不同包膜材料的超聲造影劑微泡的瞬態(tài)空化閾值研究

丁 波，張國(guó)峰，朱逸斐

（珠海醫(yī)凱電子科技有限公司，廣東珠海 519041）

近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)超聲、先進(jìn)材料和人工智能技術(shù)的發(fā)展，超聲波在臨床診斷和治療中應(yīng)用日益廣泛[1-2]。當(dāng)超聲波在生物組織中傳播時(shí)，除了波動(dòng)效應(yīng)外，不均勻的組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)還會(huì)對(duì)聲波引發(fā)復(fù)雜的聲散射、聲吸收和聲衰減效應(yīng)，并由此可以在深部組織中產(chǎn)生顯著的熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。生物組織中的超聲熱效應(yīng)主要是由部分聲能被組織吸收并轉(zhuǎn)化為熱量引起的，可導(dǎo)致深部組織溫度迅速升高，由此達(dá)到甲狀腺或腫瘤消融等治療目的。而醫(yī)學(xué)超聲相關(guān)的最關(guān)鍵的超聲機(jī)械效應(yīng)之一是一種稱為聲空化的過(guò)程。當(dāng)聲波在組織中傳播時(shí)，若聲壓超過(guò)一定閾值強(qiáng)度，血液或組織液中溶解的肉眼不可見(jiàn)的微小氣核會(huì)在超聲的負(fù)聲壓相緩慢膨脹生成空化氣泡，在超聲正聲壓相時(shí)這些空化泡會(huì)快速塌縮甚至破裂，在空化泡生成、振蕩乃至破裂的一系列動(dòng)力學(xué)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生聲微流、聲射流甚至沖擊波，并由此在微泡尺度的極小空間內(nèi)瞬間釋放高溫高壓，對(duì)組織或血管壁施加機(jī)械力學(xué)作用[3-5]。

天然環(huán)境中組織液或黏性血液中的含氣量極小，相應(yīng)的超聲空化閾值也在數(shù)兆帕之上[6]，對(duì)其在治療超聲領(lǐng)域的應(yīng)用造成了障礙。而超聲造影劑微氣泡的引入可以顯著降低空化閾值，并通過(guò)充當(dāng)空化核來(lái)增強(qiáng)空化強(qiáng)度，產(chǎn)生更強(qiáng)的治療效果（如基因/藥物轉(zhuǎn)染、血腦屏障開(kāi)放、肌骨治療等）[6-7]。但需要指出的是，如果參數(shù)選擇不恰當(dāng)，導(dǎo)致微泡聲空化強(qiáng)度過(guò)高時(shí)，劇烈的聲空化機(jī)械效應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致微血管破裂、溶血和DNA 斷裂[8-11]等不利影響，所有這些在臨床超聲診斷和治療中通常都是希望盡量避免發(fā)生的副作用。換言之，在臨床應(yīng)用中，希望可以選擇恰當(dāng)?shù)奈⑴莺统曌饔脜?shù)，在利用超聲造影劑微泡產(chǎn)生有效的聲空化治療效果的同時(shí)，盡力避免過(guò)強(qiáng)的聲空化作用對(duì)病灶周圍的正常組織產(chǎn)生過(guò)度損傷等副作用。

