陳穎綜述 董衛(wèi)國審校

原發(fā)性肝癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率與病死率居高不下,是全球第6大常見的癌癥,也是癌癥死亡的第3大原因[1]。在我國,原發(fā)性肝癌是第4位常見惡性腫瘤和第2位腫瘤致死病因[2]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最多發(fā)的類型,占比高達75%～85%[1]。HCC的發(fā)病機制復雜、異質(zhì)性大,肝炎病毒感染、酒精或非酒精性脂肪性肝病、黃曲霉毒素、遺傳誘發(fā)因素等均與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關。對于符合特定條件的患者,手術切除是最佳的治療手段,但手術后也伴隨著極大復發(fā)可能。鑒于疾病復雜性及個體差異化,目前臨床推薦多學科參與,制訂個體化的綜合治療方案[3]。

諸多研究表明,三結構域蛋白21(tripartite motif containing protein 21,TRIM21)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡及干燥綜合征等自身免疫性疾病相關,其在特異性與非特異性抗病毒感染中也發(fā)揮了關鍵性作用[4-5]。近年來,TRIM21在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也備受重視。如TRIM21參與諸多惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移過程,包括乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、腎癌等[6-9]?，F(xiàn)階段的研究提示以TRIM21為靶點的治療方式有望在癌癥的臨床實踐中得以應用。近年來,研究發(fā)現(xiàn)TRIM21在HCC中也扮演著復雜且重要的角色,但目前國內(nèi)尚無較全面的描述,故本文對TRIM21在HCC發(fā)生發(fā)展中作用的研究進展進行系統(tǒng)綜述。

1 TRIM21的結構與功能

TRIM21屬于TRIM家族的成員,編碼該蛋白的基因位于11號染色體上,在細胞質(zhì)和細胞核均有表達。TRIM21蛋白氨基端包含TRIM家族蛋白特征保守的RING、B-box和Coiled-coil結構域,其羧基端則為PRYSPRY結構域。RING結構域具有E3泛素連接酶活性[10];B-box(在TRIM21中為1個B-box2)結構域或能調(diào)節(jié)由RING介導的泛素化以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用[11];Coiled-coil結構域參與TRIM21同源二聚體的形成,進而促進RING結構域E3連接酶的底物識別與泛素化過程[12];PRYSPRY結構域能介導蛋白質(zhì)及RNA的各種底物分子的識別[13]。蛋白質(zhì)的泛素化修飾由酶促級聯(lián)反應完成。泛素在ATP依賴性反應中被E1酶激活并在C末端與E1形成硫酯鍵,然后轉(zhuǎn)移到E2酶的半胱氨酸活性位點上形成E2-Ub硫酯中間體。E3連接酶與E2-Ub硫酯和底物結合,催化泛素從E2的活性位點半胱氨酸轉(zhuǎn)移到底物賴氨酸殘基或N末端。RING結構域是真核生物中重要的E3泛素連接酶,泛素化的蛋白接著被引導入蛋白酶體并被降解,從而抑制蛋白的活性[14]。現(xiàn)有研究證實TRIM21發(fā)揮各種功能很大程度上基于其E3泛素連接酶活性。

2 TRIM21在HCC中的表達

2.1 表達增加 有學者在人類蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站中對相關免疫組織化學圖像進行比較,得出人類HCC組織TRIM21的蛋白質(zhì)表達水平高于正常組織的結論[15]。類似的,通過TCGA數(shù)據(jù)庫及人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫分析,結果顯示HCC組織較正常肝組織TRIM21表達升高,差異有統(tǒng)計學意義。與正常人肝細胞系MIHA相比,TRIM21在Hep3B中表達增高[16]。Wang等[17]將49個 HCC 樣本作為病例組,29個癌旁組織和20個肝血管瘤組織的隊列作為對照,進行了TRIM21免疫組織化學染色,發(fā)現(xiàn)TRIM21蛋白水平在HCC組織中明顯高于來自肝血管瘤或癌旁的非惡性肝組織。

2.2 表達減少 相反地,亦有研究通過基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO)中的高通量數(shù)據(jù),得出TRIM21在HCC組織中表達降低的結論[18]。相較正常人肝細胞系MIHA,TRIM21在HepG2、Huh7和SK-Hep-1中mRNA水平降低[16]。Ding 等[18]用免疫組織化學染色的方法檢測了TRIM21在70個肝癌組織樣本(61例HCC和9例膽管細胞癌)和10個非腫瘤性肝組織樣本中的表達,發(fā)現(xiàn)正常肝組織中強陽性或中度陽性樣本的百分比顯著高于腫瘤組織。在人HCC細胞系SMMC7721、Huh7、Bel-7402、PLC、LM3、97L、97H中,TRIM21的蛋白表達低于正常肝細胞系L02。

