劉佳林，鞏秀美，冷 鵬，劉 林*，張桂芝*

（1.臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東 臨沂 276005；2.臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 臨沂 276005）

植物體內(nèi)養(yǎng)分從凈合成部位向凈利用部位的有效轉(zhuǎn)運(yùn)是形成生物產(chǎn)量的一個(gè)關(guān)鍵因素，傳遞細(xì)胞是具有極強(qiáng)短途運(yùn)輸能力的細(xì)胞，能大幅提高養(yǎng)分的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，研究傳遞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有助于作物產(chǎn)量的提高。傳遞細(xì)胞最突出的形態(tài)特征是具有壁內(nèi)突，壁內(nèi)突可以增加細(xì)胞表面積，從而壁增加了細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)量，提高跨膜運(yùn)輸能力[1-2]。壁內(nèi)突主要由纖維素和木質(zhì)素組成[3]，纖維素形成細(xì)胞壁框架，木質(zhì)素填充在框架內(nèi)空隙中，賦予細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度。壁內(nèi)突的發(fā)育與六碳糖的濃度有密切關(guān)系，發(fā)育程度因植物而異[4]，六碳糖參與壁內(nèi)突發(fā)育的啟動(dòng)[5]。傳遞細(xì)胞可發(fā)生于不同的器官，負(fù)責(zé)共質(zhì)體與質(zhì)外體間跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。被子植物胚發(fā)育時(shí)期胚柄末端細(xì)胞成為傳遞細(xì)胞，從胚囊內(nèi)吸收養(yǎng)分以滿足胚發(fā)育[2,6-10]；部分植物花蜜腺中產(chǎn)生傳遞細(xì)胞，為產(chǎn)蜜組織轉(zhuǎn)運(yùn)原料[11-12]；鹽生植物鹽腺內(nèi)產(chǎn)生傳遞細(xì)胞，對(duì)鹽的分泌活動(dòng)具有重要意義[1,13]；有些植物葉韌皮部有傳遞細(xì)胞[1-2,14-18]，負(fù)責(zé)光合產(chǎn)物的韌皮部裝載[5]。

韌皮部傳遞細(xì)胞壁內(nèi)突發(fā)育程度與光照強(qiáng)度關(guān)系密切。研究表明擬南芥和豌豆葉壁內(nèi)突數(shù)量在一定范圍內(nèi)隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)而增加，在這個(gè)范圍內(nèi)光合作用強(qiáng)度也隨光照強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)[19-20]，表明壁內(nèi)突發(fā)育與光合作用強(qiáng)度密切相關(guān)。然而，在韌皮部傳遞細(xì)胞壁形成時(shí)期，壁內(nèi)突是否發(fā)生分枝，與相鄰葉肉細(xì)胞和維管薄壁細(xì)胞之間是具有共質(zhì)體聯(lián)系還是相互隔離，細(xì)胞器發(fā)育方面有何與傳遞細(xì)胞功能相適應(yīng)的特征，仍然需要進(jìn)一步研究。經(jīng)典植物生理學(xué)理論認(rèn)為蔥屬植物韌皮部裝載途徑為質(zhì)外體途徑[21-22]，韭菜是廣泛栽培的蔥屬蔬菜作物，蔥屬韌皮部具有傳遞細(xì)胞，而對(duì)韭菜韌皮部超微特征了解甚少，尚不清楚其傳遞細(xì)胞的主要特征（如發(fā)育特征、壁內(nèi)突特征、胞間連絲特征等），因此，對(duì)韭菜葉韌皮部進(jìn)一步觀察，以明確揭示韌皮部傳遞細(xì)胞壁內(nèi)突在形成時(shí)期、壁內(nèi)突特征如是否發(fā)生分枝、細(xì)胞器發(fā)育方面有何與傳遞細(xì)胞功能相適應(yīng)的特征、細(xì)胞壁上有無胞間連絲將該細(xì)胞與相鄰細(xì)胞進(jìn)行胞質(zhì)連接對(duì)明確韭菜韌皮部結(jié)構(gòu)及傳遞細(xì)胞的功能意義重大。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試韭菜（Allium tuberosum Rottler ex Sprengle）種子源自臨沂市種子公司，種植于臨沂大學(xué)校園內(nèi)。

