聶洪辛，李毓敏，龐凱悅，柴沙駝，4，申迪，曾子銘，廖揚(yáng)，王迅，薛斌，劉書(shū)杰，王書(shū)祥，4*，楊英魁，4*

（1. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3. 青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，青海 西寧 810016；4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部青藏高原放牧牦牛藏羊動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼草料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

牦牛被稱(chēng)作“高原之舟”，是青藏高原特有牛種［1］。我國(guó)現(xiàn)有牦牛1400 萬(wàn)頭左右，約占世界牦?？倲?shù)的95%以上，主要分布在青海、西藏、甘肅等高海拔地區(qū)，其中青海490 萬(wàn)頭左右，約占全國(guó)牦?？倲?shù)的40%，居全國(guó)首位［2-4］。目前牦牛的飼養(yǎng)方式仍以長(zhǎng)年放牧為主，致使牦牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入不足，而通過(guò)調(diào)整飼糧中精粗比可以滿足牦牛的營(yíng)養(yǎng)需要［5］。在飼糧精粗比正常情況下，腸道內(nèi)的菌群可以和宿主及外部環(huán)境建立動(dòng)態(tài)的生態(tài)平衡，但當(dāng)飼糧中精料過(guò)高或過(guò)低時(shí)［6-7］，則可能導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生紊亂［8-9］。腸道菌群能夠抵抗外源致病因子的入侵，協(xié)助宿主免疫系統(tǒng)消滅外病原微生物，在維持腸道健康方面發(fā)揮著重要作用。健康的反芻動(dòng)物腸道菌群中多以厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，而優(yōu)勢(shì)菌屬的差異較大［10］。反芻動(dòng)物的腸道菌群大多集中在結(jié)腸，對(duì)糞便菌群和結(jié)腸內(nèi)容物菌群的結(jié)構(gòu)比較后發(fā)現(xiàn)，糞便菌群與腸道菌群有許多相似之處［11-13］，所以糞便菌群狀況可以間接地反映出腸道菌群的基本情況。因此，本試驗(yàn)擬采用16S rDNA 高通量測(cè)序，研究不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，旨在為牦牛的合理飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2019 年9-12 月在青海省貴南縣老扎西養(yǎng)殖基地進(jìn)行。選取24 頭體重相近、健康的3 歲公牦牛隨機(jī)分成2 組，分別飼喂低精粗比飼糧（35∶65， C35組）和高精粗比飼糧（65∶35， C65組），每組3 個(gè)重復(fù)。預(yù)試期15 d，正試期90 d，共計(jì)105 d。參考我國(guó)肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T815-2004）進(jìn)行試驗(yàn)飼糧設(shè)計(jì)［14］，8：00 和17：00 進(jìn)行飼喂，試驗(yàn)期間所有牦牛自由飲水。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分占比見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets

1.2 樣品采集

在飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后從兩組中各隨機(jī)抽取6 頭牦牛收集糞便。用直腸糞便提取法收集糞便樣品置于2 mL 凍存管并暫存于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存待測(cè)。

1.3 DNA 提取、測(cè)序及分析

由北京奧維森基因科技有限公司對(duì)提取的樣品進(jìn)行16S rDNA 高通量測(cè)序。采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyl trimethyl ammonium bromide， CTAB）［15］，又稱(chēng)西曲溴銨法，從糞便樣本中提取DNA。使用條形碼特異引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和806R（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）來(lái)擴(kuò)增16S rRNA 基因的不同區(qū)域（16S V3-V4）。使用TruSeq DNA PCR-Free Libraray Preparation Kit 建庫(kù)試劑盒（美國(guó)Illumina 公司）進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，并經(jīng)過(guò)Qubit 和PCR（qPCR）定量和檢驗(yàn)合格后，使用Illumina NovaSeq 6000 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)得到的原始數(shù)據(jù)利用Trimmomatic v0.36 軟件、Pear v0.9.6 軟件進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，把相似性大于97%的優(yōu)質(zhì)序列篩選出來(lái)，計(jì)算操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU），最后對(duì)OTU 聚類(lèi)、物種分類(lèi)、多樣性指數(shù)和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），同時(shí)用LSD 法進(jìn)行差異顯著性比較，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著，結(jié)果均以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤差（standard error of mean，SEM）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便菌群豐富度與多樣性的影響

2 組共產(chǎn)生1702 個(gè)OTU，其中C35組產(chǎn)生254 個(gè)OTU，C65組產(chǎn)生175 個(gè)OTU，兩組共有的OTU 數(shù)目為1273 個(gè)，占總OTU 數(shù)目的74.79%（圖1）。隨著測(cè)序深度的增加，C35與C65組的糞便細(xì)菌稀釋曲線呈逐漸平緩的趨勢(shì)（圖2），這表明測(cè)序程度可以覆蓋樣品中大多數(shù)微生物菌群。通過(guò)Alpha 多樣性分析可知（表2），C35組的物種數(shù)、Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)顯著高于C65組（P＜0.05）。通過(guò)主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis， PCoA）可知（圖3），C35組與C65組牦牛糞便菌群結(jié)構(gòu)具有明顯差異。

