弓形蟲529重復(fù)序列檢測方法的比較

殷位剛，朱銀銀，2，楊佩才，張洪英，2*

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210003；2. 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 211166)

弓形蟲又稱剛地弓形蟲，是一種人畜共患的細胞內(nèi)原生動物，廣泛存在于全球各地，可寄生于幾乎所有溫血動物[1]。作為一種人畜共患寄生原蟲，弓形蟲因其在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)上的重要性而受到廣泛研究。弓形蟲可通過糞口途經(jīng)或經(jīng)胎盤傳播。作為終末宿主，貓科動物是唯一已知的存在弓形蟲有性繁殖階段并將感染性卵囊釋放到環(huán)境中，而弓形蟲的三個階段，速殖子、緩殖子和卵囊對所有宿主都具有傳染性。人、貓等溫血動物，作為中間宿主消化卵囊時，卵囊變?yōu)樗僦匙舆M入快速復(fù)制階段形成急性感染，引起弓形蟲病。因為免疫系統(tǒng)不會消除速殖子，其中一些進入緩慢生長階段的慢殖子儲存在中間宿主的大腦、肌肉、心臟和其他組織中[1-3]。

弓形蟲病是最常見的人畜共患疾病，影響到世界三分之一的人口，并造成世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題[1-3]。目前報道的，用于弓形蟲感染的全球監(jiān)測技術(shù)可分為非DNA型和DNA型。非DNA檢測包括血清學(xué)測試，如染色測試(DT)、間接熒光抗體測試(IFAT)、乳膠凝集試驗(LAT)、改良凝集試驗(mend agglutination test，MAT)、間接血凝試驗(indirect hem agglutina-tion test，IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。基于DNA的檢測包括常規(guī)PCR、套式PCR、熒光定量PCR(qPCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)和重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)[2-4]。非DNA檢測方法中抗體檢測不能區(qū)分既往感染和當(dāng)前感染；病原形態(tài)學(xué)檢測雖然能區(qū)分既往感染和當(dāng)前正在感染，但需要對弓形蟲卵囊等形態(tài)學(xué)測試熟悉的專業(yè)人員，而且操作較為復(fù)雜。DNA檢測方法具有快速和操作簡單的特點，使現(xiàn)場快速檢測成為可能[2-4]。

第一種檢測弓形蟲DNA的PCR方法，是1989年建立的靶向于B1基因[5]。據(jù)報道弓形蟲529重復(fù)序列(Rep-529)，重復(fù)次數(shù)為10至100次，故靶標(biāo)Rep-529比無重復(fù)的B1基因更敏感[6-7]。多拷貝ITS-1和18S rDNA也被用作一些研究中的靶標(biāo)，顯示出類似于B1基因的敏感性[8-10]。經(jīng)過優(yōu)化和改良的套式PCR進一步提高了檢測靈敏度和特異性，靶標(biāo)Rep-529的檢測限低于B1的8 000倍，為640 fg DNA，而B1套式PCR的檢測限為5.12 pg[11]?？傊壳暗膱蟮辣砻?，針對Rep-529重復(fù)片段的DNA檢測最敏感。

本研究比較了針對弓形蟲Rep-529的qPCR和LAMP檢測法，篩選出較優(yōu)檢測方法，并初步應(yīng)用于寵物貓糞便中弓形蟲卵囊DNA檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

美國MP公司的土壤微生物基因組抽提試劑盒(FastDNATMSPIN KIT，6560-200)，均質(zhì)器(FastPrep-16)購自美國；探針法熒光定量PCR預(yù)混液(QN114、QV113)購自南京諾維贊生物科技有限公司；GspSSD 2.0等溫Master mix試劑盒購自英國Optigene公司。Genie Ⅱ等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)及相配套的軟件系統(tǒng)Genie Explorer為英國Optigene公司產(chǎn)品；QuantStudioTM5實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)系美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計

本研究選擇Rep-529基因片段(GenBank登錄號DQ779189)作為靶基因，分別設(shè)計相應(yīng)的引物，見表1。所有引物、探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物探針序列和靶標(biāo)

1.3 Rep-529質(zhì)粒合成

將含有Rep-529的弓形蟲基因片段構(gòu)建至pUC18載體上，經(jīng)過測序比對序列與DQ779189的相應(yīng)片段完全一致，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的甘油菌在對數(shù)生長期收集，用天根質(zhì)粒DNA提取試劑盒進行質(zhì)粒DNA提取。Qubit 3.0 測定質(zhì)粒質(zhì)量濃度。按照以下公式計算質(zhì)?？截悵舛?，該質(zhì)粒作為陽性對照。

拷貝濃度(copies/μL)=(6.02 ×1023×質(zhì)量濃度× 10-9)/(DNA 長度×660)

=(6.02×1023×35.3×10-9)/(3 218×660)