1.2 儀器與設(shè)備

德國徠卡超薄切片機(jī)Ultracut R，日本JEOL；透射電子顯微鏡，Jeol 1220。

1.3 試驗(yàn)方法

采用光學(xué)顯微技術(shù)和超微技術(shù)對(duì)葉韌皮部進(jìn)行觀察。取充分伸長的成熟葉，雙面刀片徒手切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察葉片解剖特征。

取尚未充分伸展的幼葉以及充分伸長、葉色濃綠的成熟葉，將其中部切成小塊，置于2%戊二醛溶液中初固定12 h，再于1%四氧化鋨溶液中后固定4 h。梯度乙醇脫水，Epon-812 環(huán)氧樹脂包埋。用超薄切片機(jī)切片，半薄切片厚度1 μm，甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察葉肉和維管組織，纖維素為主的初生壁呈棕色，木質(zhì)素的次生壁呈藍(lán)色[23]。超薄切片厚度70 nm，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行電子染色[19,22]，透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞壁、胞間連絲和細(xì)胞器。

2 結(jié)果與分析

2.1 韭菜葉片的顯微觀察

韭菜葉與多數(shù)植物不同，葉片折疊且葉緣聯(lián)合，形成閉合的扁平囊狀結(jié)構(gòu)。葉片由外向內(nèi)依次是表皮、葉肉組織、維管束和髓（圖1A、B）。葉肉分化為柵欄組織和海綿組織，柵欄組織為一層細(xì)胞，排列緊密；海綿組織位于柵欄組織內(nèi)部，排列疏松（圖2A、B）。髓不含葉綠體，位于扁平囊的中央（圖1A、B），折角部位缺少髓（圖1B、2B）。

圖1 韭菜葉片徒手切片F(xiàn)ig.1 Leaf sections cut with blades by hand

圖2 韭菜葉片顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 Microstructure of leek leaf

由于葉片是折疊而成的特化結(jié)構(gòu)，所以能觀察到兩行維管束（圖1B），位于遠(yuǎn)軸側(cè)的維管束較大，近軸側(cè)的較?。▓D1B、2A），總是韌皮部向著表皮，木質(zhì)部向著中央（圖2A）。然而葉片折角處只有一行維管束，木質(zhì)部向著近軸面，韌皮部向著遠(yuǎn)軸面（圖2B）。維管束表面緊密排列著一層葉肉細(xì)胞，構(gòu)成維管束鞘（圖2A、圖2B）。

在成熟葉的韌皮部，伴胞邊緣和細(xì)胞核染色深，其他區(qū)域染色淺（圖2C）。伴胞的細(xì)胞核大，直徑可達(dá)8 μm，位于細(xì)胞中央（圖2C）。不同部位的伴胞在大小方面略有差別，位于韌皮部外圍、與木質(zhì)部或維管束鞘相連的伴胞體積較大，直徑可達(dá)13 μm，而位于韌皮部中央的伴胞體積較小，直徑只有邊緣伴胞的一半左右（圖2C）。

2.2 傳遞細(xì)胞的超微觀察

電鏡下觀察，幼葉中伴胞具有光滑的細(xì)胞壁（圖3A），成熟葉伴胞的細(xì)胞壁有大量內(nèi)突（圖3B），壁內(nèi)突長約2 μm，伴有很多分枝，分枝末端呈絮狀（圖3C、圖3D）。傳遞細(xì)胞不同位置上壁內(nèi)突的發(fā)育情況有差異，與篩管相鄰區(qū)域缺少壁內(nèi)突，其他區(qū)域壁內(nèi)突較多。具有壁內(nèi)突的伴胞是傳遞細(xì)胞，結(jié)果表明傳遞細(xì)胞的發(fā)育與葉的發(fā)育密切相關(guān)，表現(xiàn)為葉成熟后才產(chǎn)生壁內(nèi)突。

圖3 壁內(nèi)突發(fā)育Fig.3 Cell wall ingrowth development

與尚未產(chǎn)生壁內(nèi)突的伴胞與傳遞細(xì)胞對(duì)比，前者不含大液泡，但含有較多小液泡，因而細(xì)胞質(zhì)較?。▓D3A）；后者含有較大中央液泡，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)分布在細(xì)胞邊緣，邊緣正是壁內(nèi)突分布的區(qū)域（圖3B），這顯示了細(xì)胞質(zhì)隨著壁內(nèi)突的發(fā)育而發(fā)生明顯變化。