圖1 OTU 韋恩圖Fig.1 OTU venn diagram

圖2 糞便細(xì)菌稀釋曲線Fig.2 Fecal bacterial dilution curve

圖3 細(xì)菌區(qū)系主坐標(biāo)分析Fig.3 PCoA of bacterial flora

2.2 不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便菌群組成門(mén)水平的影響

在門(mén)水平（表3）上，牦牛糞便中主要的細(xì)菌門(mén)有厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)。其中，C35組牦牛糞便中髕細(xì)菌門(mén)和藍(lán)藻菌門(mén)極顯著高于C65組（P＜0.01），放線菌門(mén)顯著高于C65組（P＜0.05）；C65組牦牛糞便中擬桿菌門(mén)、螺旋體門(mén)顯著高于C35組（P＜0.05）；其他菌門(mén)組間無(wú)顯著差異。

表3 不同精粗比對(duì)牦牛糞便菌群組成的影響Table 3 Effects of different concentrate to forage ratio on microflora composition of yak feces

2.3 不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便菌群組成屬水平的影響

在屬水平上，牦牛糞便中主要的細(xì)菌屬是UCG-005（表4）。其中，C35組牦牛糞便中毛螺菌科_NK3A20群顯著高于C65組（P＜0.05）；C35組牦牛糞便中未培養(yǎng)的屬、瘤胃球菌屬極顯著高于C65組（P＜0.01），C65組未培養(yǎng)細(xì)菌屬、擬普雷沃氏菌屬、密螺旋體屬顯著高于C35組（P＜0.05）；其他菌屬組間無(wú)顯著差異。

表4 不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便菌群組成的影響Table 4 Effects of different concentrate to forage ratio on bacterial community composition of yak feces

2.4 不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便菌群代謝途徑及功能的影響

在KEGG2 水平上，糞便樣本中有20 個(gè)相對(duì)豐度值高的基因家族（相對(duì)豐度＞0.10%）。在這20 個(gè)基因家族中，C65組復(fù)制和修復(fù)、翻譯、核苷酸代謝、其他次生代謝物的合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡的基因家族相對(duì)豐度極顯著高于C35組（P＜0.01）（表5）。

表5 不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便菌群KEGG 二級(jí)代謝通路的影響Table 5 Effects of diets with different concentrate to forage ratios on KEGG secondary metabolic pathway of fecal bacteria in yaks

3 討論

3.1 不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便細(xì)菌豐富度與多樣性的影響

16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地對(duì)牦牛糞便菌群結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析，其中Alpha 多樣性分析可以測(cè)定微生物群落的豐富度與多樣性，需要測(cè)定的指標(biāo)包括Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)。Chao1 指數(shù)越大則說(shuō)明菌群豐富度越高，Shannon 指數(shù)越大則說(shuō)明菌群多樣性越高［16］。劉飛鴻［17］研究了不同精粗比對(duì)肥胖空懷母牛腸道菌群多樣性的影響，結(jié)果表明：低精料組母牛腸道菌群多樣性顯著高于高精料組。Pang 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼糧精粗比的提高，牦牛糞便微生物菌群的豐富度和多樣性呈顯著性降低。在本試驗(yàn)中，Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)隨精料的增加而顯著降低，與上述研究結(jié)果一致，說(shuō)明飼喂高精粗比飼糧（65∶35）會(huì)降低牦牛糞便菌群的豐富度與多樣性。

3.2 不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便細(xì)菌結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)于反芻動(dòng)物微生物細(xì)菌多樣性及結(jié)構(gòu)特性，已有研究證明厚壁菌門(mén)及擬桿菌門(mén)在反芻動(dòng)物瘤胃和糞便微生物中處于優(yōu)勢(shì)菌門(mén)［19-21］，其原因是在反芻動(dòng)物飼糧中，粗飼料占比通常達(dá)70%及以上，是瘤胃微生物的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，而擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)在反芻動(dòng)物胃腸道粗纖維的消化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。放線菌門(mén)或變形菌門(mén)的豐度值次于擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)［22-23］。本研究發(fā)現(xiàn)，C35組與C65組牦牛糞便微生物菌群中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度占整個(gè)菌門(mén)的72.08%，擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度占整個(gè)菌門(mén)的21.44%，而放線菌門(mén)的相對(duì)豐度占整個(gè)菌門(mén)的1.97%，結(jié)果與上述一致。厚壁菌門(mén)主要參與結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解，而擬桿菌門(mén)是非纖維物質(zhì)降解過(guò)程中最重要的菌門(mén)，這兩種菌在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝中起著至關(guān)重要的作用［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，C65組牦牛糞便中擬桿菌門(mén)顯著高于C35組，表明飼喂高精粗比飼糧促進(jìn)了牦牛糞便中非纖維降解菌的增殖。本研究結(jié)果表明，C65組牦牛糞便中螺旋體門(mén)豐度顯著高于C35組，其原因?yàn)槁菪w門(mén)是產(chǎn)酸菌，主要以碳水化合物為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，能將碳水化合物轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的揮發(fā)性脂肪酸［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，C35組牦牛糞便中髕細(xì)菌門(mén)極顯著高于C65組。但目前對(duì)該菌的作用還不了解［27］，有待進(jìn)一步研究。藍(lán)藻菌門(mén)為化能自養(yǎng)菌，其以二氧化碳為碳源，通過(guò)氧化氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素為自身提供能量，來(lái)合成有機(jī)物質(zhì)［28-29］。本研究發(fā)現(xiàn)，C35組牦牛糞便中藍(lán)藻菌門(mén)極顯著高于C65組。而反芻動(dòng)物主要以粗飼料為食，糞便富集藍(lán)藻菌門(mén)可能與飼糧組成有關(guān)。放線菌門(mén)隸屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，大多是腐生菌，可引起腸道疾病［30］。在本研究中，C35組牦牛糞便中放線菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著高于C65組，表明飼喂高精粗比飼糧（65∶35）可能會(huì)影響腸道健康。