=1×1010copies/μL。

1.4 反應(yīng)體系和程序

1.4.1 qPCR反應(yīng)體系和程序

反應(yīng)體系：10 μL 2×探針法熒光定量PCR預(yù)混液(QN114或QV113)，0.6 μL 正、反向引物TGF和TGR(10 μmol/L)，0.8 μL引物探針TG-Probe(5 μmol/L)，5 μL DNA模板，最后加無酶水補齊至總反應(yīng)體積20 μL。

反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 50 s，40個循環(huán)。

1.4.2 LAMP反應(yīng)體系和程序

反應(yīng)體系：15 μL GspSSD 2.0 等溫Mastermix，5 μL LAMP引物混合液(FIP∶BIP∶F3∶B3∶LF∶LB=1.6 μmol/L∶1.6 μmol/L∶0.8 μmol/L∶0.8 μmol/L∶0.4 μmol/L∶0.4 μmol/L)和5 μL DNA模板。

反應(yīng)程序：LAMP-2021、LAMP-529-11和LAMP-5293均為65 ℃，1 h ；LAMP-RE為63 ℃，1 h。

1.5 檢測限比較

用梯度稀釋的質(zhì)粒作為模板，各取5 μL不同濃度的重組質(zhì)粒進行qPCR和 LAMP 檢測，確定兩種方法的檢測限，以無菌水作陰性對照。

1.6 交叉反應(yīng)測試

用實驗室保存的隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲和旋毛蟲DNA以及大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、細小病毒DNA作為模板，進行擴增，同時以質(zhì)粒陽性對照和無酶水作陰性對照。

1.7 樣本檢測

39只來自南京市家貓，隨機收集沙盤中貓糞，或者采肛拭子，每只貓用一套采樣工具，一個干凈采樣袋，袋裝后封條密閉，分別編號，當(dāng)天檢測。

仔細將貓砂與糞便分離，取糞便或者肛拭子進行DNA提取。同時以無酶水作為提取過程陰性對照，經(jīng)過鏡檢無任何可疑原蟲樣蟲卵或者卵囊的貓糞DNA作為樣本DNA陰性對照。采用美國MP公司的土壤微生物基因組抽提試劑盒(FastDNATMSPIN KIT，6560-200)提取總DNA并純化，最后加100 μL洗脫液洗脫DNA待檢[15]。

1.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)錄入、計算和相關(guān)性分析。方法學(xué)以最小檢出限或者相關(guān)性進行描述，各方法的臨床樣本檢測效果用百分比進行描述性表達。檢出率比較用卡方檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異性。

2 結(jié)果

2.1 等溫擴增檢測限比較

本研究合成Rep-529質(zhì)粒用于4種LAMP的最低檢測限比較。等溫擴增529-11組檢測限最低，為103copies/μL(圖1A)，其次為文獻報道的RE引物組，檢測限為104copies/μL(圖1B)，529-3(圖1C)和2021(圖1D)引物組的檢測限最高，均為105copies/μL。

A. LAMP-529-11；B. LAMP-RE；C. LAMP-529-3；D. LAMP-2021。

A. QN114；B. QV113。

2.2 qPCR檢測限測試及線性范圍計算

以Rep-529為靶標(biāo)的qPCR(TGP)是文獻報道的引物探針(表1)，本研究對比了QN114和QV113兩種qPCR體系，二者均可以檢出104copies/μL，但103copies/μL檢測Ct值與陰性水對照結(jié)果無差異，即最低檢測限為104copies/μL。圖2表明二者均在104～106copies/μL之間獲得較好的線性檢測關(guān)系，為線性檢測范圍(圖2)。以QN114體系的梯度相關(guān)性(R2=0.991 8)稍優(yōu)于QV113體系的梯度相關(guān)性(R2=0.983 4)。

2.3 交叉反應(yīng)測試

以保存的病原DNA作為模板，進行擴增，同時設(shè)定質(zhì)粒陽性對照和水陰性對照。結(jié)果顯示，加了隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、旋毛蟲、大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌或細小病毒DNA的擴增與水對照一致，說明隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、旋毛蟲、大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌或細小病毒DNA沒有額外的擴增，即沒有交叉反應(yīng)。

2.4 樣本檢測

以檢測限最低的LAMP法529-11引物組進行樣本檢測。以鏡檢陰性的貓糞和無酶水提取的DNA擴增結(jié)果一致。對南京市39只家貓糞便或者肛拭子進行檢測，29份糞便中檢測出11份陽性(37.93%，11/29)；10份肛拭子中檢測出2份陽性(20.00%，2/10)，總檢出率為33.33%(13/39)。本研究中，39只家貓，有29份為沙盤中的糞便，分量充足，符合樣本檢測要求。但是，有10份肛拭子樣本，與糞便相比，分量較少，有的不足500 mg。糞便和肛拭子檢出率卡方檢驗進行統(tǒng)計學(xué)比較發(fā)現(xiàn)，二者無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.445)(表2)。

