吳會(huì)會(huì),吳強(qiáng)盛

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院/長(zhǎng)江大學(xué)根系生物研究所,湖北荊州,434025)

近年來(lái)由于工業(yè)污染加劇、化肥過(guò)量施用和灌溉不當(dāng)?shù)仍騕1]造成地表鹽分不斷沉積,土壤鹽漬化日趨嚴(yán)重,極大地限制了作物生長(zhǎng)發(fā)育和農(nóng)林經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展,已成為全球性的土壤生態(tài)問(wèn)題。鹽脅迫造成植物滲透調(diào)節(jié)失衡、離子毒害和氧化脅迫等損害,從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受限,生物量減少[2]。叢枝菌根真菌(AMF)能與大多數(shù)植物根系建立良好的互利共生關(guān)系,在植物根際形成龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò),擴(kuò)大根系的吸收面積,促進(jìn)宿主植物對(duì)礦質(zhì)元素和水分的吸收,增強(qiáng)植物的抗性[1]。鹽漬化根際土壤中存在豐富的AMF,說(shuō)明AMF對(duì)鹽漬化土壤的適應(yīng)性好[1-2]。

AMF增強(qiáng)宿主植物耐鹽性,與以下幾種機(jī)制有關(guān)。(1)調(diào)節(jié)滲透平衡。菌根化植物根際周圍形成龐大的菌絲網(wǎng),能夠延伸到植物根系無(wú)法到達(dá)的區(qū)域,擴(kuò)大了根系吸收范圍,增強(qiáng)了水分和礦質(zhì)元素吸收能力,以維持滲透平衡。研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下接種AMF有效提高了沙棗[3]和羊草[4]中K+含量和K+/Na+比值,抑制了Na+積累,從而緩解了Na+對(duì)植物的毒害[3-4]。鹽脅迫下接種AMF,還促進(jìn)了羊草對(duì)N和P的吸收[4],增強(qiáng)了柑桔對(duì)P、K、Fe、Cu、Mg的吸收[5],增加了蒲公英中Mg、Cu、Zn、Fe的含量[6],促進(jìn)了可溶性糖、脯氨酸等小分子可溶性有機(jī)物質(zhì)的積累[7-8],從而有利于降低滲透勢(shì),調(diào)節(jié)滲透平衡。(2)提高植物的抗氧化能力。接種AMF的番茄隨著鹽脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng),超氧化物歧化酶(SOD)活性先升后降,而過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性一直呈上升趨勢(shì)[9]。接種AMF提高了鹽脅迫下芹菜的SOD、POD和CAT活性[10],而抗氧化酶活性增強(qiáng)能有效清除活性氧,抑制植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化水平,從而提高植物的耐鹽性。(3)調(diào)節(jié)激素水平。崔令軍等[11]的研究發(fā)現(xiàn),接種AMF顯著提高了鹽脅迫下楨楠GA3、IAA、ZR含量,降低了ABA含量,從而促進(jìn)根系生長(zhǎng)。(4)其他。例如調(diào)控脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn),接種AMF影響番茄水孔蛋白和抗氧化基因的表達(dá),增加番茄對(duì)鹽脅迫的耐受性。