傳遞細(xì)胞含大量線粒體，這種生產(chǎn)能量的細(xì)胞器占據(jù)了細(xì)胞質(zhì)大約一半的空間（圖4A），而且每個(gè)都含有大量管狀內(nèi)嵴（圖4A～C）。線粒體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)特征表明傳遞細(xì)胞能量水平很高，與其旺盛的跨膜運(yùn)輸能力相適應(yīng)。傳遞細(xì)胞內(nèi)含有大量游離核糖體（圖4B～D）和糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖4C），表明傳遞細(xì)胞是蛋白質(zhì)合成代謝活躍的場所。

圖4 傳遞細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)Fig.4 Cytoplasm of transfer cells

2.3 傳遞細(xì)胞與葉肉細(xì)胞和維管薄壁細(xì)胞間的共質(zhì)體系

為了解傳遞細(xì)胞與周圍細(xì)胞之間的聯(lián)系，對(duì)負(fù)責(zé)細(xì)胞間共質(zhì)體連接功能的胞間連絲進(jìn)行了觀察。大量觀察表明，傳遞細(xì)胞與具有光合作用功能的維管束鞘細(xì)胞之間缺少胞間連絲。維管束鞘細(xì)胞是緊密排列在維管束表面的葉肉細(xì)胞，所以傳遞細(xì)胞與葉肉細(xì)胞之間沒有共質(zhì)體連接。傳遞細(xì)胞與維管薄壁細(xì)胞之間的胞間連絲隨著壁內(nèi)突的發(fā)育而退化，其兩端沉積次生壁（圖5A、圖5B），發(fā)生退化的胞間連絲與葉肉細(xì)胞之間正常的胞間連絲形成鮮明對(duì)比，前者在細(xì)胞壁中的部分不再具有質(zhì)膜和中央的連絲小管，兩端與細(xì)胞質(zhì)之間有次生壁隔開，后者在細(xì)胞壁中的部分質(zhì)膜和連絲小管明顯，兩端與細(xì)胞質(zhì)直接連接，而胞間連絲兩端與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連（圖5C、圖5D）。顯然，傳遞細(xì)胞是相對(duì)孤立的，與葉肉細(xì)胞和維管薄壁細(xì)胞之間沒有共質(zhì)體聯(lián)系。

圖5 胞間連絲Fig.5 Plasmodesmata

3 小結(jié)與討論

3.1 壁內(nèi)突發(fā)育與葉發(fā)育相關(guān)性

觀察韭菜細(xì)胞得出，幼葉伴胞缺少壁內(nèi)突，成熟葉伴胞才有壁內(nèi)突，顯然，韭菜韌皮部傳遞細(xì)胞的發(fā)育與葉片發(fā)育密切相關(guān)。這種相關(guān)性與細(xì)胞壁的發(fā)育規(guī)律一致，細(xì)胞壁分為中膠層、初生壁和次生壁，中膠層在細(xì)胞分裂時(shí)產(chǎn)生，初生壁在細(xì)胞生長即體積增大的過程中產(chǎn)生，次生壁在細(xì)胞成熟后產(chǎn)生，即在細(xì)胞停止生長或細(xì)胞體積達(dá)到最大以后產(chǎn)生。初生壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組織，次生壁主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。壁內(nèi)突由纖維素和木質(zhì)素組成，屬于次生壁[2-3]，因此壁內(nèi)突在細(xì)胞成熟后產(chǎn)生。

