田 潔,孫協(xié)平,高少兵,凌 敏

(1 長(zhǎng)江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院,重慶涪陵,408100;2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,長(zhǎng)沙,410128)

甜櫻桃(Cerasusavium),又名大櫻桃和歐洲甜櫻桃,果粒大、色澤鮮艷、營(yíng)養(yǎng)豐富,果實(shí)成熟期又值晚春和初夏新鮮水果缺乏期,故備受市場(chǎng)青睞[1-2]。近年來(lái),我國(guó)重慶、四川、云南及貴州等地甜櫻桃產(chǎn)業(yè)有一定發(fā)展[2-3]。硒是植物有益元素,在提高果樹(shù)的抗逆性和果實(shí)品質(zhì)上作用明顯[4-5]。然而,不同植物對(duì)硒的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和富集能力存在顯著差異[6]。一般低劑量硒能夠明顯提高作物生理活性促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育,而高劑量降低生理活性抑制生長(zhǎng)發(fā)育。有關(guān)硒對(duì)甜櫻桃的影響研究,僅限于葉面噴施硒對(duì)甜櫻桃果實(shí)品質(zhì)、褪黑素和抗氧化方面的研究[7-9],有關(guān)硒脅迫對(duì)甜櫻桃的影響研究較少。對(duì)硒具有較高富集能力和耐受性的農(nóng)作物,可作為人體補(bǔ)充硒元素的重要橋梁。利用不同形態(tài)硒和施用方法提高果樹(shù)生理活性,并生產(chǎn)出富硒水果,這在梨[10]、杧果[11]、火龍果[12]和甜櫻桃[8]上均有報(bào)道。根施硒時(shí),六價(jià)硒(硒酸鹽)的利用效率顯著高于其他形態(tài)硒[7-11]。目前,關(guān)于甜櫻桃對(duì)硒的富集和耐受能力,尚無(wú)定論。葉片生理參數(shù)除了對(duì)硒施用劑量響應(yīng)外,處理時(shí)間的影響也比較明顯[13]。本研究以4年生盆栽甜櫻桃樹(shù)為試材,對(duì)4種劑量六價(jià)硒處理后植株?duì)I養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)參數(shù)以及葉片質(zhì)量、葉片抗氧化物質(zhì)等生理參數(shù)進(jìn)行比較,以探究甜櫻桃對(duì)硒的耐受性,進(jìn)而為富硒甜櫻桃生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

以盆栽4年生“俄羅斯8號(hào)”甜櫻桃為試驗(yàn)材料。于2020年1月25日在重慶市涪陵區(qū)義和鎮(zhèn)開(kāi)心農(nóng)場(chǎng)的設(shè)施連棟避雨大棚內(nèi),將4年生“俄羅斯8號(hào)”甜櫻桃(砧木為草櫻,干高50～60 cm,地徑2.5～3 cm)移植于體積為46 L的塑料花盆內(nèi),一株一盆。盆栽基質(zhì)為未腐熟稻殼、腐熟蚯蚓土以及紫色土園土,三者體積比為1∶4∶5。移栽后進(jìn)行統(tǒng)一的土肥水病蟲(chóng)害管理至2020年5月3日,隨后篩選出長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的盆栽植株進(jìn)行不同施硒處理,花盆底部排水孔用膠封住,根周圍插入6根竹棍便于通氣。以硒酸鈉為硒源,稱取硒(以硒元素計(jì))0、32、64、96 mg,溶于2 L水中,均勻澆灌于根周圍。每個(gè)處理4個(gè)生物重復(fù),單株為1個(gè)重復(fù)。此后進(jìn)行統(tǒng)一栽培管理。于2021年5月10日在天氣晴朗的下午分別采集功能葉,用冰盒保存帶回試驗(yàn)室。自來(lái)水洗凈、擦干后,用直徑為1.5 cm的打孔器打出圓葉片,每6個(gè)圓葉片為1組,用做好標(biāo)記的錫箔紙包裹進(jìn)行液氮速凍后,儲(chǔ)存在超低溫冰箱里。

1.2 試驗(yàn)方法

取甜櫻桃圓葉片,放置于鼓風(fēng)干燥箱80 ℃烘干后,稱質(zhì)量,通過(guò)打孔器的直徑計(jì)算出圓葉片面積。圓葉片干質(zhì)量除以圓葉片面積即為比葉重。參考向芬等[14]的方法,將甜櫻桃圓葉片放入10 mL離心管中,再加95%乙醇8 mL,浸泡一段時(shí)間,至葉片完全褪色,上清液即為葉綠素提取液。取0.1 mL上清液于試管中,加入95%乙醇1.9 mL,搖勻,以95%乙醇為空白對(duì)照,測(cè)量在665、649、470 nm處的吸光度,計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、葉綠素a/b和類胡蘿卜素含量[15]。

