蛋黃蛋白肽納米顆粒對姜黃素的包埋與遞送特性

梅鈺琪，高亞軒，楊韻儀，杜振亞，萬芝力，楊曉泉

（華南理工大學食品科學與工程學院，食物蛋白與膠體研究中心，廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點實驗室，廣東 廣州 510640）

姜黃素（curcumin，Cur）是一種主要存在于姜黃屬植物根莖中的天然二酮類化合物，具有多種生理功能，如抗菌、抗炎、抗氧化、清除自由基、保護心血管和抗癌等，因此被廣泛用于功能性食品的開發(fā)[1-5]。功能性食品中生物活性物質的有效性取決于其溶解性、穩(wěn)定性、吸收和生物利用度[2]，而Cur的溶解性較差，很難被小腸上皮細胞直接吸收，且其疏水性會導致其被外排系統(tǒng)排出，難以發(fā)揮應有的藥理效應[6]。此外，Cur分子的雙酮結構易發(fā)生互變異構，酚羥基則極易參與自由基反應，導致其分子結構在光、溫度、濕度等外界環(huán)境因素的影響下發(fā)生變化和降解[7]。以上問題極大地限制了Cur在醫(yī)藥、功能性食品和常規(guī)食品中的加工和應用。為了提高Cur的溶解性，同時實現(xiàn)Cur在制備、儲存和使用過程中活性的長期穩(wěn)定，研究人員采取了多種措施，包括包封技術、納米技術、化學修飾等手段[1,8-9]。相對于Cur的化學修飾，通過物理包埋構建的納米遞送體系具有綠色、安全的優(yōu)勢，在醫(yī)藥、食品加工領域中具有更廣泛的應用前景。

在過去的幾十年里，由于蛋白基納米顆粒無毒、可生物降解以及良好的生物相容性，被公認為是一種理想的遞送系統(tǒng)[10-12]。蛋白質是否可用于構建蛋白基納米載體，主要取決于其自身部分活性基團能否同生物活性物質通過非共價相互作用與Cur結合形成Cur納米顆粒，進而達到對疏水性活性物質輸送的目的[5,13]。到目前為止，已有廣泛的研究以食源性蛋白質作為載體制備復合Cur納米顆粒提高其水溶性和生物利用度，包括酪蛋白、乳清蛋白和大豆蛋白等水溶性蛋白，以及玉米醇溶蛋白、小麥醇溶蛋白等水不溶性蛋白[1,11,13-16]。蛋白基納米顆?？梢酝ㄟ^反溶劑沉淀和化學交聯(lián)等多種方法制備，但該過程涉及危險化學劑或有機溶劑的使用，在一定程度上限制了其在食品工業(yè)中的應用[17]。為了解決這一問題，有研究人員基于蛋白自組裝策略來制備Cur納米顆粒。蛋白質或亞基的自組裝過程受pH值、溫度、離子強度、濃度、溶劑介電常數(shù)等因素的影響，其自組裝形成各種有序納米結構是一個熱力學平衡過程，這是各種吸引和排斥相互作用之間微妙平衡的結果[14,18]。Pan Kang等[14]將Cur晶體溶解于pH 12.0的溶液，然后加入到質量分數(shù)2%酪蛋白酸鈉溶液中，強堿可以使酪蛋白酸鈉膠束解離，在攪拌過程中酪蛋白酸鈉的疏水性基團與Cur結合，再調節(jié)pH值至中性，解離的酪蛋白酸鈉又重新自組裝，形成復合納米顆粒。Wang Yuexi等[18]利用自組裝策略并以蛋清蛋白作為載體制備復合黃素納米顆粒，提高了Cur的水溶性、抗氧化能力及熱穩(wěn)定性。