柑桔是世界第一大果樹,中國(guó)柑桔的栽培面積和產(chǎn)量位于全球首位[13]。在中國(guó)柑桔的主產(chǎn)區(qū),鹽害現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,其原因是多方面的。浙江、福建、廣東和海南等沿海地區(qū)桔園由于處于濱海鹽堿地而產(chǎn)生鹽毒害[14]。四川、重慶和秦嶺南麓產(chǎn)區(qū)桔園土壤大多屬于石灰性土壤,鹽堿化程度高[13]。另外一些柑桔主產(chǎn)區(qū)處于干旱和半干旱地區(qū),且位于丘陵山地,干旱迫使水分蒸發(fā)將土壤深處的鹽離子帶到土壤表層,不利于柑桔生長(zhǎng)[14]。此外,工業(yè)污染、灌溉不當(dāng)和化肥過(guò)量使用等人為原因也造成了土壤次生鹽漬化程度加劇[1,14]。柑桔是嫁接類果樹,其砧木的耐鹽性對(duì)柑桔植株的生長(zhǎng)起關(guān)鍵作用。枳(PoncirustrifoliataL. Raf)是柑桔嫁接廣泛使用的砧木,其根毛少,對(duì)鹽漬化土壤敏感。目前關(guān)于接種AMF對(duì)枳耐鹽性的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)在盆栽鹽脅迫(NaCl溶液處理)條件下,研究接種AMF對(duì)枳實(shí)生苗植株生長(zhǎng)、根系發(fā)育、光合色素含量、糖含量、活性氧含量和抗氧化酶活性的影響,探討AMF在提高枳實(shí)生苗耐鹽性方面的作用,以期為鹽漬土柑桔促生長(zhǎng)技術(shù)的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理供試菌種為摩西管柄囊霉Funneliformismosseae(Nicol. &Gerd.),由中國(guó)叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(kù)(BGC)提供,經(jīng)白三葉擴(kuò)繁3個(gè)月后備用。

頭年10月采摘成熟枳果實(shí),保存在4 ℃冰箱備用,翌年2月剝?nèi)》N子,選飽滿種子用75%酒精消毒10 min,蒸餾水潤(rùn)洗之后,播在高壓滅菌的河砂(≤2 mm)中,于晝/夜溫度為28 ℃/20 ℃、相對(duì)濕度為80%的光照培養(yǎng)箱中催芽,待4葉齡時(shí)移栽(上盆)。

在長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行盆栽。溫室基本環(huán)境條件:光合作用的光子通量密度為338～982 μmol/(m2·s),晝/夜溫度為(20～35) ℃/(15～26) ℃(16 h/8 h),相對(duì)濕度為70%～95%。盆栽基質(zhì)為土和砂(4∶1,V/V)的混合物,經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌(0.11 MPa,121 ℃,2 h)使土和砂中的土著菌根真菌孢子失活。土采自長(zhǎng)江大學(xué)落葉果樹基地。砂采自于長(zhǎng)江邊,為直徑<4 mm的河砂。塑料盆規(guī)格為上口徑19.5 cm,下口徑11.5 cm,高15.5 cm。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的4葉齡枳苗移栽到裝有2.5 kg基質(zhì)的塑料盆中,每盆4株。移栽時(shí),用“分層接種”法施入120 g菌劑(內(nèi)含1 800個(gè)孢子)/盆作為接種處理(+AMF),不接種處理(-AMF)為施入等量滅菌菌劑。移栽后,所有植株均放置在玻璃溫室中,在正常水分(土壤最大持水量的75%,WW)條件下生長(zhǎng),以促進(jìn)菌根侵染。10周后,一半仍進(jìn)行正常水分管理;另一半進(jìn)行鹽脅迫(SS,采用100 mmol /L的NaCl溶液進(jìn)行澆灌),為避免植物對(duì)鹽脅迫造成的短期不適應(yīng),前4 d每天NaCl濃度增加25 mmol/L,當(dāng)NaCl濃度達(dá)到100 mmol/L后,每隔3 d澆1次,每次每盆澆100 mL,連續(xù)處理9次后收獲植株。試驗(yàn)共為4個(gè)處理:正常水分未接種AMF處理(WW-AMF)、正常水分接種AMF處理(WW+AMF)、鹽脅迫未接種AMF處理(SS-AMF)、鹽脅迫接種AMF處理(SS+AMF)。單盆為1個(gè)重復(fù),每個(gè)處理重復(fù)4次,共16盆。

