王賽博,張凱東,劉 冰,熊桂紅,李庚花,涂貴慶,蔣軍喜

(1 江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,南昌,330045;2 江西省奉新縣農(nóng)業(yè)局,江西奉新,330700)

獼猴桃屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)多年生落葉藤本果樹,是當今國內(nèi)外競相發(fā)展的新興特色水果之一[1]。江西省奉新縣是我國獼猴桃生產(chǎn)大縣之一,近年來,獼猴桃病毒病開始上升為主要病害,成為影響獼猴桃質(zhì)量和產(chǎn)量的重要因素[2]。全世界已報道侵染獼猴桃的病毒共19種,在我國已發(fā)現(xiàn)的有11種,包括α-線性病毒科(Alphaflexiviridae)馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)的馬鈴薯X病毒(PotatovirusX,PVX);β-線性病毒科(Betaflexiviridae)發(fā)狀病毒屬(Capillovirus)的蘋果莖溝病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV),葡萄病毒屬(Vitivirus)的獼猴桃病毒A(ActinidiavirusA,AcVA)、獼猴桃病毒B(ActinidiavirusB,AcVB)、獼猴桃病毒C(ActinidiavirusC,AcVC),柑桔病毒屬(Citrivirus)的柑桔葉斑駁病毒(Citrusleafblotchvirus,CLBV);無花果花葉病毒科(Fimoviridae)歐洲山梣環(huán)斑病毒屬(Emaravirus)的獼猴桃褪綠環(huán)斑相關(guān)病毒(Actinidiachloroticringspotsassociatedvirus,AcCRaV)、獼猴桃山梣病毒2(Actinidiaemaravirus2,AcEV-2);雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、長線形病毒科(Closteroviridae)未分屬(Unassigned)的獼猴桃病毒1(Actinidiavirus1,AcV-1)和番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)的番茄壞死環(huán)斑相關(guān)病毒(Tomatonecroticspotassociatedvirus,TNSaV)[3-4]。目前,對引起奉新獼猴桃病毒病的病毒種類尚不清楚。小RNA深度測序技術(shù)是鑒定植物病毒的主要方法之一,現(xiàn)已成功應用于番茄、葡萄和西番蓮等作物的毒原鑒定[5-7]。本研究擬采用小RNA深度測序技術(shù)并通過RT-PCR和測序驗證,對奉新獼猴桃疑似病毒病樣本進行檢測,以明確其病毒種類。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2020年5月從江西省奉新縣山口萬畝獼猴桃種植基地、果優(yōu)水果種植農(nóng)民專業(yè)合作社、新西藍生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限責任公司3個主要獼猴桃種植區(qū)共采集23份疑似病毒病葉片樣品,樣品采集后迅速帶回實驗室于-80 ℃冰箱保存。

1.2 小RNA深度測序建庫和測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行。將全部23份疑似病毒病葉片樣品混合,利用Eastep? Super總RNA提取試劑盒提取樣品總RNA,使用小RNA樣品制備試劑盒構(gòu)建小RNA文庫,并使用HiSeq 4000二代測序儀進行深度測序,得到原始序列(raw reads),單端測序讀長為50 nt。應用Cutadapt軟件結(jié)合質(zhì)量分數(shù)預處理方法對原始序列進行質(zhì)量控制,質(zhì)量控制后剩余的序列即為高質(zhì)量序列(clean reads),再應用SPAdes軟件對高質(zhì)量序列進行拼接,將拼接結(jié)果與NT數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/)進行比對,挑選出其中的病毒序列。

1.3 獼猴桃病毒的RT-PCR驗證對在小RNA測序中檢測到的病毒,分別設(shè)計其特異性引物進行RT-PCR驗證,引物信息見表1。提取各樣品總RNA,利用GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(美國Promega公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增總體系25 μL,包括上游和下游引物各1 μL,2×Taq PCR預混液12.5 μL,ddH2O 8.5 μL,cDNA 2 μL。PCR擴增條件為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,54～60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃補平10 min?；厥誖T-PCR產(chǎn)物,克隆到pEASY-T3載體中,并采用藍白斑和菌落PCR鑒定陽性克隆。將陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。使用DNAStar軟件(USA)進行序列分析,通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序進行核苷酸序列同源性搜索。

表1 用于不同獼猴桃病毒RT-PCR擴增的引物信息[2]

2 結(jié)果與分析

2.1 病葉典型癥狀獼猴桃疑似病毒病葉片癥狀包括脈明、褪綠、黃化、斑駁、皺縮和畸形等,少部分病葉表現(xiàn)其中的一種癥狀類型,大部分病葉則表現(xiàn)復合癥狀(見圖1);感病植株的果實普遍偏小,呈現(xiàn)畸形。

圖1 江西奉新獼猴桃疑似病毒病葉片癥狀

2.2 小RNA測序結(jié)果從混合樣品中獲得22 647 028條長度為150 nt的原始序列,樣品原始序列條數(shù)大于1 000萬條,達到分析要求。對原始序列進行質(zhì)量控制,過濾掉3’端接頭序列、Phred質(zhì)量分數(shù)值小于20的低質(zhì)量序列、含N序列、含poly A尾巴序列、長度小于10 nt的過短序列及長度大于45 nt的過長序列后,獲得16 687 474條高質(zhì)量序列,其長度分布圖如圖2。其中所占比例最高的序列是長度為24 nt的小RNA序列,占比為15.4%。