蛋黃富含蛋白質和磷脂等活性物質，具有優(yōu)良的油-水界面吸附能力和乳狀液的抗聚結能力，促使其廣泛應用于蛋黃醬、沙拉醬和烘焙食品中[19-21]。蛋黃蛋白中非極性氨基酸和芳香氨基酸含量較高，占總氨基酸組成的40.63%，蛋白質C端含有芳香氨基酸或者序列中含有疏水性氨基酸的肽可能具有較高的兩親性自組裝能力和界面活性[22]。工業(yè)萃取脫磷脂和蛋黃油之后剩下的脫脂蛋黃粉蛋白含量較高，質量分數(shù)在50%～80%之間，但功能性質極差，幾乎不溶于水，無法直接應用于食品工業(yè)。當前研究主要集中在利用蛋白酶水解將脫脂蛋黃粉轉換為生物活性肽，研究其抗氧化、降血壓、抗癌等生理功能[19,23-25]，而關于其膠體特性的研究比較匱乏。本課題組前期研究證實了通過定向限制性酶解獲得的蛋黃蛋白肽（egg yolk peptide，EYP）可通過兩親性自組裝形成平均粒徑為25 nm的球形膠束狀納米顆粒，并將其作為界面穩(wěn)定劑制備出粒徑小于200 nm的皮克林納米乳液[26]。但目前還鮮見利用兩親性EYP來構建生物活性物質（如Cur）納米輸送體系的研究報道。在前期研究基礎上，本研究繼續(xù)利用胰蛋白酶水解脫脂蛋黃粉，得到的兩親性EYP在水相中可通過疏水相互作用自組裝成EYP膠束狀納米顆粒（egg yolk peptide micellar nanoparticles，EYPNs），通過調節(jié)pH值控制EYPNs的自組裝行為，進而構建EYPNs復合Cur納米顆粒輸送體系，以期擴大脫脂蛋黃粉在功能性納米膠體領域的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋黃蛋白（蛋白質量分數(shù)90.7%）由廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司提供的脫脂蛋黃粉（蛋白質量分數(shù)80.4%）通過交替3 次水洗（1∶5，m/V）和無水乙醇洗（1∶5，m/V）后凍干得到。

胰蛋白酶（250 U/mg） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Cur（生物試劑，純度98%） 上海源葉生物科技有限公司；預染中等分子質量標準蛋白Marker（10～180 kDa） 上海升正公司；預染超低分子質量蛋白質Marker（3.3～31.0 kDa） 北京索萊寶科技有限公司；尼羅紅和芘熒光探針（純度＞99%） 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

DELTA冷凍干燥機 德國Christ公司；L-8900全自動氨基酸分析儀、F-7000熒光分光光度計 日本Hitachi公司；Genesys 10S紫外分光光度計 美國Thermo公司；Minn-Sub Cell蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司；Nicolet Avatar 360傅里葉變換紅外光譜儀、原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM） 德國Bruker公司；X’pert Powde多位自動進樣X射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD） 荷蘭PANalytical公司；OCA20視頻光學接觸角測量儀 德國Dataphysics公司；Nano-ZS Zeta納米粒度儀 英國Malvern公司；SAXSess/PW3830小角度靜態(tài)光散射檢測器 美國Viscotek公司；JEM-2100F透射電子顯微鏡、JFC-1200場發(fā)射掃描電子顯微鏡（field emission-scanning electron microscope，F(xiàn)ESEM） 日本JEOL公司；TANKPE060純水機 法國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 EYPNs的制備

根據(jù)Du Zhenya等的方法[26]制備EYPNs。將1.1節(jié)中制得的蛋黃蛋白分散于去離子水中獲得質量分數(shù)為4%的蛋白懸浮液，使用1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH值至8.0。加入1%（以蛋白質量計）的胰蛋白酶，在40 ℃水浴鍋中攪拌2 h以充分水解，期間保持pH 8.0不變，酶解結束后調節(jié)pH值至7.0并沸水浴15 min以滅酶。水解樣品在8 000×g轉速下離心20 min，所得上清液過膜（0.65 μm）后，在4 ℃下透析（截留分子質量100 Da）48 h。最后，將樣品冷凍干燥并置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ捎贓YP在水相中具有很強的自組裝能力，當EYP的質量濃度高于其臨界膠束質量濃度（約0.1 mg/mL）時，就可以自組裝形成膠束EYPNs。