HCC組織中TRIM21的表達水平是否較正常肝組織升高,不同的研究通過在線數(shù)據(jù)庫分析、肝癌細胞系與臨床樣本收集檢測的方式得出了不同的結論?；跀?shù)據(jù)庫中的分析存在著不同的研究在不同時間節(jié)點選取不同的數(shù)據(jù)庫進行進一步分析的差異。而收集臨床樣本進行檢測的過程中也存在著納入與排除標準不同,收集樣本的數(shù)量、來源、人種、性別、分期等因素的差異。無論是收集到的在線數(shù)據(jù)庫中的樣本或臨床收集樣本都需要樣本具有代表性才能更好地推論TRIM21在HCC總體中表達的變化情況?；A研究中針對肝癌細胞系與正常肝細胞系進行TRIM21表達量的檢測也與細胞系的類型密切相關。

3 TRIM21差異表達與HCC的聯(lián)系

在細胞和動物模型中進行TRIM21表達的敲除或者敲低,所引起的HCC調(diào)節(jié)也存在兩個截然相反的效應。實驗誘導產(chǎn)生的HCC模型中,TRIM21敲除小鼠相較野生型小鼠誘導模型,其肝損傷更嚴重并且產(chǎn)生了更多的癌結節(jié)[19]。實驗性敲低97H及LM3細胞系中TRIM21的表達可增強HCC 細胞的體外侵襲能力;裸鼠尾靜脈注射siTRIM21 LM3細胞可增強其肺轉(zhuǎn)移能力[20]。此外,李濤等[21]通過siRNA干擾肝癌細胞系中TRIM21的表達,發(fā)現(xiàn)TRIM21表達降低可促進細胞的增殖。同樣的,Ding 等[18]研究顯示HepG2和LM3細胞中TRIM21的沉默可促進 HCC 細胞的增殖、集落形成、遷移和癌細胞抗凋亡。相反地,有研究提示小鼠TRIM21敲除可抑制二乙基亞硝胺/苯巴比妥誘導下的HCC發(fā)展[17]。

TRIM21表達水平的高低與HCC疾病進展及預后的關系在不同的研究中也未得到一致的結論。有研究認為TRIM21的mRNA表達水平與HCC的個體癌癥分期和腫瘤惡性程度呈正相關。然而,進一步分析顯示TRIM21的mRNA表達與HCC患者的預后相關性沒有統(tǒng)計學意義[15]。而另有研究指出,TRIM21高表達患者較低表達患者預后更差[16]。另一項研究認為TRIM21的高表達與疾病進展及較差的總生存期呈正相關,但與無病生存期無關[22]。但是,Ding 等[18]的研究分析了GEO數(shù)據(jù)庫的相關數(shù)據(jù),結果提示TRIM21高表達腫瘤比TRIM21低表達腫瘤具有更佳的預后。研究證明抑制代償性NRF2升高可增強雙硫侖/Cu誘導的鐵死亡對 HCC細胞的攻擊,從而促進雙硫侖/Cu和索拉非尼協(xié)同作用的細胞毒性[22]。Nrf2還受到Quiescin巰基氧化酶1抑制,協(xié)同增強索拉非尼誘導的鐵死亡[23]。在HepG2細胞系中的研究表明,P62表達水平的上調(diào)與肝癌細胞對索拉非尼的敏感性降低有關[24]。由此猜測,TRIM21對P62-Keap1-Nrf2途徑的抑制作用可能增強索拉非尼治療的敏感性。此外,明確HCC中TRIM21差異表達有助于TRIM21在HCC診斷中的應用。Wang等[17]比較了TRIM21與臨床常用的HCC生物標志物甲胎蛋白的診斷能力,發(fā)現(xiàn)在受試者工作特征曲線中,TRIM21的曲線下面積(AUC=0.798)高于甲胎蛋白(AUC=0.756)。有趣的是,TRIM21基因多態(tài)性也與HCC相關,并可用于評估HCC患者的遠處轉(zhuǎn)移。Lee等[25]分析了來自1 196例正常對照組和394例HCC患者的TRIM21基因的兩個單核苷酸多態(tài)性:rs4144331和re915956,發(fā)現(xiàn)擁有TRIM21 rs915956 A等位基因的年輕患者(<65歲)和有吸煙史且攜帶rs4144331的T等位基因的患者患HCC的風險均增加。

TRIM21參與 HCC 發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié),明確TRIM21在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機制對HCC臨床診斷、治療、預后判斷有潛在的價值,甚至可發(fā)現(xiàn)HCC治療的新靶點,進而補充現(xiàn)有治療方案。