表2 LAMP-529-11對南京市寵物貓弓形蟲DNA的檢測結(jié)果

3 討論

目前，估計全球有200萬人感染弓形蟲[16]。感染途徑是通過食用含有弓形蟲速殖子、緩殖子的生肉或未煮熟的肉，攝入被卵囊污染的食物或水，或直接接觸貓糞便中脫落的卵囊。由于隨著貓的數(shù)量不斷增加，這可能會給人類以及其他動物帶來顯著的暴露風(fēng)險。野生動物臨床弓形蟲病病例已發(fā)現(xiàn)的有兔、松鼠、金絲雀、狐貍、鹿、熊、浣熊、狐猴、松鼠、猴子以及狨等[17]。

本研究以Rep-529重復(fù)片段為靶標(biāo)進行LAMP引物組的篩選。結(jié)果表明，等溫擴增529-11引物組檢測限最低，為103copies/μL，其次為文獻報道的RE引物組[13-14]和qPCR引物組[12]，檢測限為104copies/μL，529-3引物組和2021引物組的檢測限最高，均為105copies/μL。各引物組對隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、旋毛蟲、大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、細小病毒DNA均無交叉反應(yīng)，表明均具備弓形蟲DNA檢測特異性。此外，LAMP 529-11引物組對鏡檢陰性的貓糞DNA也無交叉反應(yīng)，進一步表明該方法具備Rep-529 DNA檢測特異性。用該引物組對南京市家養(yǎng)寵物貓的糞便或者肛拭子中弓形蟲Rep-529 DNA進行檢測，寵物貓29份糞便中檢出11份陽性(37.93%，11/29)；10份肛拭子中檢出2份陽性(20.00%，2/10)，總檢出率為33.33%(13/39)。該感染率遠遠高于文獻報道的其他動物的弓形蟲感染率。李珂等[18]檢測云南省家禽中弓形蟲抗體陽性率為4.48%；李培德等[19]檢測溫州市犬弓形蟲抗體陽性率為13.39%；劉麗婭等[20]檢測烏魯木齊地區(qū)犬弓形蟲病血清抗體陽性率介于7%～25%之間；蔡為民等[21]在揚州地區(qū)山羊未發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染；陳小麗[22]發(fā)現(xiàn)，福州動物園圈養(yǎng)野生動物12種(21只)哺乳動物感染弓形蟲；陳曉雨等[23]報道上海和廣東豬肉中弓形蟲檢出率為4.07%，上海地區(qū)檢出率(6.32%)顯著高于廣東(1.37%)。

本研究在LAMP引物組中篩選出529-11為檢出限最低引物組，但是LAMP引物組均未獲得檢測時間與質(zhì)粒模板梯度之間較好的線性關(guān)系(結(jié)果未展示)。雖然文獻報道的qPCR檢出限高10倍，但獲得較好的線性范圍(圖2)，說明本研究的擴增體系下，qPCR有較好的定量關(guān)系，可以在線性范圍內(nèi)對弓形蟲DNA進行定量檢測。若用LAMP進行定量檢測，還需進一步對擴增體系進行優(yōu)化。

本研究的不足之處：其一為檢測樣本數(shù)量不多；其二為沒有檢測流浪貓的弓形蟲感染情況。將來有條件還可以擴大樣本量進行更大范圍的檢測。在有限數(shù)量的檢測中，用本研究篩選的LAMP法在南京市寵物貓中已發(fā)現(xiàn)有33.33%的貓在排出卵囊，對環(huán)境和人類有較大的潛在污染和傳染風(fēng)險。雖然寵物貓接種疫苗的比率很高，但是仍然有比較高的弓形蟲感染率，這可能與多方面因素有關(guān)。其一，貓既是弓形蟲的終末宿主，又是中間宿主，自身可以形成完整的生活史，也就是說，貓感染了弓形蟲，排出卵囊，污染環(huán)境，還會反復(fù)感染；其二，幾乎所有的脊椎動物都是弓形蟲的中間宿主，如果貓排出的卵囊污染了環(huán)境，人和其他動物被感染，如老鼠等，這些動物又被貓食入，貓再次被感染；其三，貓排出的卵囊污染貓的食物，貓食用被污染的食物后再次發(fā)生感染。本研究的樣本進行飽和鹽水或者糖水漂浮后也用傳統(tǒng)鏡檢進行了檢測，但是因為對弓形蟲卵囊沒有鏡檢經(jīng)驗，而且是當(dāng)天檢測，即使看到大小、結(jié)構(gòu)疑似弓形蟲卵囊的樣本，仍不能確定。下一步將考慮進行必要的純化或者孵育后進行孢子化卵囊的鑒定。

綜上，本研究篩選獲得靶向Rep-529重復(fù)片段的529-11引物組為快速、敏感、特異的LAMP引物組，可以在30 min內(nèi)有效對糞便中弓形蟲卵囊DNA進行等溫擴增。本次檢測家貓感染率高達33.33%，應(yīng)引起足夠重視。