1.2 測(cè)定方法植株收獲當(dāng)天,采用常規(guī)方法測(cè)定株高、莖粗和葉片數(shù);然后將植株分成地上部分和地下部分,根系清洗干凈,擦干水分后,用電子天平分別測(cè)鮮質(zhì)量,獲得生物量。用于測(cè)定各種酶和過(guò)氧化物等生理指標(biāo)的材料放入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?用于測(cè)定果糖、葡萄糖和蔗糖含量的材料,用烘箱烘至恒重,磨成粉末過(guò)篩備用。人工計(jì)數(shù)法測(cè)量記錄根系的主根長(zhǎng)以及各級(jí)側(cè)根數(shù)。用根系掃描儀(J221A,Epson,Indonesia)對(duì)根系進(jìn)行掃描,然后用WinRHIZO根系分析軟件分析,獲得其根系構(gòu)型參數(shù)(根系總長(zhǎng)度、投影面積、表面積、平均直徑和體積)。選取1～2 cm新鮮根段,采用曲利苯藍(lán)染色法[15]測(cè)定菌根侵染率。菌根侵染率(%)=(侵染根段長(zhǎng)度/總觀察根段長(zhǎng)度)×100。葉綠素、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧陰離子自由基(O2·-)、果糖、葡萄糖和蔗糖含量測(cè)定,以及POD和CAT活性測(cè)定均依照吳強(qiáng)盛[16]的方法進(jìn)行。Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD采用雙抗體夾心法測(cè)定,試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)分析在SAS 8.1軟件中,采用ANOVA進(jìn)行處理間差異性顯著性測(cè)驗(yàn),以鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMF對(duì)鹽脅迫下枳生長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)的影響未接種AMF的枳根系未觀察到菌根侵染,鹽脅迫顯著降低了菌根侵染率。無(wú)論是否接種AMF,與正常水分相比,鹽脅迫明顯抑制了枳實(shí)生苗的生長(zhǎng),主要表現(xiàn)為顯著降低了株高、葉片數(shù)、總鮮質(zhì)量和二級(jí)側(cè)根數(shù)。與SS-AMF相比,SS+AMF枳實(shí)生苗的株高、葉片數(shù)、總鮮質(zhì)量、二級(jí)側(cè)根和三級(jí)側(cè)根數(shù)分別提高了27.49%、16.67%、26.34%、15.73%和71.43%(見(jiàn)表1)。

表1 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對(duì)枳實(shí)生苗根系菌根侵染率、植株生長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)的影響

2.2 AMF對(duì)鹽脅迫下枳根系構(gòu)型的影響與WW-AMF相比,SS-AMF顯著降低了枳根系總長(zhǎng)、投影面積、表面積和體積,分別降低了8.40%、6.08%、4.25%和16.39%。與SS-AMF相比,SS+AMF顯著提高了枳實(shí)生苗根系總長(zhǎng)、投影面積、表面積和體積,分別提高了10.46%、7.04%、6.72%和21.57%,但對(duì)主根長(zhǎng)和平均直徑無(wú)顯著影響(見(jiàn)表2)。

表2 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對(duì)枳實(shí)生苗根系構(gòu)型的影響

2.3 AMF對(duì)鹽脅迫下枳實(shí)生苗葉片光合色素的影響與WW-AMF相比,SS-AMF顯著降低了枳實(shí)生苗葉片葉綠素a和總?cè)~綠素的含量。與SS-AMF相比,SS+AMF顯著提高了葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量,分別提高了13.66%、13.21%和14.08%,但對(duì)類胡蘿卜含量無(wú)顯著影響(見(jiàn)表3)。

表3 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對(duì)枳實(shí)生苗葉片光合色素含量的影響

2.4 AMF對(duì)鹽脅迫下枳實(shí)生苗糖含量的影響無(wú)論是否接種AMF,與正常水分相比,鹽脅迫均顯著降低了枳根系的果糖、葡萄糖、蔗糖含量以及葉片的葡萄糖含量,顯著提高了枳葉片的果糖和蔗糖含量。與SS-AMF相比,SS+AMF顯著提高了枳根系和葉片的蔗糖含量,分別提高了14.30%和15.57%(見(jiàn)圖1a-c)。