在前期工作中，對(duì)超聲熱效應(yīng)做了大量研究工作，發(fā)現(xiàn)組織損傷的程度取決于溫度的升高，而更高的溫度可通過(guò)提高聲壓、超聲中心頻率或延長(zhǎng)超聲輻照時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，關(guān)于微泡聲空化相關(guān)的影響因素的研究尚不明確，但前人的研究已經(jīng)提示了超聲造影劑微泡的聲散射和聲空化特性（如空化閾值和空化強(qiáng)度等）及其引發(fā)的生物效應(yīng)微泡的物理特性（如粒徑、濃度等）特征和相關(guān)聲學(xué)作用參數(shù)（如聲壓、脈沖寬度、脈沖重復(fù)頻率和作用時(shí)間等）緊密相關(guān)。因此，在本研究中，聚焦于2 種已經(jīng)獲得臨床應(yīng)用批準(zhǔn)的商用超聲造影劑微泡（Optison 和SonoVue），針對(duì)其空化閾值與微泡濃度和超聲脈沖寬度之間的關(guān)系開(kāi)展了系統(tǒng)研究。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究中采用的2 種超聲造影劑Optison（GE Health Care，美國(guó)）和SonoVue（Bracco，意大利）都是已經(jīng)獲得國(guó)際批準(zhǔn)的臨床常用造影劑微泡。其中，Optison 是由蛋白單層膜包裹氟化碳（C3F8）氣核形成的微氣泡，平均半徑約為2.0 μm。而SonoVue 則是由單層磷脂包裹六氟化硫（SF6）氣核形成的微氣泡，平均半徑同樣約為2.0 μm。根據(jù)制造商的建議，在實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備過(guò)程中，將輕輕搖晃未打開(kāi)的OptisonR小瓶以均勻混合其內(nèi)容物，在用注射器從試劑瓶中取出微泡樣品之前，先用無(wú)菌的18 號(hào)針頭對(duì)試劑瓶進(jìn)行通氣，隨后用另一支18 號(hào)針頭將不同體積的Optison 微泡溶液提取到注射器，利用生理鹽水將微泡懸浮液稀釋成初始濃度約為2～5×108個(gè)/mL 微泡溶液待用。對(duì)于SonoVue微泡，則首先用無(wú)菌的18 號(hào)針頭對(duì)試劑瓶進(jìn)行通氣，然后按照制造商建議向試劑瓶中注入5 mL 生理鹽水對(duì)微泡進(jìn)行初步稀釋后以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)微泡濃度根據(jù)制造商數(shù)據(jù)應(yīng)約為5～8×108個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)前，經(jīng)Malvern 顆粒尺寸分析儀（Mastersizer 2000，Malvern Instruments 有限公司，Worcestershire，UK）測(cè)量Optison和SonoVue 微泡的平均直徑分別約為2.2±0.3 μm 和1.9±0.2 μm。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

如圖1 所示，所有實(shí)驗(yàn)都是在充滿脫氣水的亞克力水槽中進(jìn)行的，用于信號(hào)激勵(lì)的1.1 MHz 單陣元聚焦換能器與用于空化信號(hào)接收的5 MHz 單陣元平面換能器（Sonic Concepts，Woodinville，美國(guó)）正交固定在水槽的2 個(gè)相鄰側(cè)壁上。將吸聲橡膠放置在與聚焦轉(zhuǎn)換器相對(duì)的水槽端壁上，以最大限度地減少聲反射對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果的影響。在超聲激勵(lì)系統(tǒng)中由信號(hào)發(fā)生器（33120A，Hewlett Packard，美國(guó)）提供驅(qū)動(dòng)信號(hào)，經(jīng)50 dB 功率放大器（A-150，ENI，美國(guó)）放大后驅(qū)動(dòng)1.1 MHz 聚焦換能器來(lái)激勵(lì)造影劑微泡產(chǎn)生超聲空化活動(dòng)。而5 MHz 平面換能器（直徑為1.2 cm）則被用于被動(dòng)采集微泡聲空化行為產(chǎn)生的聲散射信號(hào)，所采集的信號(hào)數(shù)據(jù)隨后通過(guò)數(shù)字示波器 （LC 334AM，Lecroy，美國(guó)）顯示后存儲(chǔ)于電腦中用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。整套實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由LabView 軟件（National Instruments，美國(guó)）控制運(yùn)行。