采用蒽酮硫酸法[15]測(cè)定可溶性糖含量。取圓葉片加入少量石英砂和80%乙醇4 mL,研磨成勻漿,80 ℃水浴鍋保溫40 min,4 000轉(zhuǎn)/min離心4 min,取上清液,再用80%乙醇定容至10 mL,搖勻,即為可溶性糖提取液。取0.1 mL提取液于試管中,加入2.9 mL蒽酮試劑,搖勻后在90 ℃水浴鍋中保溫15 min,迅速冷卻,以80%乙醇0.1 mL和蒽酮試劑2.9 mL為空白對(duì)照,測(cè)量在620 nm處的吸光度,計(jì)算可溶性糖含量。

參考陳嘉勤[16]方法測(cè)定丙二醛含量。取圓葉片加入少量石英砂和10%三氯乙酸2 mL,研磨成勻漿,再加10%三氯乙酸2 mL進(jìn)一步研磨。分裝入兩個(gè)2 mL離心管中,4 000 r/min離心10 min,合并上清液,即為丙二醛提取液。取17個(gè)離心管編號(hào),16個(gè)樣品管各加1 mL提取液,一個(gè)對(duì)照管加1 mL蒸餾水,再各加0.6%硫代巴比妥酸溶液1 mL,搖勻,在沸水浴中反應(yīng)15 min,迅速冷卻后離心,取上清液,在450、532、600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,計(jì)算丙二醛含量。

參考杜明等[17]的方法測(cè)定葉片硒含量。取圓葉片置于鼓風(fēng)干燥箱60 ℃烘干,稱取0.5 g,裝入離心管中,再用研磨機(jī)(60 Hz頻率)研磨成粉末狀,送樣至青島科創(chuàng)有限公司測(cè)量。樣品經(jīng)硝酸消解后,利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定硒元素含量。

采用動(dòng)態(tài)閃燒法(改進(jìn)杜馬法)[18]測(cè)定氮元素含量。取圓葉片置于鼓風(fēng)干燥箱60 ℃烘干,稱取0.5 g,裝入離心管中,再用研磨機(jī)(60 Hz頻率)研磨成粉末狀,送樣至自然資源部第三海洋研究所測(cè)量。

目測(cè)統(tǒng)計(jì)開(kāi)花株數(shù)、開(kāi)花數(shù)、無(wú)雌蕊和雙雌蕊花總量和著果數(shù),計(jì)算開(kāi)花株率和開(kāi)花樹(shù)平均花量等。

采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法[19]檢測(cè)花粉活力。用毛筆輕蘸少量花粉置于載玻片上,輕輕滴入1%TTC溶液1滴,蓋上蓋玻片后將載玻片放入恒溫箱中培養(yǎng),溫度設(shè)置為25 ℃。15 min后置于顯微鏡下觀察,紅色花粉為有活力,無(wú)色花粉則沒(méi)有活力?；ǚ刍盍?(視野內(nèi)有活力花粉數(shù)/視野內(nèi)總花粉數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),采用皮爾遜相關(guān)分析線性相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量硒處理下葉片硒和氮含量

從表1中可知,在長(zhǎng)期處理下,32和64 mg/株硒處理下葉片硒含量高,其次是對(duì)照,而96 mg/株硒處理下葉片硒含量最低。32 mg/株硒處理下葉片氮含量最高且與對(duì)照差異顯著,64和96 mg/株硒處理下葉片氮含量顯著下降。比葉重受硒處理劑量影響不顯著。

表1 長(zhǎng)期不同劑量硒處理對(duì)甜櫻桃葉片硒氮元素和比葉重的影響

2.2 不同劑量硒處理下葉片色素含量

從表2中可知,長(zhǎng)期處理下,不同劑量硒處理下葉片葉綠素a、葉綠素b及葉綠素a+b含量差異均不顯著;隨硒劑量增加,葉綠素a/b和類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)出先降后升的變化趨勢(shì),32 mg/株硒處理顯著低于96 mg/株硒處理,但各硒處理與對(duì)照差異均不顯著。

