十字花科蔬菜提取物對草莓?；图怄哏牭毒囊志钚匝芯?/h1>
2023-12-06 03:26:26王海琪史芳芳
中國果菜 2023年11期
王海琪，史芳芳
（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830088）
草莓（Fragaria×ananassa Duch.）為薔薇科多年生草本植物，富含營養(yǎng)物質(zhì)，果實(shí)味道甜美，生育期短，結(jié)果早和產(chǎn)量高，備受人們喜愛，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近些年來，草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但是由于種植面積不斷擴(kuò)大、種植連作等原因，導(dǎo)致草莓土傳病害嚴(yán)重[1]。尖孢鐮刀菌為一類可在土壤內(nèi)生存又可侵染作物的兼性寄生真菌。由尖孢鐮刀菌草莓專化型（Fusarium oxysporum Schl.f.sp.fragariae）侵染引起的枯萎病是引起連作草莓普遍發(fā)生的重要土傳病害，嚴(yán)重制約了草莓的可持續(xù)發(fā)展[2-3]。目前生產(chǎn)上大量使用化學(xué)殺菌劑防治草莓枯萎病，導(dǎo)致病原菌抗藥性及農(nóng)藥殘留等問題加劇，對生態(tài)環(huán)境和食品安全造成了極大危害，因此探索有效防控草莓枯萎病的生物方法刻不容緩。
十字花科蔬菜具良好的化感作用[4]，將十字花科蕓薹屬蔬菜的植株殘?bào)w翻埋進(jìn)土壤，具有改善土壤質(zhì)量、提高土壤微生物多樣性、促進(jìn)草莓生長的作用，同時(shí)還可降低土壤中有害真菌數(shù)量，減少枯萎病的發(fā)生。王德江等[5]通過研究4 種蕓薹屬蔬菜生物熏蒸對黃瓜枯萎病的影響，發(fā)現(xiàn)4 種蔬菜提取液對枯萎病病菌的生長均有抑制作用，其中芥菜生物熏蒸處理防病效果達(dá)到52.9%。劉琳等[6]、劉瓊等[7]研究發(fā)現(xiàn)，芥菜和茼蒿蔬菜提取物可抑制西瓜?；图怄哏牭毒?，有效抑制菌體生長，抑菌率可達(dá)90%。十字花科蔬菜屬于新疆常見作物，且其體內(nèi)化感效應(yīng)對改善土壤質(zhì)量有明顯效果，因此本研究選取十字花科蔬菜探討對連作草莓普遍發(fā)生枯萎病的影響。
本研究對所采集的草莓病株進(jìn)行病原菌分離、培養(yǎng)、鑒定，通過DNA 鑒定出草莓專尖孢鐮刀菌導(dǎo)致的草莓枯萎病，對分離出的病原菌進(jìn)行藥劑試驗(yàn)；并采用菌絲生長法測定5 種十字花科蔬菜對草莓?；图怄哏牭毒氖覂?nèi)毒力，篩選其殺菌活性，旨在為草莓枯萎病防治和蔬菜源農(nóng)藥先導(dǎo)化合物的研發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。同時(shí)利用十字花科蔬菜之間的化感作用合理安排與草莓輪、間作[8]，可改善土壤微生物結(jié)構(gòu)，減輕病害發(fā)生。
1 材料及方法
1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)
試驗(yàn)于2023 年5 月在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所組培室進(jìn)行。
1.2 材料與試劑
蔬菜：采用種植于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所冷棚的芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻，經(jīng)風(fēng)干后用小型粉碎機(jī)制成粉末狀樣品，過40 目篩，放置于密封袋備用。
供試菌株： 尖孢鐮刀菌草莓?；停‵usarium oxysporum Schl.f.sp.fragariae） 采自十二師農(nóng)科所草莓種苗繁育基地，通過采集病株分離、純化、DNA 鑒定后，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證并保存的菌種。
試劑PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基、95%乙醇、注射用氨芐青霉素鈉，生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.3 儀器與設(shè)備
超凈工作臺（JBVS 840 型），蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；電子天平（PL203），Mettler Toledo；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9080B 型），上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZH-200KBS 型），上海申安醫(yī)療器械廠；氮吹儀（CM-24T），北京成萌偉業(yè)技有限公司；粉樣機(jī)，小熊磨粉機(jī)；90 mm、培養(yǎng)皿，移液槍，鑷子、接種刀、50 mL 離心管等。