注:柱狀圖中不同小寫字母表示相同部位不同處理間差異顯著(p<0.05),圖2同。圖1 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對(duì)枳實(shí)生苗果糖、葡萄糖和蔗糖含量的影響

2.5 AMF對(duì)鹽脅迫下枳實(shí)生苗丙二醛和活性氧含量的影響無(wú)論是否接種AMF,與正常水分相比,鹽脅迫顯著誘發(fā)了MDA、H2O2和O2·-在枳實(shí)生苗根系和葉片中的積累。接種AMF對(duì)鹽脅迫下MDA、H2O2和O2·-的積累具有一定緩解作用,與SS-AMF相比,SS+AMF枳根系H2O2和O2·-含量分別顯著降低了41.23%和16.10%,枳葉片MDA和H2O2含量分別顯著降低了10.43%和12.15%(見(jiàn)圖2a-c)。

圖2 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對(duì)枳實(shí)生苗MDA、H2O2和O2·-的影響

2.6 AMF對(duì)鹽脅迫下枳實(shí)生苗抗氧化酶活性的影響無(wú)論是否接種AMF,與正常水分相比,鹽脅迫顯著增強(qiáng)了枳實(shí)生苗根系和葉片的POD和CAT活性,顯著降低了枳根系的Fe-SOD、Mn-SOD以及枳葉片的Cu/Zn-SOD和Fe-SOD活性。與SS-AMF相比,SS+AMF顯著增強(qiáng)了枳根系的Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD、POD和CAT活性,分別增強(qiáng)了17.00%、17.77%、15.94%、16.44%和39.12%;SS+AMF還顯著增強(qiáng)了枳葉片的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、POD和CAT活性,分別增強(qiáng)了16.29%、30.29%、9.51%和26.21%(見(jiàn)表4)。

表4 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對(duì)枳實(shí)生苗根系和葉片抗氧化酶活性的影響

3 討論

菌根侵染率表明了AMF與植物的親和程度,在一定程度上反映了AMF的促生效果[9]。本研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫顯著降低了菌根侵染率,這與前人在羊草[17]和大葉女貞[18]上的結(jié)果是一致的。其原因是鹽脅迫對(duì)AMF的孢子萌發(fā)和菌絲正常生長(zhǎng)有抑制作用[9,17-18]。

土壤鹽漬化會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育造成一系列傷害,嚴(yán)重限制植物生長(zhǎng),甚至?xí)?dǎo)致植物死亡。本研究顯示,在鹽脅迫下枳實(shí)生苗的生長(zhǎng)受到顯著抑制,接種AMF則可明顯緩解土壤鹽害的抑制作用。鹽脅迫下,與未接種AMF相比,接種AMF顯著促進(jìn)了枳實(shí)生苗的生長(zhǎng)。其原因是:一方面接種AMF促進(jìn)植株根系的生長(zhǎng),根系總長(zhǎng)、投影面積、表面積和體積顯著提高,擴(kuò)大了根系的吸收面積,促進(jìn)了根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收[17-18];另一方面接種AMF提高了光合色素的積累,葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著提高,促進(jìn)了光合作用,從而有利于植物干物質(zhì)的積累[17]。

在未接種AMF的植株中,與正常水分相比,鹽脅迫顯著降低了葉綠素a和總?cè)~綠素的含量。其原因是鹽脅迫抑制了植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收,而植物合成葉綠素需要礦質(zhì)元素,尤其是Mg[19]。徐嘉美等[6]發(fā)現(xiàn),接種F.mosseae后蒲公英地上部的Mg含量在NaCl濃度為100 mmol/L和400 mmol/L的鹽脅迫條件下顯著提高。Wu等[20]也發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下接種兩種AMF均顯著提高了柑桔葉片Mg含量。因此,鹽脅迫下接種AMF提高了植物對(duì)Mg的吸收,進(jìn)而促進(jìn)了葉綠素的合成,有利于提高植物的光合作用[19]。本試驗(yàn)也證實(shí)了在鹽脅迫下接種AMF顯著提高了枳實(shí)生苗葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量。