表2 長(zhǎng)期不同劑量硒處理對(duì)甜櫻桃葉片色素含量的影響

2.3 不同劑量硒處理下葉片可溶性糖和丙二醛含量

從圖1可見(jiàn),在長(zhǎng)期處理下,硒劑量32和64 mg/株處理葉片可溶性糖含量與對(duì)照差異不顯著,但當(dāng)硒劑量達(dá)96 mg/株時(shí)顯著高于其他處理和對(duì)照。葉片丙二醛含量受硒處理劑量影響不顯著。

圖1 長(zhǎng)期不同劑量硒處理對(duì)甜櫻桃葉片可溶性糖和丙二醛含量的影響

2.4 葉片硒含量與其他生理指標(biāo)相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果表明,在長(zhǎng)期處理下,葉片硒含量與葉綠素a+b、葉綠素a/b、可溶性糖含量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為-0.01、0.08、-0.16,即線性相關(guān)性極弱;葉片硒含量與葉片氮、比葉重、葉綠素a、葉綠素b、丙二醛含量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為-0.48、0.44、-0.2、0.42和0.33,即呈現(xiàn)低度線性相關(guān);葉片硒含量與類胡蘿卜素含量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.73,顯著(p<0.05)負(fù)相關(guān)。

2.5 不同劑量硒處理下生殖生長(zhǎng)指標(biāo)

從表3可見(jiàn),隨著硒劑量的增加,開(kāi)花株率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在96 mg/株硒處理下100%開(kāi)花。從開(kāi)花樹(shù)平均花量來(lái)看,對(duì)照最多,其次為96 mg/株硒處理?？偦縼?lái)看,以96 mg/株硒處理最多,其次為64和32 mg/株硒處理,對(duì)照最低。不同劑量硒處理對(duì)花粉活力影響不顯著,花粉活力均為0%。硒處理中存在無(wú)雌蕊和雙雌蕊現(xiàn)象,對(duì)照無(wú)此現(xiàn)象。從花后著果總量來(lái)看,硒處理促進(jìn)了著果。

表3 不同劑量硒處理對(duì)甜櫻桃生殖生長(zhǎng)的影響

3 討論

在自然高硒條件下,大多數(shù)植物屬于非富集硒植物,即植物體內(nèi)硒含量低于100 mg/kg(以干質(zhì)量計(jì)),并且當(dāng)植物硒含量在3～100 mg/kg(以干質(zhì)量計(jì))會(huì)產(chǎn)生硒脅迫[20-21]。在本研究中,根據(jù)盆栽土壤容重和體積初步得出64 mg/株處理的土壤硒含量為 0.4 mg/kg(屬于富硒土壤標(biāo)準(zhǔn)),甜櫻桃葉片硒濃度最高僅為15.34 mg/kg,大大低于硒聚集植物,如壺瓶碎米薺(Cardaminehupingshanesis)在土壤硒含量10～70 mg/kg(以干質(zhì)量計(jì))條件下,葉片積累的最大硒含量為1 965 mg/kg(以干質(zhì)量計(jì))[20]。64 mg/株處理下盆栽甜櫻桃葉片硒含量最大(15.34 mg/kg),當(dāng)甜櫻桃長(zhǎng)期在96 mg/株處理下葉片硒含量?jī)H為2.87 mg/kg,已存在明顯的硒脅迫現(xiàn)象,可見(jiàn)甜櫻桃與大多數(shù)植物一樣屬于非富集硒植物。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,盆栽甜櫻桃葉片硒臨界水平在15.34 mg/kg附近。在長(zhǎng)期處理下,未施硒處理對(duì)照葉片硒含量達(dá)6.00 mg/kg,這是因?yàn)槭┪幚淼奈孕》肿游锱派⒌酱髿庵?進(jìn)而通過(guò)氣孔進(jìn)入未施硒處理對(duì)照植物葉片[22]。相比64 mg/株處理,96 mg/株高劑量硒處理盆栽甜櫻桃葉片硒含量明顯下降,并且還顯著低于對(duì)照,這可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)地上部揮發(fā)排硒和根系降低吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)量來(lái)抵御硒的脅迫。高劑量硒(硒酸鈉)也顯著降低蒔蘿(Anethumgraveolens)地上部和地下部的硒含量,地上部硒含量略高于地下部[23],推測(cè)主要通過(guò)降低硒的吸收來(lái)抵御硒的脅迫。對(duì)于非富集硒植物而言,硒的有益劑量和毒性劑量之間的界限狹窄[24-25],高硒水平對(duì)植物生長(zhǎng)生理的危害大[26],不同植物促進(jìn)生長(zhǎng)的硒最佳閾值存在差異,并且與硒形態(tài)、植物生育期和環(huán)境密切相關(guān)[27-30]。