圖1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)示意圖

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

造影劑微泡空化行為產(chǎn)生的聲散射信息經(jīng)由以5 MHz 平面換能器為主的被動(dòng)空化探測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)后，其空化閾值可通過(guò)對(duì)散射信號(hào)進(jìn)行快速傅里葉變換（Fast Fourier Transform，F(xiàn)FT）后獲得的特征頻譜加以量化定征[12]。簡(jiǎn)言之，對(duì)于每個(gè)樣本產(chǎn)生的空化散射信號(hào)采集1 000 個(gè)波形序列，采樣率為25 MHz，單個(gè)波形采樣時(shí)間為200 μs。對(duì)每個(gè)信號(hào)做FFT 后取其平均譜。如圖2 所示，以聲壓為0.05 MPa 的聲信號(hào)激勵(lì)下的生理鹽水中采集到的散射信號(hào)譜（細(xì)虛線）的FFT 平均值為參考底線，而微泡樣品的空化聲壓閾值則被定義為其FFT 譜線平均強(qiáng)度高于參考底線10%（如圖2 中針對(duì)特定濃度Optison 樣品在0.18 MPa 驅(qū)動(dòng)聲壓下測(cè)量所得的粗實(shí)線所示）。

圖2 由空化微泡聲散射頻率確定其空化閾值

本研究中主要針對(duì)2 種超聲造影劑微泡開(kāi)展了系列實(shí)驗(yàn)。

1）超聲脈沖寬度對(duì)微泡空化閾值的影響：采用4個(gè)不同超聲脈沖寬度（2、5、10 或20 周期）來(lái)研究特定不同濃度條件下造影劑微泡的空化閾值。對(duì)于不同的脈沖寬度，可通過(guò)調(diào)整脈沖重復(fù)頻率PRF 來(lái)確保超聲輻照總時(shí)間保持不變（即脈沖長(zhǎng)度分別為2、5、10 或20 個(gè)周期時(shí)，PRF 從500、200、100 變化至50 Hz）。超聲驅(qū)動(dòng)聲壓幅度則由0.05 MPa 逐步提升至0.5 MPa。對(duì)于每個(gè)參數(shù)條件下的微泡樣本進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)量。

2）微泡濃度對(duì)其空化閾值的影響：在一定的脈沖長(zhǎng)度和PRF 下，針對(duì)不同濃度的造影劑微泡樣品（體積比為0.1%、0.5%、1%、2.5%或5%）測(cè)量其空化聲壓閾值。超聲驅(qū)動(dòng)聲壓幅度則由0.05 MPa 逐步提升至0.5 MPa。對(duì)于每個(gè)參數(shù)條件下的微泡樣本進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)量。

2 結(jié)果

2.1 Optison 微泡的空化聲壓閾值

圖3顯示了Optison 造影劑微泡在不同體積濃度和超聲脈沖寬度條件下測(cè)得的空化聲壓閾值。由圖3可知，對(duì)于特定體積比的Optison 微泡，其空化閾值將隨著激勵(lì)超聲脈沖寬度的增加而降低，例如微泡體積比為1%時(shí)，若脈沖寬度從2 個(gè)周期增長(zhǎng)到20 個(gè)周期時(shí)，其空化聲壓閾值從大約0.17 MPa 下降到約0.1 MPa。同時(shí)，在特定脈沖寬度條件下，高濃度微泡將具有更低的空化閾值。但也要注意到，當(dāng)微泡體積濃度大于2.5%時(shí)，其空化聲壓閾值受脈沖寬度的影響將變低。

圖3 Optison 造影劑微泡的空化聲壓閾值測(cè)量結(jié)果

2.2 SonoVue 微泡的空化聲壓閾值

圖4則顯示了SonoVue 造影劑微泡在不同體積濃度和超聲脈沖寬度條件下測(cè)得的空化聲壓閾值。由圖4 可知，總體而言，SonoVue 微泡的空化聲壓閾值略小于Optison 微泡。對(duì)于特定體積比的SonoVue 微泡，類似于Optison 微泡，其空化閾值將隨著激勵(lì)超聲脈沖寬度的增加而下降。但對(duì)于特定脈沖寬度的激勵(lì)信號(hào)，SonoVue 微泡的空化閾值隨其體積比的變化較小，尤其是當(dāng)脈沖寬度大于10 個(gè)周期時(shí)，不同濃度的SonoVue 微泡的空化聲壓閾值幾乎趨近一定的穩(wěn)定值（約0.8～1.0 MPa）。