1.4 試驗(yàn)方法
1.4.1 蔬菜提取液的制備
準(zhǔn)確稱取10.0 g 芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻粉末各3 份，分別加入10 倍體積的95%乙醇，浸提24 h，并用超聲波輔助提取2 h，過濾提取液，使用氮吹儀（50 ℃）濃縮至10 mL，制成濃度為1.0 g/mL 的芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻提取物溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.2 氨芐青霉素鈉溶液的配制
稱取氨芐青霉素鈉0.5 g 置于50 mL 離心管中，定容并配制成濃度為10 mg/L 氨芐青霉素鈉溶液。
1.4.3 不同蔬菜提取物的抑菌活性
將1.0 g/mL 芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻提取物分別稀釋成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 g/mL 的不同濃度溶液，無菌條件下與培養(yǎng)基混合制成含藥平板，同時(shí)加入濃度為10 mg/L 的氨芐青霉素鈉溶液（抑制細(xì)菌生長），以多菌靈作為陽性對照，無菌水作為陰性對照。無菌條件下，將供試病菌接種至PDA 培養(yǎng)基后，于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫暗培養(yǎng)5 d，待菌種長滿平板時(shí)，在菌落邊緣處打取直徑為7 mm 的菌餅備用。
1.4.4 蔬菜提取物對西瓜枯萎病菌的室內(nèi)毒力測定
取制備好的菌餅接種于含藥培養(yǎng)基中央，重復(fù)3 次。放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測量菌落直徑[9]，按照公式（1）（2）計(jì)算菌落直徑和抑菌率。
1.5 數(shù)據(jù)分析
利用Excel 2010 和SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Duncan和LSD 進(jìn)行多重差異分析，采用DPS 7.05 制圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同蔬菜提取液的抑菌活性
由圖1～2 可以看出，隨不同蔬菜提取液濃度的降低，抑菌率呈現(xiàn)出隨之降低的趨勢，其中0.4～1 g/mL 對尖孢鐮刀菌有明顯抑制作用，濃度大于0.8 g/mL 時(shí)，抑菌率均大于50%；蔬菜提取液濃度為0.05～0.2 g/mL 的抑菌效果不明顯，濃度為0.05 g/mL 時(shí)抑制作用接近于4%。不同濃度下各蔬菜提取液對尖孢鐮刀菌抑菌效果差異明顯，在高濃度下以茼蒿和芥菜抑菌效果最好，濃度在1 g/mL 時(shí)，茼蒿和芥菜抑菌率最高，顯著高于甘藍(lán)、雪里蕻、油菜，分別高12.58%、3.89%、3.42%和12.08%、3.56%、2.96%。
圖1 不同濃度的蔬菜提取液對菌絲生長的影響Fig.1 Effect of vegetable extracts with different concentrations on mycelial growth
圖2 不同濃度蔬菜提取液對尖孢鐮刀菌的抑菌率Fig.2 Antibacterial rate of vegetable extracts with different concentrations against F.oxysporum
2.2 5 種蔬菜提取物對尖孢鐮刀菌的室內(nèi)毒力測定
以茼蒿、甘藍(lán)、芥菜、雪里蕻、油菜5 種蔬菜提取液的濃度為橫坐標(biāo)，以抑菌率為縱坐標(biāo)，得出5 種蔬菜提取物對草莓尖孢鐮刀菌的毒力回歸方程及EC50、斜率、相關(guān)系數(shù)等。EC50是衡量藥劑毒力大小的重要指標(biāo)，其EC50值越大，表明該藥劑毒力越??；反之，則表明藥劑毒力越大[10]。
由表1 可以看出，茼蒿的EC50為0.413 0 g/mL，說明茼蒿提取液毒力大，對尖孢鐮刀菌抑制效果最好，芥菜、雪里蕻和油菜EC50在0.473 5～0.491 5 g/mL 之間，說明這三種蔬菜提取液毒力相當(dāng)，甘藍(lán)的EC50最高，對病原菌抑制作用最低。毒力回歸方程的斜率k 代表了病菌對殺菌劑的敏感性，斜率k 越大，敏感性越高，反之，敏感性越低[11]。表1 中可以看出茼蒿、雪里蕻、油菜3 種蔬菜斜率k 較大，說明尖孢鐮刀菌對這3 種蔬菜敏感性較高，病原菌對甘藍(lán)敏感性較低。
表1 不同蔬菜提取液對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of different vegetable extracts on the growth of F.oxysporum hyphae
3 結(jié)論