大多研究表明,硒能夠提高植物葉片色素含量,僅在硒劑量極高時(shí),葉片色素含量才顯著下降[26]。在本研究中,甜櫻桃葉片葉綠素含量受硒劑量的影響不顯著,葉片硒含量與葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素a+b含量無(wú)顯著的線性相關(guān)。在高硒脅迫下,蒔蘿葉片色素含量也是高于對(duì)照,而與其他濃度硒處理差異較小[23]。植物在逆境脅迫下,一般葉綠素a會(huì)轉(zhuǎn)化為葉綠素b,從而導(dǎo)致葉綠素a/b值下降。在本研究中,不同劑量硒處理對(duì)葉綠素a/b的影響無(wú)線性規(guī)律,葉綠素a/b不能作為硒脅迫的指示參數(shù);葉片硒含量與類胡蘿卜素含量顯著負(fù)相關(guān),可見(jiàn),葉片硒含量能夠影響甜櫻桃葉片類胡蘿卜素合成代謝,內(nèi)在機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。丙二醛是植物器官衰老或者在逆境脅迫條件下發(fā)生膜質(zhì)過(guò)氧化作用產(chǎn)生的過(guò)氧化物之一,是脅迫產(chǎn)生的重要參數(shù)[16]。在本研究中,各硒劑量處理的葉片丙二醛含量差異未達(dá)到顯著水平,葉片丙二醛含量也不能作為硒脅迫的指示參數(shù)。有研究發(fā)現(xiàn),在硒短期處理下,葉片硒含量、比葉重、類胡蘿卜素含量、葉片丙二醛含量、氮含量參數(shù)隨著硒劑量的增加呈現(xiàn)出規(guī)律性變化[31]。本研究發(fā)現(xiàn),在硒長(zhǎng)期處理下,葉片可溶性糖含量顯著上升,氮含量顯著下降,兩者可作為硒脅迫的有效參數(shù),尤其是葉片氮含量比其他參數(shù)提前發(fā)生明顯變化。Gouveia等[25]的研究得到了相似結(jié)論,即硒處理下碳和氮含量等初級(jí)代謝化合物增加可能通過(guò)滲透調(diào)節(jié)來(lái)防御硒脅迫,可以作為一種有效的生物標(biāo)準(zhǔn)來(lái)指示硒對(duì)植物的脅迫。

重慶低海拔地區(qū)是甜櫻桃種植的非適應(yīng)區(qū)[2],通過(guò)一定的技術(shù)手段促進(jìn)花芽分化和開(kāi)花結(jié)果是當(dāng)前需要解決的主要問(wèn)題[3]。硒對(duì)植物生殖器官的影響鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),根施六價(jià)硒對(duì)甜櫻桃生殖生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用,主要體現(xiàn)在甜櫻桃開(kāi)花株率、總花量和著果總量等方面。程丹等[32]的研究也表明,根施外源硒能夠明顯提高杭白菊單株開(kāi)花量。說(shuō)明,硒具有促進(jìn)植物生殖生長(zhǎng)的功能。本研究中,不同劑量硒處理甜櫻桃花粉活力皆為零,花后著果量低,呈現(xiàn)出一定的“花而不實(shí)”現(xiàn)象,這可能與重慶低海拔屬于甜櫻桃非適宜區(qū),冬季不能滿足需冷量等因素有關(guān)。在其他非適宜區(qū),如:上海[1]和杭州[33]等均有類似現(xiàn)象發(fā)生。這些地區(qū),可以通過(guò)單氰胺處理[33]等技術(shù)手段促進(jìn)甜櫻桃生殖生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

在長(zhǎng)期硒處理下,甜櫻桃葉片硒含量與葉片葉綠素a+b、葉綠素a/b、可溶性糖、氮、比葉重、葉綠素a、葉綠素b、丙二醛含量等生理參數(shù)相關(guān)性弱,僅與類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。甜櫻桃硒脅迫現(xiàn)象主要表現(xiàn)為葉片可溶性糖含量上升、氮含量下降,葉片可溶性糖含量和氮含量可作為甜櫻桃硒脅迫預(yù)警主要參數(shù),尤其是氮含量。根施硒酸鈉有利于盆栽甜櫻桃生殖生長(zhǎng)。