圖4 SonoVue 造影劑微泡的空化聲壓閾值測(cè)量結(jié)果

3 討論

本研究針對(duì)2 種商用超聲造影劑微泡，研究其空化聲壓閾值隨微泡體積比濃度和激勵(lì)超聲脈沖寬度的變化情況。總體而言，2 種微泡的空化聲壓閾值將隨其體積比濃度或激勵(lì)超聲脈沖寬度的增加而下降。這是因?yàn)轶w積比濃度較大的微泡溶液中含有更多的空化氣核，而激勵(lì)超聲脈沖寬度增加則對(duì)應(yīng)于驅(qū)動(dòng)聲能量的提高，由此導(dǎo)致微泡空化行為更容易發(fā)生。

可以理解的是，對(duì)于一定體積比濃度條件下的超聲造影劑微泡溶液，其空化聲壓閾值將隨著激勵(lì)超聲脈沖寬度的增加而減小。應(yīng)注意到，由于激勵(lì)信號(hào)源需要一定的起振時(shí)間來(lái)穩(wěn)定其輸出波形，因此，對(duì)于短脈沖信號(hào)（例如2 或5 個(gè)周期），焦點(diǎn)處輸出波形的實(shí)際振幅常常小于長(zhǎng)脈沖信號(hào)（如10 或20 個(gè)周期）獲得的穩(wěn)定振幅。因此，短脈沖信號(hào)可能不足以在較短時(shí)間內(nèi)向微泡溶液中輸運(yùn)足夠的聲能量來(lái)促使微泡產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化行為。

同時(shí)要注意到，與Optison 微泡相比，SonoVue 微泡的空化聲壓閾值相對(duì)較小，且隨其體積比濃度的變化幅度更小。這是因?yàn)镺ptison 微泡采用蛋白包膜，而SonoVue 微泡則采用厚度更小、硬度更低的單層磷脂包膜，且在特定體積比濃度下，單位體積中含有的SonoVue 微泡的實(shí)際數(shù)目稍高于Optison 微泡（根據(jù)制造商數(shù)據(jù)，SonoVue 微泡初始濃度為5～8×108個(gè)/mL，而Optison 微泡的初始濃度為2～5×108個(gè)/mL），因此更容易被低強(qiáng)度的超聲信號(hào)激發(fā)，由此產(chǎn)生較低的空化閾值和更穩(wěn)定的空化行為。實(shí)際上，前人的研究結(jié)果也表明，外殼較薄的造影劑微泡將具有較低的空化聲壓閾值[5]，本研究的觀測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了前人的實(shí)驗(yàn)觀察。

4 結(jié)論

本文的研究結(jié)果說(shuō)明了超聲造影劑微泡的空化聲壓閾值將同時(shí)受到微泡性質(zhì)（如濃度）和驅(qū)動(dòng)超聲特性（如脈沖寬度）的影響?？傮w而言，與前人的觀察結(jié)果類似，具有較薄外殼的SonoVue 微泡具有更低的空化閾值，而且微泡的空化閾值可以通過(guò)增加空化氣核（如提高微泡體積比濃度）或增強(qiáng)單位時(shí)間內(nèi)的激勵(lì)超聲能量（如增加超聲脈沖寬度）來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，選擇更為恰當(dāng)?shù)脑煊皠┪⑴莼虺暭?lì)參數(shù)來(lái)調(diào)控微泡空化閾值和強(qiáng)度，滿足特定的診療需求。