4 TRIM21在HCC中的作用機制

4.1 p62-Keap1-Nrf2途徑 有研究報道TRIM21利用其泛素E3連接酶活性調(diào)節(jié)p62-Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch like-ECH-associated protein 1,Keap1)-核因子紅系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)途徑,從而促進HCC發(fā)生。體內(nèi)外實驗均證明TRIM21敲除可防止氧化性肝損傷從而減少HCC的發(fā)生發(fā)展[17]。

Nrf2在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)以適應性地響應外源化合物和氧化應激中占據(jù)著重要的角色[26]。處于穩(wěn)態(tài)時,Keap1與細胞質(zhì)中的Nrf2相互作用并促進Keap1依賴的泛素化,繼而使Nrf2在蛋白酶體中被降解而維持在較低水平,即Keap1是Nrf2的負調(diào)節(jié)因子。在氧化應激情況下,Keap1對Nrf2的抑制作用主要受到經(jīng)典與非經(jīng)典途徑的負調(diào)控,Nrf2較穩(wěn)態(tài)時表達增加[27]。(1)經(jīng)典途徑:Keap1的半胱氨酸殘基被氧化并誘導其構象變化,這種蛋白修飾阻止Keap1對Nrf2的泛素化,更多的Nrf2轉(zhuǎn)移到細胞核中。(2)非經(jīng)典途徑:SQSTM1/p62(簡稱p62)具有ETGE基序的蛋白質(zhì),磷酸化的p62與Keap1親和力增高,競爭Keap1-Nrf2結合,從而阻斷Keap1依賴的Nrf2泛素化。Nrf2正調(diào)節(jié)p62基因表達,構成正反饋環(huán)路。通過上述途徑,更多的Nrf2發(fā)生核易位并與抗氧化反應原件(antioxidant response element,ARE)結合,激活抗氧化反應相關基因的轉(zhuǎn)錄[28]。TRIM21在蛋白質(zhì)毒性應激和氧化應激誘導下利用其PRYSPRY結構域直接與p62相互作用并通過K63鍵在賴氨酸K7處泛素化p62,進而阻礙p62的寡聚化及與Keap1的結合,抑制p62-Keap1-Nrf2抗氧化應激途徑[29],從而增加細胞氧化損傷并誘發(fā)HCC。

最近的研究已經(jīng)確定了Nrf2的許多功能,超出了其氧化還原調(diào)節(jié)能力,其中就包括其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的復雜作用[30]。p62的缺失促進了L-Atg5/Tsc1雙基因敲除鼠中肝臟腫瘤的進展。Nrf2敲除能夠加強肝細胞的增殖,改善雙基因敲除小鼠的代謝重編程和存活,而不會形成腫瘤[31]。在二乙基亞硝胺誘導的大鼠肝癌模型中,在HCC發(fā)展過程中Nrf2靶向基因的表達逐漸增加,Nrf2同Keap1與肌動蛋白細胞骨架的相互作用在HCC結節(jié)內(nèi)被破壞[32]。有研究表明,TRIM21和p62之間的關聯(lián)可被升高的RPRD1A競爭性地中斷,隨后抑制p62的泛素化,穩(wěn)定Nrf2,進一步促進HCC的進展[33]。一項在大鼠中的研究提示Nrf2在肝癌發(fā)生的早期會發(fā)生突變或者激活,這在后續(xù)肝癌的進展中發(fā)揮關鍵作用[34]。

與氧化應激反應類似,p62-Keap1-Nrf2抗氧化途徑在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用復雜,與具體病理生理環(huán)境相關,是一把雙刃劍,同時在疾病的不同階段有不同的促癌機制[35]?；趐62-Keap1-Nrf2抗氧化途徑多樣的調(diào)節(jié)效應,以及HCC發(fā)病機制的高度復雜性與異質(zhì)性,需要更多的相關研究來明確TRIM21利用該途徑對HCC發(fā)揮的作用。