1.3.2 EYPNs-Cur的制備

通過pH值誘導共組裝法制備EYPNs-Cur。配制不同質量分數(shù)（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0 %）的EYPNs溶液，攪拌2 h后置于4 ℃冰箱水化過夜。使用2 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH值至12.0，加入一定量的Cur粉末，使其質量濃度為0.5 mg/mL，在避光條件下劇烈攪拌使Cur完全溶解，然后使用2 mol/L的HCl溶液將pH值調至7.0。在10 000 r/min下離心20 min除去不溶性顆粒后，將上清液通過0.45 μm的微孔濾膜進一步除去雜質，將其儲存于4 ℃冰箱或凍干成粉狀以供后續(xù)使用。在相同條件下配制單獨的0.5 mg/mL Cur溶液作為對照。

1.3.3 Cur的溶解度及包埋率測定

使用紫外分光光度法測定Cur的質量濃度及其包埋率。首先測定一系列質量濃度Cur標準品-無水乙醇溶液在426 nm波長處的吸光度，得到Cur的標準曲線方程為Y＝6.227 7X＋0.004 5（R2＝0.999）。吸取一定體積的EYPNs-Cur溶液于離心管中，加入5 倍體積的無水乙醇以萃取Cur，在渦旋器上充分振蕩后離心（10 000 r/min、20 min）。所得上清液經(jīng)無水乙醇適度稀釋后測定其426 nm波長處吸光度，以無水乙醇作為空白，對照組使用去離子水為空白。Cur溶解度用上清液中Cur的質量濃度表示。包埋率采用公式（1）計算。

式中：m為上清液中Cur質量/g；m0為Cur初始質量/g。

1.3.4 粒徑和Zeta電位測定

使用Nano-ZS Zeta納米粒度儀測定樣品的粒徑分布、Zeta電位和多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）。使用pH 7.0、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液將EYPNs-Cur液體樣品稀釋100 倍后進行測定。分散相折射率設置為1.42，連續(xù)相（磷酸鹽緩沖液）折射率設置為1.33，測試溫度為25 ℃。

1.3.5 FE-SEM觀察

將游離Cur和EYPNs-Cur溶液稀釋至適當倍數(shù)，吸取5 μL樣品滴加至云母片上，置于通風櫥中干燥過夜。對于凍干后的粉末樣品，直接蘸取適量粉末均勻固定在導電膠上，噴金后進行FE-SEM觀察。

1.3.6 AFM觀察

將新制備的游離Cur和EYPNs-Cur溶液稀釋至適當倍數(shù)，然后吸取4 μL樣品滴到新制的云母片上，通風櫥中過夜干燥后，采用AFM觀察顆粒形貌。

1.3.7 熒光光譜測定

配制1.0 mg/mL的EYPNs溶液（溶劑為pH 7.0、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液），添加等體積一系列質量濃度（0～40 μg/mL）的Cur無水乙醇溶液（猝滅劑），采用熒光分光光度計測定在280 nm激發(fā)波長、260～500 nm發(fā)射波長下的熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設置為5 nm，掃描速率固定在240 nm/min，并以EYPNs磷酸鹽緩沖液作為空白扣除。根據(jù)Stern-Volmer方程（式（2））描述熒光猝滅程度。

式中：F0和F分別表示缺少和存在猝滅劑時的熒光強度；[Q]是猝滅劑濃度/（mol/L）；KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù)/（L/mol）；kq是雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0是在缺少猝滅劑時熒光的壽命（生物大分子的熒光壽命一般為10－8s）。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

將凍干后的EYPNs-Cur/YPNs/Cur粉末/物理混合粉末樣品與溴化鉀按照質量比1∶100混合均勻后壓片測定，掃描波數(shù)范圍為4 000～400 cm－1。

1.3.9 XRD分析

將凍干EYPNs-Cur/YPNs/Cur/物理混合粉末樣品裝入樣品盤中，在Cu Kα X射線（λ＝0.154 18 nm）和加速電壓40 kV以及40 mA條件下，利用直徑0.3 mm的單帽準直器在300 s內收集XRD圖。

