫治療在大多實體瘤中都取得了一定的療效[38]，值得進一步研究。然而，在不同研究中對于TILs 表達水平的差異性與預后的關系存在不同的結論。本文通過查閱近年來關于TILs 與乳腺癌相關文獻進行總結（表1）。提示上述研究結果的原因可能為：樣本取材難度（乳腺癌組織通常表現為不規(guī)則、碎片化的形態(tài)，取材難度較大，需要高質量、完整的組織樣本才能得到可靠的TILs 檢測結果）。TILs 評估標準不統(tǒng)一（對于TILs 檢測的評估標準目前尚未統(tǒng)一，包括可見度、計數方法、評估指標等均存在差異，導致TILs 結果的可靠性和可比性有待進一步提高）。專業(yè)技能要求高（TILs 的檢測需要有具備一定的解剖、病理、免疫學專業(yè)知識和技能的病理醫(yī)師來評估和計數，但目前缺乏一批專業(yè)、規(guī)范的人才隊伍，技能水平和經驗不足，也會影響到TILs 檢測結果的準確性）。檢測結果的批次差異（TILs 檢測通常需要多個批次測試，如不同實驗室、不同測試時間等，由于實驗環(huán)境的不同，不同批次檢測結果會存在波動，如不加以消除會影響到TILs 檢測的準確性）?？傊橄侔┲蠺ILs 檢測的難點較多。針對上述難點，需要進一步完善TILs 檢測方法，建立統(tǒng)一的評估標準，加大專業(yè)技術人才的培養(yǎng)和引進力度，以及進一步采取有效措施，以提高檢測結果的準確性和可靠性。

表1 TILs 與TNBC 的NAC 相關文獻匯總

5 結語與展望

綜上所述，TILs 在TNBC 中提供了重要獨立的預后信息，TILs 作為生物標記物可以對TNBC 的NAC 療效進行有效預測。其中，TILs 以表達CD4+、CD8+TILs 為主，且通常在TNBC 和HER-2 過表達型乳腺癌中呈現高表達；TILs 表達水平越高，對TNBC 患者NAC 療效及預后越好；以及TILs 的連續(xù)性變化可能對TNBC 患者NAC 療效及預后有影響。但有關TILs 病理評估的質控標準有待進一步探討和制訂。此外，臨床前瞻性和回顧性的多中心、大樣本量探討TILs 分型與乳腺癌各亞型的關系相關性研究，為乳腺癌患者的治療提供了更好的預測價值。

本文無影響其科學性與可信度的經濟利益沖突。