反芻動(dòng)物糞便中發(fā)現(xiàn)數(shù)量最多的細(xì)菌屬是瘤胃球菌科［31-32］。但在本試驗(yàn)中，牦牛糞便中的細(xì)菌是以UCG-005 屬為主，這與Caporaso 等［31］和Meale 等［32］的結(jié)果有差異，可能是由于牦牛品種的特殊性、飼糧精粗比、飼養(yǎng)環(huán)境不同導(dǎo)致。本研究發(fā)現(xiàn)，C35組牦牛糞便中瘤胃球菌屬的豐度極顯著高于C65組。而反芻動(dòng)物胃腸道中的瘤胃球菌屬通過(guò)分解宿主消化系統(tǒng)的纖維素來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)，瘤胃球菌屬與纖維素酶和半纖維素酶［33-34］通過(guò)協(xié)同作用將飼糧中的纖維轉(zhuǎn)化為宿主所需的營(yíng)養(yǎng)素。結(jié)果表明，飼喂低精粗比飼糧可提高牦牛糞便中瘤胃球菌屬豐度值。毛螺菌科能夠降解飼料中的纖維素和半纖維素，并參與機(jī)體能量代謝［35-36］。本研究中，C35組牦牛糞便中毛螺菌科_NK3A20 群菌屬的豐度顯著高于C65組，表明飼糧中精飼料的提高會(huì)降低牦牛糞便中毛螺菌科的豐度值。在本試驗(yàn)中，C65組牦牛糞便中密螺旋體屬顯著高于C35組。但目前對(duì)密螺旋體屬的作用尚不清楚。擬普雷沃氏菌屬會(huì)產(chǎn)生大量的琥珀酸及乙酸，有利于維持腸道穩(wěn)態(tài)［37］。在本試驗(yàn)中，C65組牦牛糞便中擬普雷沃氏菌屬顯著高于C35組，這表明飼喂高精粗比飼糧更有利于牦牛的腸道健康。

3.3 不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便菌群代謝途徑及功能的影響

通過(guò)PICRUSt 軟件可以預(yù)測(cè)微生物菌群的代謝通路，對(duì)牦牛糞便微生物菌群進(jìn)行KEGG 通路的功能性注釋后可以得出，功能通路主要富集于碳水化合物代謝、輔助因子和維生素代謝、氨基酸代謝、萜類(lèi)和多酮類(lèi)代謝、復(fù)制和修復(fù)、能量代謝，這些通路對(duì)反芻動(dòng)物胃腸道微生物群落的生長(zhǎng)繁殖起到了重要作用［38］。能量是飼料的重要組成部分，碳水化合物是牦牛的主要能量來(lái)源［39］，氨基酸對(duì)牦牛體內(nèi)的生理生化功能起調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)其生長(zhǎng)，改善生產(chǎn)性能［40］，并且氨基酸代謝與飼糧組成緊密相關(guān)［41］。由此可以看出，在牦牛的生長(zhǎng)過(guò)程中，碳水化合物代謝與氨基酸代謝尤為重要。核苷酸代謝多數(shù)以輔酶或輔助因子形式存在，可以參與動(dòng)植物的能量代謝［42］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C65組核苷酸代謝、復(fù)制和修復(fù)、翻譯、其他次生代謝物的合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡的基因家族相對(duì)豐度極顯著高于C35組。本研究推測(cè)，飼糧中精粗比為65∶35 有助于牦牛能量代謝通路的上調(diào)。

4 結(jié)論

通過(guò)研究不同精粗比飼糧對(duì)牦牛糞便微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響得出，飼糧中精粗比會(huì)影響牦牛糞便菌群的多樣性與豐富度。且飼喂精粗比為65∶35 的飼糧可以促進(jìn)牦牛糞便中非纖維降解菌的增殖，提高擬普雷沃氏菌屬的豐度值，但抑制毛螺菌科的生長(zhǎng)。