1.3.10 儲存穩(wěn)定性測定

貯藏過程中為抑制微生物的生長，在EYPNs-Cur溶液中加入0.02%（以溶液總質量計）疊氮化鈉。將復合納米顆粒置于透明玻璃瓶中密閉保存，分別設定溫度4 ℃和25 ℃，采用定期取樣的方法測定其粒徑、電位和PDI以及Cur溶解度的變化。作為對照，測定相同條件下且不含EYPNs的Cur溶液。

1.3.11 復溶性測定

將凍干的EYPNs-Cur用去離子水配制成質量濃度為5 mg/mL的溶液后測定其粒徑分布以及Cur溶解度。

1.3.12 體外生物可及性

根據(jù)劉春[11]的方法進行體外模擬消化，并稍作修改。取10 mL新配制的樣品與40 mL HCl溶液（0.1 mol/L、pH 1.5）混合均勻并用4 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值為1.5，置于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育10 min，加入10 mg胃蛋白酶繼續(xù)孵育60 min。經(jīng)胃蛋白酶消化后，用4 mol/L NaOH溶液將pH值調為7.0，并加入250 mg膽汁提取物孵育10 min，然后再加入10 mg胰蛋白酶繼續(xù)孵育60～180 min，消化液10 000 r/min離心20 min后按1.3.3節(jié)方法測定上清液中的Cur質量濃度。Cur生物可及性按式（3）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上所用定量分析的實驗至少設定3 次平行實驗，利用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，作圖均采用Origin 8.5軟件進行。

2 結果與分析

2.1 EYPNs-Cur的結構表征

通過pH值誘導共組裝的方法自下而上制備EYPNs-Cur，制備工藝環(huán)保、簡單，未使用有機溶劑，且無需復雜的分離過程。通過將EYPNs溶液pH值調至12.0，促使EYPNs解離并使Cur實現(xiàn)足夠程度的質子化[14]，增加其溶解度，再將pH值回調至7.0，誘導EYPNs重新自組裝形成膠束，從而封裝Cur。如圖1A所示，隨著EYPNs添加量的增加，溶液顏色逐漸變深，表明Cur被包封的量不斷提高。在中性水溶液中，Cur的溶解度很低，經(jīng)測定僅為0.13 μg/mL，EYPNs具有較強增溶Cur的能力，當EYPNs質量分數(shù)為0.5%時，Cur溶解度（50 μg/mL）明顯提升。隨著EYPNs質量分數(shù)的進一步增加（0.5%～4.0%），Cur的包埋率和溶解度不斷升高；當EYPNs質量分數(shù)為4.0%時，Cur溶解度（434.35 μg/mL）與對照樣相比提高了3 339 倍，且溶液呈均一、分散狀態(tài)。一般而言，較小的粒徑和絕對值較高的Zeta電位意味膠體穩(wěn)定性較高。由圖1B、C可知，水中游離的Cur粒徑呈雙峰分布，粒徑分別為幾百納米到幾微米，這表明Cur在水中的存在形式為不均勻的聚集體；并且Cur的Zeta電位僅為－6.9 mV，說明游離Cur在水相中極不穩(wěn)定。而EYPNs-Cur的粒徑分布均為單峰，平均粒徑為106.9～126.0 nm，Zeta電位為－20 mV左右。綜上，通過EYPNs自組裝形成的EYPNs-Cur具有優(yōu)異的溶解度和膠體分散性。

圖1 Cur的包埋率、溶解性（A）及Cur、EYPNs-Cur的粒徑分布（B）、Zeta電位（C）Fig. 1 Encapsulation efficiency (EE) and water solubility of Cur (A),particle size distribution of Cur and EYPNs-Cur composite nanoparticles (B),and zeta potential of Cur and EYPNs-Cur nanoparticles (C)

如圖2A所示，游離Cur聚集成大的片狀結構，這是由于游離的Cur在水中幾乎不溶解，以聚集體形式存在；EYPNs-Cur呈球狀結構，平均粒徑約為120 nm，和納米粒度儀測定結果基本一致，但也出現(xiàn)了少量不規(guī)則聚集，造成粒徑變大，很有可能是由于自然風干過程引發(fā)EYPNs-Cur出現(xiàn)輕微的聚集。AFM顯示出類似的結果，由圖2B可知，在游離Cur中觀察到大量微米級聚集體，這也是游離Cur粒徑測定時出現(xiàn)雙峰的原因，EYPNs-Cur復合物則呈類似于球形的納米結構且分布相對均勻。