4.2 抗HBV途徑 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是HCC的重要危險因素。TRIM21能夠抑制病毒的復制,從而減少由病毒性肝炎發(fā)展而來的HCC。HBV病毒DNA復制過程中,TRIM21可結合HBx蛋白發(fā)揮其E3泛素連接酶活性使得相關蛋白降解,從而抑制病毒復制與HCC發(fā)生發(fā)展[36]。HBx是由HBV DNA開放閱讀框X編碼的一種調(diào)節(jié)蛋白,是通過蛋白質(zhì)間相互作用控制細胞和病毒的啟動子和增強子來驅(qū)動HBV病毒感染的關鍵。此外,HBx還在HCC中扮演重要角色,通過調(diào)節(jié)HCC標志物以維持增殖信號轉(zhuǎn)導,逃避生長抑制,促進免疫逃逸和永生性復制,輔助參與腫瘤引發(fā)的炎性反應,觸發(fā)侵襲和轉(zhuǎn)移,促進血管生成,誘導基因組不穩(wěn)定,防止細胞凋亡和擾亂細胞能量代謝來影響下游細胞機制[37]。HBV感染早期,特異性抗體尚未形成,TRIM21可以與HBx直接結合,促進HBx降解[36]。特異性抗體形成之后,抗體包被病毒并進入細胞質(zhì),TRIM21的PRYSPRY結構域結合抗體的Fc段,從而介導HBx蛋白質(zhì)降解[38]。除了泛素化降解HBx蛋白之外,有研究表明TRIM21可以結合HBV DNA聚合酶并參與泛素化降解,進一步抑制病毒復制活性[39]。

綜上所述,TRIM21通過介導HBV復制所需的HBx蛋白以及HBV DNA聚合酶的泛素化降解以抑制HBV的復制。同時,HBx在HCC進程中發(fā)揮多種多樣的作用,促進HCC發(fā)生發(fā)展。TRIM21通過抗HBV途徑對HCC起到抑癌因子的作用。

4.3 其他途徑 HCC的危險因素眾多,發(fā)病機制復雜,TRIM21在其他通路中泛素化降解相關蛋白,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Wang等[40]報道,胰腺祖細胞分化和增殖因子與RIPK1相互作用,通過募集TRIM21促進了RIPK1 k63相關的泛素化,促進了RIPK1和NF-κB信號的激活,從而抑制HCC。一項研究利用免疫共沉淀測定表明TRIM21能夠與β-連環(huán)蛋白相互結合,TRIM21通過促進β-連環(huán)蛋白的泛素化和降解來抑制β-連環(huán)蛋白的核易位,繼而抑制HCC細胞的侵襲[20]。另一項研究提示乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1 (acetyl-CoA acetyltransferase 1,ACAT1)使甘油磷酸-O-?；D(zhuǎn)移酶(glyceronephosphate O-acyltransferase,GNPAT)在K128位點乙?；?抑制TRIM21介導的GNPAT泛素化和降解。更多穩(wěn)定的GNPAT加速抑制TRIM21介導的脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)降解并促進脂質(zhì)代謝[41]。實驗證明,shRNA介導的ACAT1消融和GNPAT乙?；笔Э梢种坡闶螽惙N移植和二乙基亞硝胺/四氯化碳誘導的小鼠HCC中的脂質(zhì)代謝和腫瘤進展。此外,聯(lián)合ACAT1抑制劑與索拉非尼給藥可顯著延緩小鼠腫瘤的形成[41]。類似地,李濤等[21]認為TRIM21通過下調(diào)自噬相關蛋白4B(autophagy-related protein 4B,ATG4B)影響細胞周期,進而抑制HCC細胞增殖。

5 小結與展望

TRIM21具有泛素連接酶E3活性,參與蛋白質(zhì)泛素化降解,影響蛋白生物活性,從而發(fā)揮復雜的調(diào)節(jié)作用。在不同的研究中,HCC中TRIM21的表達水平無統(tǒng)一結論,但更多的研究認為HCC中TRIM21表達增加。這可能與不同研究之間所檢索的在線數(shù)據(jù)庫以及納入研究的病例數(shù)和患者特征存在差異有關。增加病例數(shù),根據(jù)患者特征進行分組分析與合理設置對照或能得出信度與效度更高的結論。TRIM21對HCC調(diào)控結果也存在爭議。TRIM21通過對p62-Keap1-Nrf2途徑負調(diào)節(jié)以對抗氧化應激反應,但氧化應激本身在癌癥中就擁有著雙面效應,在導致HCC中,TRIM21通過此途徑引發(fā)相反的調(diào)節(jié)作用。此外,TRIM21能夠加速HBx和HBV DNA聚合酶降解,抑制HBV復制與發(fā)揮其他抗HCC作用。β-連環(huán)蛋白、ATG4B、GNPAT和FASN等在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)的泛素化也由TRIM21介導,最終抑制HCC發(fā)生發(fā)展。HCC的發(fā)病機制復雜,患者間異質(zhì)性大,TRIM21在不同病因?qū)е碌腍CC及不同階段有不同的表現(xiàn),這可能是導致結論不一致的重要因素。TRIM21與HCC 之間關系錯綜復雜,想要清晰描繪TRIM21在HCC中的作用網(wǎng)絡并應用于臨床需要展開更多更全面而深入的研究。