目前生產(chǎn)上防控草莓枯萎病多采用化學(xué)防治方法，如百菌清、代森錳鋅和多菌靈等，但化學(xué)防控越來越難以滿足草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展需求，因此急需探索對草莓枯萎病防控的生物防治方法，已有不少研究關(guān)于蔬菜中的揮發(fā)油和萜類化合物等對病害病原菌具有抑制和殺滅作用[12-14]。本研究通過菌絲生長法測定，發(fā)現(xiàn)5 種十字花科蔬菜提取液均對草莓專化型尖孢鐮刀菌有一定的抑菌效果，但不同蔬菜提取液抑制作用不同，蔬菜提取物對尖孢鐮刀菌的最佳抑制濃度為1 g/mL，此濃度下5種蔬菜抑菌活性大小依次為茼蒿、芥菜、油菜、雪里蕻、甘藍(lán)，這與劉琳等[6]發(fā)現(xiàn)芥菜提取物對西瓜枯萎病的抑制濃度相當(dāng)。5 種十字花科蔬菜提取液中茼蒿、油菜、雪里蕻和芥菜對尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的毒力，EC50值分別達(dá)到了0.413 0、0.473 5、0.474 9、0.491 5 g/mL。綜合發(fā)現(xiàn)，茼蒿提取液對草莓枯萎病的抑制作用最好，這與李珊珊等[15]研究結(jié)果相似，她認(rèn)為茼蒿中含有的綠原酸能抑制西瓜枯萎病病原菌菌絲生長，降低病菌孢子萌發(fā)率。十字花科蕓薹屬蔬菜是中國栽培面積最大、消費(fèi)量最大的蔬菜，因此研究生物質(zhì)體內(nèi)活性物質(zhì)對蔬菜病害的抑菌效果有重要的現(xiàn)實(shí)意義，田間可通過茼蒿等十字花科蔬菜與草莓輪作進(jìn)行草莓枯萎病的防治，后續(xù)可采集輪作后蔬菜與土壤酚酸類物質(zhì)進(jìn)行研究，進(jìn)一步探索十字花科蔬菜對枯萎病病原菌的化感作用，為今后研發(fā)生物殺菌劑提供理論依據(jù)。
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王海琪，史芳芳
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1 材料及方法
1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)
試驗(yàn)于2023 年5 月在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所組培室進(jìn)行。
1.2 材料與試劑
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供試菌株： 尖孢鐮刀菌草莓?；停‵usarium oxysporum Schl.f.sp.fragariae） 采自十二師農(nóng)科所草莓種苗繁育基地，通過采集病株分離、純化、DNA 鑒定后，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證并保存的菌種。
試劑PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基、95%乙醇、注射用氨芐青霉素鈉，生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.3 儀器與設(shè)備
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1.4 試驗(yàn)方法
1.4.1 蔬菜提取液的制備
準(zhǔn)確稱取10.0 g 芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻粉末各3 份，分別加入10 倍體積的95%乙醇，浸提24 h，并用超聲波輔助提取2 h，過濾提取液，使用氮吹儀（50 ℃）濃縮至10 mL，制成濃度為1.0 g/mL 的芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻提取物溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.2 氨芐青霉素鈉溶液的配制
稱取氨芐青霉素鈉0.5 g 置于50 mL 離心管中，定容并配制成濃度為10 mg/L 氨芐青霉素鈉溶液。
1.4.3 不同蔬菜提取物的抑菌活性
將1.0 g/mL 芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻提取物分別稀釋成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 g/mL 的不同濃度溶液，無菌條件下與培養(yǎng)基混合制成含藥平板，同時(shí)加入濃度為10 mg/L 的氨芐青霉素鈉溶液（抑制細(xì)菌生長），以多菌靈作為陽性對照，無菌水作為陰性對照。無菌條件下，將供試病菌接種至PDA 培養(yǎng)基后，于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫暗培養(yǎng)5 d，待菌種長滿平板時(shí)，在菌落邊緣處打取直徑為7 mm 的菌餅備用。
1.4.4 蔬菜提取物對西瓜枯萎病菌的室內(nèi)毒力測定