圖2 Cur和EYPNs-Cur的微觀結構Fig. 2 Microstructure of Cur and EYPNs-Cur nanoparticles

凍干后的樣品FE-SEM圖像如圖2C所示，游離Cur凍干后進一步聚集，形成較為致密的蜂窩狀結構，出現(xiàn)大量不規(guī)則棒塊狀顆粒，EYPNs-Cur凍干后結構相對松散，能觀察到大量球狀納米顆粒，同時有大塊片狀結構出現(xiàn)，這與文獻[27]的報道結果一致，可能是由于冷凍干燥過程造成部分納米顆粒結構的改變。

2.2 EYPNs和Cur的相互作用分析

蛋白質的內源熒光光譜法是研究水溶液中蛋白質與小分子結合情況的一種方便的方法。不同Cur添加量對EYPNs發(fā)射光譜的影響如圖3A所示。不添加Cur的純EYPNs溶液中，在280 nm波長處被激發(fā)后，在350 nm波長處出現(xiàn)了一個較高強度的熒光光譜峰。加入少量Cur（10 μg/mL）后，EYPNs的熒光強度即出現(xiàn)大幅減弱，隨著Cur質量濃度（10～40 μg/mL）的進一步增加，EYPNs的熒光強度逐漸減弱并逐漸猝滅，最大發(fā)射波長變化不大，這說明Cur分子通過疏水相互作用與EYPNs結合，但對于其所處的微環(huán)境無明顯影響。熒光猝滅可以分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，分別對應生物聚合物與猝滅劑之間的碰撞和生物聚合物與猝滅劑之間形成復合物兩種方式使熒光猝滅[14]。通過線性回歸計算得到EYPNs和Cur之間復合的雙分子猝滅速率常數(shù)kq為1.10×1013L/（mol·s），遠大于最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/（mol·s）[5]，因此Cur誘導EYPNs的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

圖3 表征EYPNs和Cur相互作用的光譜圖Fig. 3 Spectrograms characterizing interaction between EYPNs and Cur

如圖3B所示，游離Cur在3 510 cm－1處出現(xiàn)的特征吸收峰，對應于Cur中酚羥基（—OH）的拉伸振動。物理混合后Cur的多處特征峰（3 510、1 628、870、710 cm－1）有所減弱但是并沒有消失，這可能是因為EYPNs具有較高的峰形，會掩蓋部分Cur的指紋區(qū)使其特征峰強度降低，這表明物理混合并不會使EYPNs與Cur發(fā)生相互作用。EYPNs-Cur在3 510 cm－1處的—OH拉伸振動峰消失，說明Cur和EYPNs之間可能存在氫鍵相互作用。Cur分子在1 427、1 154 cm－1和855 cm－1處的特征峰主要與芳香環(huán)和環(huán)間鏈的振動有關[28]，Cur指紋圖譜區(qū)域（500～1 300 cm－1）吸收峰的強度和數(shù)量在EYPNs-Cur中均出現(xiàn)明顯降低，表明Cur的疏水基團可能通過疏水相互作用與蛋白質相互作用。此外，Cur-EYPNs與EYPNs的峰形完全一致，這表明Cur與EYPNs通過非共價相互作用結合后完全被封裝起來。

XRD被廣泛應用于活性物質包埋體系或生物聚合物結晶度的研究。由圖3C可知，游離Cur是高度結晶結構，其衍射峰與文獻[29]報道的Cur特征峰一致，EYPNs為無定形結構。經(jīng)過簡單的物理混合后，Cur的結晶峰強度有所減弱，但是大部分衍射峰并沒有消失，這可能是由于EYPNs會掩蓋部分Cur造成其衍射峰強度降低；EYPNs-Cur的XRD光譜未顯示任何衍射峰，與EYPNs幾乎完全一致，表明Cur被EYPNs完全封裝，這與文獻[30-31]報道的結果一致。