AMF與植物建立共生關(guān)系時(shí),在促進(jìn)宿主植物水分和養(yǎng)分吸收的同時(shí),需利用宿主植物的碳水化合物維持自身的代謝活動(dòng),而真菌生長(zhǎng)最重要的碳源來(lái)自于蔗糖裂解產(chǎn)生的己糖(果糖和/或葡萄糖)[20]?？扇苄蕴窃谥参矬w內(nèi)可作為滲透調(diào)節(jié)劑降低滲透勢(shì)。本試驗(yàn)顯示,鹽脅迫顯著降低了枳根系的蔗糖、果糖、葡萄糖含量以及葉片的葡萄糖含量,且相關(guān)性分析表明植株的總鮮質(zhì)量與根系蔗糖(r=0.61,p<0.05)、根系果糖(r=0.71,p<0.01)、根系葡萄糖(r=0.73,p<0.01)以及葉片葡萄糖(r=0.69,p<0.01)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。這說(shuō)明了鹽脅迫抑制了枳植株中糖分的積累,提高其滲透勢(shì),引起了滲透脅迫,從而影響了植株的生長(zhǎng),導(dǎo)致枳總鮮質(zhì)量的降低。鹽脅迫下,與未接種AMF相比,接種AMF顯著提高了根系和葉片的蔗糖含量,這表明AMF通過(guò)積累蔗糖應(yīng)對(duì)鹽脅迫。

脅迫條件會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的爆發(fā),而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的含量反應(yīng)了細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,鹽脅迫顯著誘發(fā)了枳實(shí)生苗MDA、H2O2和O2·-的積累,而鹽脅迫下接種AMF顯著降低了枳葉片和根系H2O2含量、根系O2·-含量,且相關(guān)性分析表明菌根侵染率與葉片H2O2(r= -0.53,p<0.05)、根系H2O2(r=-0.73,p<0.01)和根系O2·-(r=-0.80,p<0.01)含量呈顯著負(fù)相關(guān),表明了AMF的侵染能抑制枳活性氧的積累。宿主植物根系的H2O2增多與AMF中叢枝的衰老相關(guān)[21],說(shuō)明AMF叢枝對(duì)清除植物H2O2有重要作用[22]。這些結(jié)果表明了AMF特殊的結(jié)構(gòu)和功能與鹽脅迫下菌根化植物中活性氧含量的降低有關(guān)。

本研究中,鹽脅迫下,與未接種AMF相比,接種AMF顯著提高了枳根系和葉片的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、POD和CAT活性以及根系的Fe-SOD活性。這與鹽脅迫下接種AMF增強(qiáng)羊草[17]和大葉女貞[18]抗氧化酶活性的研究結(jié)果一致。SOD、POD和CAT活性在一定程度上與所利用的金屬元素含量有關(guān)[22],而鹽脅迫下接種AMF可以有效促進(jìn)宿主植物對(duì)礦質(zhì)元素Fe、Cu、Mg、Zn等吸收[5-6]。此外,菌根化植物抗氧化酶活性提高可能與宿主植物和菌根真菌自身相關(guān)基因的表達(dá)量增加有關(guān)。He等[23]的研究表明,接種AMF的枳PtMn-SOD、PtPOD和PtCAT1基因表達(dá)量上調(diào)。接種AMF的番茄在鹽脅迫下SlSOS1和SlSOS2的表達(dá)量顯著提高[12]。Lanfranco 等[24]從AMF萌發(fā)的孢子中克隆到SOD基因,這表明AMF也可以通過(guò)調(diào)控自身SOD基因的表達(dá)來(lái)降低氧化損傷。本研究表明了鹽脅迫下接種AMF通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活性,降低活性氧含量,從而減少氧化損傷,提高枳的耐鹽性。