取制備好的菌餅接種于含藥培養(yǎng)基中央，重復(fù)3 次。放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測量菌落直徑[9]，按照公式（1）（2）計(jì)算菌落直徑和抑菌率。
1.5 數(shù)據(jù)分析
利用Excel 2010 和SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Duncan和LSD 進(jìn)行多重差異分析，采用DPS 7.05 制圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同蔬菜提取液的抑菌活性
由圖1～2 可以看出，隨不同蔬菜提取液濃度的降低，抑菌率呈現(xiàn)出隨之降低的趨勢，其中0.4～1 g/mL 對尖孢鐮刀菌有明顯抑制作用，濃度大于0.8 g/mL 時(shí)，抑菌率均大于50%；蔬菜提取液濃度為0.05～0.2 g/mL 的抑菌效果不明顯，濃度為0.05 g/mL 時(shí)抑制作用接近于4%。不同濃度下各蔬菜提取液對尖孢鐮刀菌抑菌效果差異明顯，在高濃度下以茼蒿和芥菜抑菌效果最好，濃度在1 g/mL 時(shí)，茼蒿和芥菜抑菌率最高，顯著高于甘藍(lán)、雪里蕻、油菜，分別高12.58%、3.89%、3.42%和12.08%、3.56%、2.96%。
圖1 不同濃度的蔬菜提取液對菌絲生長的影響Fig.1 Effect of vegetable extracts with different concentrations on mycelial growth
圖2 不同濃度蔬菜提取液對尖孢鐮刀菌的抑菌率Fig.2 Antibacterial rate of vegetable extracts with different concentrations against F.oxysporum
2.2 5 種蔬菜提取物對尖孢鐮刀菌的室內(nèi)毒力測定
以茼蒿、甘藍(lán)、芥菜、雪里蕻、油菜5 種蔬菜提取液的濃度為橫坐標(biāo)，以抑菌率為縱坐標(biāo)，得出5 種蔬菜提取物對草莓尖孢鐮刀菌的毒力回歸方程及EC50、斜率、相關(guān)系數(shù)等。EC50是衡量藥劑毒力大小的重要指標(biāo)，其EC50值越大，表明該藥劑毒力越??；反之，則表明藥劑毒力越大[10]。
由表1 可以看出，茼蒿的EC50為0.413 0 g/mL，說明茼蒿提取液毒力大，對尖孢鐮刀菌抑制效果最好，芥菜、雪里蕻和油菜EC50在0.473 5～0.491 5 g/mL 之間，說明這三種蔬菜提取液毒力相當(dāng)，甘藍(lán)的EC50最高，對病原菌抑制作用最低。毒力回歸方程的斜率k 代表了病菌對殺菌劑的敏感性，斜率k 越大，敏感性越高，反之，敏感性越低[11]。表1 中可以看出茼蒿、雪里蕻、油菜3 種蔬菜斜率k 較大，說明尖孢鐮刀菌對這3 種蔬菜敏感性較高，病原菌對甘藍(lán)敏感性較低。
表1 不同蔬菜提取液對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of different vegetable extracts on the growth of F.oxysporum hyphae
3 結(jié)論
目前生產(chǎn)上防控草莓枯萎病多采用化學(xué)防治方法，如百菌清、代森錳鋅和多菌靈等，但化學(xué)防控越來越難以滿足草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展需求，因此急需探索對草莓枯萎病防控的生物防治方法，已有不少研究關(guān)于蔬菜中的揮發(fā)油和萜類化合物等對病害病原菌具有抑制和殺滅作用[12-14]。本研究通過菌絲生長法測定，發(fā)現(xiàn)5 種十字花科蔬菜提取液均對草莓專化型尖孢鐮刀菌有一定的抑菌效果，但不同蔬菜提取液抑制作用不同，蔬菜提取物對尖孢鐮刀菌的最佳抑制濃度為1 g/mL，此濃度下5種蔬菜抑菌活性大小依次為茼蒿、芥菜、油菜、雪里蕻、甘藍(lán)，這與劉琳等[6]發(fā)現(xiàn)芥菜提取物對西瓜枯萎病的抑制濃度相當(dāng)。5 種十字花科蔬菜提取液中茼蒿、油菜、雪里蕻和芥菜對尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的毒力，EC50值分別達(dá)到了0.413 0、0.473 5、0.474 9、0.491 5 g/mL。綜合發(fā)現(xiàn)，茼蒿提取液對草莓枯萎病的抑制作用最好，這與李珊珊等[15]研究結(jié)果相似，她認(rèn)為茼蒿中含有的綠原酸能抑制西瓜枯萎病病原菌菌絲生長，降低病菌孢子萌發(fā)率。十字花科蕓薹屬蔬菜是中國栽培面積最大、消費(fèi)量最大的蔬菜，因此研究生物質(zhì)體內(nèi)活性物質(zhì)對蔬菜病害的抑菌效果有重要的現(xiàn)實(shí)意義，田間可通過茼蒿等十字花科蔬菜與草莓輪作進(jìn)行草莓枯萎病的防治，后續(xù)可采集輪作后蔬菜與土壤酚酸類物質(zhì)進(jìn)行研究，進(jìn)一步探索十字花科蔬菜對枯萎病病原菌的化感作用，為今后研發(fā)生物殺菌劑提供理論依據(jù)。
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