2.3 EYPNs-Cur的儲存穩(wěn)定性

如圖4A～C所示，在25 ℃下貯藏1 個月的過程中，EYPNs質量分數(shù)為0.5%和1.0%時，EYPNs-Curs的粒徑基本不變，2.0%和3.0% EYPNs組的粒徑略微增加，而4.0% EYPNs組的粒徑快速增加，且在結束時增至0 d時的約2 倍。PDI結果顯示，除了4.0% EYPNs組增大至0.417，其他樣品都小于0.3，表明樣品具有較為均一的粒徑分布。所有樣品經(jīng)儲存1 個月后外觀無明顯變化，未發(fā)生聚集和沉淀，只有4.0% EYPNs組的樣品顏色輕微變淺。以上結果表明，除4.0% EYPN組的復合納米顆粒發(fā)生了輕微聚集外，其他樣品都顯示出良好的膠體穩(wěn)定性。

圖4 EYPNs-Cur在25 ℃貯藏期間的粒徑分布（A）、外觀（B）、PDI（C）和Cur溶解度（D）的變化Fig. 4 Particle size distribution (A), appearance (B), PDI (C) and Cur water solubility (D) of EYPNs-Cur composite nanoparticles during storage at 25 ℃

Cur在水溶液中的穩(wěn)定性較差，短時間內會迅速發(fā)生降解，并呈pH值依賴性：在pH值為3.0～6.5時，Cur的半衰期為100～200 min；在pH值為7.2～8.0時，Cur的半衰期急劇縮短至1～9 min[32]。因此，評價Cur在儲存期間的保留率至關重要。如圖4D所示，Cur封裝于EYPNs中大大提高了其降解穩(wěn)定性。在25 ℃下不避光貯藏1 個月后，EYPNs-Cur中的Cur含量基本未發(fā)生改變，只在3.0%、4.0% EYPNs組出現(xiàn)了Cur輕微降解（溶解度分別為322.25～288.00、434.35～393.25 μg/mL）的情況，但其Cur保留量依然高達90%左右。這主要是由于當EYPNs荷載的Cur量較大時，在25 ℃透明玻璃瓶中不可避免地受光照的影響使部分Cur發(fā)生降解。Prasad等[6]報道通過反溶劑構建的Cur納米顆粒在72 h后Cur的保留率降至60%，表明本研究中構建的EYPNs-Cur可以有效保護Cur免受光照和氧化劑等的影響而降解。可能的穩(wěn)定機制如下：一方面歸因于兩親性EYP自身具有一定的抗氧化能力[33]；另一方面，EYPNs與Cur相互作用所結合，起到了“固定”Cur的作用，降低其遷移率，從而降低了其化學反應性；此外，結合XRD結果，Cur被完全封裝于EYPNs的膠束內部，形成了物理屏障，從而保護Cur不被降解。

在室溫25 ℃不避光條件下，EYPNs-Cur已經(jīng)顯示出良好的儲存穩(wěn)定性，但較高濃度納米顆粒的粒徑會有所增加，為了更好地實現(xiàn)納米顆粒的長期穩(wěn)定，進一步考察低溫貯藏條件下EYPNs-Cur的粒徑分布及Cur溶解度變化情況，結果如圖5所示。所有樣品在4 ℃下貯藏1 個月后，粒徑均無明顯變化，范圍為105～135 nm，且PDI變化也很小，PDI最高不超過0.24，這表明在低溫條件下儲存，所有樣品都具有優(yōu)異的膠體穩(wěn)定性。此外，EYPNs-Cur的外觀在儲存1 個月后與第1天相比無肉眼可見的差異。所有復合納米顆粒的Cur幾乎沒有發(fā)生降解，表明低溫貯藏能有效抑制Cur的降解，這主要是由于低溫可以抑制復合納米顆粒奧斯瓦爾德熟化過程和降低Cur的氧化速率。

圖5 EYPNs-Cur在4 ℃貯藏期間的粒徑分布（A）、外觀照片（B）、PDI（C）和Cur溶解度（D）變化Fig. 5 Particle size distribution (A), appearance (B), PDI (C) and Cur water solubility (D) of EYPNs-Cur composite nanoparticles during storage at 4 ℃