傳遞細(xì)胞與篩管形成復(fù)合體，是特化的伴胞；伴胞在光合產(chǎn)物韌皮部裝載和卸載過程中發(fā)揮重要作用。在葉片作為光合產(chǎn)物凈消耗器官時(shí)，伴胞承擔(dān)光合產(chǎn)物韌皮部卸載功能，即成熟葉片合成的光合產(chǎn)物通過韌皮部長途到未成熟葉片后由伴胞負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)出篩管，被生長中的細(xì)胞所利用。當(dāng)葉片成熟變成光合產(chǎn)物凈輸出器官時(shí)，傳遞細(xì)胞承擔(dān)光合產(chǎn)物韌皮部裝載功能，即將光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入篩管，長途運(yùn)輸?shù)狡渌鞴賉23]。韭菜葉片成熟后，伴胞變成傳遞細(xì)胞，顯然，壁內(nèi)突的發(fā)育能夠促進(jìn)光合產(chǎn)物韌皮部裝載。大量研究表明，壁內(nèi)突發(fā)育開始于溶質(zhì)從質(zhì)外體向共質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)開始時(shí)[1,10,24-28]。進(jìn)一步研究表明，具有葉片韌皮部傳遞細(xì)胞的植物，在一定光照范圍內(nèi)，對(duì)其成熟葉增強(qiáng)光照，能夠增強(qiáng)光合作用，從而使壁內(nèi)突的數(shù)量和大小都明顯增加[5,19]，更進(jìn)一步表明壁內(nèi)突發(fā)生于成熟葉，并與光合產(chǎn)物裝載相適應(yīng)。

3.2 傳遞細(xì)胞是能量代謝與蛋白質(zhì)代謝活躍的細(xì)胞

對(duì)韭菜成熟葉傳遞細(xì)胞質(zhì)的觀察發(fā)現(xiàn)，傳遞細(xì)胞含有大量通過有氧呼吸產(chǎn)生能量的線粒體，并且內(nèi)嵴發(fā)達(dá)。這表明韭菜傳遞細(xì)胞能量代謝非?；钴S。線粒體越多，細(xì)胞能量代謝越活躍?？紤]到傳遞細(xì)胞質(zhì)膜上有大量從事主動(dòng)運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白，需要從ATP 獲得能量，膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP 酶活性強(qiáng)[29-31]，細(xì)胞含線粒體多，能量代謝活躍，生產(chǎn)大量ATP，為細(xì)胞從質(zhì)外體向共質(zhì)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)光合產(chǎn)物提供能量[32-33]。

在韭菜傳遞細(xì)胞中觀察到結(jié)合了核糖體的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和大量游離核糖體，顯示傳遞細(xì)胞蛋白質(zhì)合成代謝非常活躍。因此，韭菜傳遞細(xì)胞是能量與蛋白質(zhì)代謝非?；钴S的細(xì)胞。

3.3 傳遞細(xì)胞是相對(duì)孤立的

對(duì)韭菜傳遞細(xì)胞的觀察還發(fā)現(xiàn)，傳遞細(xì)胞與葉肉細(xì)胞界面上缺少胞間連絲，意味著與葉肉細(xì)胞之間沒有共質(zhì)體聯(lián)系。觀察到傳遞細(xì)胞與維管薄壁細(xì)胞界面上有退化的胞間連絲，這意味著兩種類型細(xì)胞間本來有胞間連絲，但后來隨著壁內(nèi)突的出現(xiàn)而被破壞，細(xì)胞間的共質(zhì)體連接中斷。顯然，傳遞細(xì)胞是相對(duì)孤立的細(xì)胞，與裝載途徑上游細(xì)胞沒有細(xì)胞質(zhì)聯(lián)系。光合產(chǎn)物的韌皮部裝載有共質(zhì)體途徑和質(zhì)外體途徑[23]，前者是光合產(chǎn)物通過胞間連絲進(jìn)入伴胞，后者是光合產(chǎn)物通過細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入伴胞。韭菜葉傳遞細(xì)胞與葉肉細(xì)胞和維管薄壁細(xì)胞界面上缺少胞間連絲，葉肉細(xì)胞制造的光合產(chǎn)物沒有進(jìn)入伴胞的細(xì)胞質(zhì)通道，只能進(jìn)入傳遞細(xì)胞的細(xì)胞壁中，然后通過質(zhì)外體途徑進(jìn)入伴胞，實(shí)現(xiàn)韌皮部裝載。顯然，韭菜傳遞是孤立的，決定了光合產(chǎn)物只能通過質(zhì)外體途徑完成韌皮部裝載，但是尚需用其他實(shí)驗(yàn)手段做進(jìn)一步的證實(shí)。