圖2 江西奉新獼猴桃疑似病毒病葉片樣品小RNA深度測序所得高質(zhì)量序列的長度分布

篩選長度18～30 nt的clean reads序列進行序列拼接組裝,在NT數(shù)據(jù)庫中對拼接結(jié)果進行比對和統(tǒng)計。在混合樣品中得到461個contigs,總長為100 939 nt,平均長219 nt,最長為1388 nt。其中,比對到病毒的contigs有65個,共鑒定到4種病毒,分別是AcVA、AcVB、AcCRaV和CLBV(見表2)。

表2 江西奉新獼猴桃疑似病毒病葉片樣品小RNA深度測序所得clean reads序列拼接組裝比對到病毒的情況

2.3 RT-PCR驗證使用4對特征引物分別對所有樣品進行4種病毒(AcVA、AcVB、AcCRaV和CLBV)的RT-PCR擴增。結(jié)果表明,除第6號癥狀輕微樣品外,從其余22份病樣中均可擴增出目的條帶(見圖3)。將PCR擴增產(chǎn)物克隆測序后,獲得長度分別為597 bp、420 bp、477 bp和425 bp的序列。通過在NCBI中進行BLAST搜索,發(fā)現(xiàn)這4個序列與AcVA、AcVB、AcCRaV和CLBV 4種病毒對應序列的一致性分別為99.59%、99.38%、99.77%和100%。由此表明小RNA測序結(jié)果具有可靠性。在23份供試樣品中,4種病毒檢出率依次為87.0%、56.5%、65.2%和60.9%。

3 討論

利用小RNA深度測序技術(shù)對采自奉新縣山口、農(nóng)合、新西藍三個獼猴桃基地的23份疑似獼猴桃病毒病混合葉片樣品進行毒原檢測,共檢測出AcVA、AcVB、AcCRaV和CLBV 4種病毒。針對這4種病毒,對每份疑似病毒病葉片樣品進行RT-PCR檢測,至少檢測出1種病毒的樣品有22份,檢出最多的為AcVA,其檢出率高達87.0%,多數(shù)樣品中存在2～4種病毒的復合侵染,復合侵染率達81.8%。由此可認為,奉新縣獼猴桃病毒病的毒原有AcVA、AcVB、AcCRaV和CLBV 4種,AcVA為優(yōu)勢種,病毒復合侵染發(fā)生普遍。BLOUIN等[3]歸納認為,在獼猴桃上,AcVA和AcVB易造成葉片脈明,AcCRaV會產(chǎn)生斑駁或環(huán)斑,CLBV嚴重感染時葉片黃化壞死等。本試驗結(jié)果與此一致。

小RNA深度測序技術(shù)是植物毒原鑒定的主要方法之一。該技術(shù)從葉片總RNA中分離出18～30 nt范圍內(nèi)的小RNA,兩端加上特定接頭后反轉(zhuǎn)錄形成cDNA,利用測序儀對DNA片段進行單向末端直接測序和表達定量,從而解析相應靶序列。由于基因組存在大量重復序列,在這種區(qū)域產(chǎn)生的reads大多是24 nt,因此小RNA測序數(shù)據(jù)中數(shù)量最多的是24 nt的reads。小RNA深度測序技術(shù)具有靈敏度高,測序通量大,利于區(qū)分同家族或相似序列的不同小RNA分子等優(yōu)勢。如:姜軍等[8]通過小RNA深度測序技術(shù)鑒定出河南地區(qū)西瓜病毒種類,陳玲等[9]利用該技術(shù)明確了北京地區(qū)櫻桃種質(zhì)資源中的病毒病毒原。這表明了小RNA深度測序技術(shù)在植物病毒病毒原鑒定中的準確性和可靠性。

此前,一些學者對我國陜西、四川和湖北等地的獼猴桃病毒病的毒原進行了檢測,結(jié)果表明陜西獼猴桃病毒病的毒原主要為AcVA、AcVB、AcCRaV、CLBV和CMV[10-12],四川獼猴桃病毒病的毒原主要為AcVA、AcCRaV、CLBV和AcV-1[13-15],在湖北獼猴桃樣品中檢測到AcVA、AcVB、AcCRaV、CLBV、AcV-1和獼猴桃種傳潛隱病毒(Actinidiaseed-bornelatentvirus,ASbLV)[4]。結(jié)合本研究結(jié)果,表明AcVA、AcVB、AcCRaV和CLBV在我國獼猴桃種植區(qū)發(fā)生具有普遍性。分析認為,由于獼猴桃主要通過嫁接繁殖,且蚜蟲和葉蟬等害蟲時有發(fā)生,近年來奉新縣從四川蒲江、蒼溪等地頻繁引進苗木,因此促成了奉新獼猴桃病毒病的傳播蔓延。為有效防控奉新獼猴桃病毒病的發(fā)生,應重點做好使用無病接穗、苗木和加強蟲害防控等工作。