2.4 EYPNs-Cur的凍干復溶性

Chen Feiping等[1]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白-Cur復合物凍干后的顆粒尺寸相對于凍干前會顯著增加，這是因為凍干過程中的溫度改變會引起蛋白質的表面特征發(fā)生明顯變化，進而導致蛋白質聚集。因此本實驗考察了凍干后EYPNs-Cur的粒徑分布和Cur溶解性情況，以評估EYPNs-Cur的凍干穩(wěn)定性。如圖6A所示，與凍干前（圖1A）相比，復溶后的EYPNs-Cur溶液外觀無明顯變化，整體均一澄清，無肉眼可見的聚集、沉淀出現(xiàn)，呈現(xiàn)出良好的再分散性，且同一EYPNs質量分數(shù)組的樣品復溶后的溶解性與凍干前無明顯差異。粒徑分布的結果（圖6B）也與凍干前（圖1B）基本一致，這表明凍干過程對復合納米顆粒的膠體分散性沒有明顯影響，未引發(fā)不可逆的顆粒聚集。因此，本研究制備的EYPNs-Cur可適用于多種應用場景，并且具有保存和運輸條件上的優(yōu)勢。

圖6 凍干游離Cur和EYPNs-Cur粉末的復溶性（A）及粒徑（B）分布Fig. 6 Reconstitution property (A) and particle size distribution (B) of free Cur and EYPNs-Cur nanoparticles

2.5 EYPNs-Cur的生物可及性

在消化過程中脂溶性物質經(jīng)過膽酸鹽乳化后，可形成穩(wěn)定的復合膠束并通過小腸細胞屏障進而轉運到血液循環(huán)中參與多種生命活動[11,31,34]。Cur的生物可及性主要取決于其在消化液中的溶解性，Cur含量越高表示其生物可及性越高[30]。游離Cur和EYPNs-Cur在整個模擬消化過程中Cur保有量的變化如圖7所示，在模擬胃消化階段，游離Cur和復合納米顆粒在消化液中的生物可及性均較低，分別為0.3%～0.6%和4.4%～4.9%，雖然在數(shù)值上并不高，但EYPNs-Cur卻顯著高于游離Cur。在模擬腸消化階段，兩組樣品在消化液中的Cur保有量均增大，游離Cur和EYPNs-Cur中的Cur生物可及性分別為30.2%～40.9%和66.3%～73.6%。相較于游離Cur，自組裝形成EYPNs-Cur后，Cur的生物可及性提高近1 倍，這表明EYPNs-Cur可以顯著提高Cur的生物可及性。值得注意的是，EYPNs-Cur在模擬消化過程中依然有約30%的Cur未得到利用，原因可能是EYPNs在長達1 h酸性條件下發(fā)生聚集并導致復合納米顆粒沉淀。此外，胃蛋白酶也會水解部分EYPNs使EYPNs-Cur失穩(wěn)并釋放部分Cur，而Cur在酸性環(huán)境中溶解性較差。整體來看，將Cur包載于EYPNs中能大幅提升其在消化液中，增加其生物可及性。就EYPNs-Cur而言，如果采用特定的材料封裝讓其安全穿過胃并進入腸道內釋放，其生物可及性將會大幅度提高。

圖7 游離Cur和EYPNs-Cur在體外消化過程中Cur生物可及性的變化Fig. 7 Changes in the bioaccessibility of free Cur and EYPNs-Cur during simulated gastrointestinal digestion

3 結 論

本研究采用工業(yè)生產(chǎn)蛋黃卵磷脂和蛋黃油產(chǎn)生的副產(chǎn)物脫脂蛋黃蛋白粉為原料，通過胰蛋白酶水解得到兩親性EYP及其自組裝形成的膠束狀納米顆粒（EYPNs），用于構建穩(wěn)定的共組裝EYPNs-Cur復合納米顆粒輸送體系。結果表明，EYPNs和Cur之間存在較強的疏水相互作用，Cur通過與EYPNs共組裝形成納米顆粒對Cur進行包埋，可使Cur溶解度大幅提高，同時使其即使經(jīng)過長達1 個月的不避光貯藏也不發(fā)生降解。此外，Cur與EYPN共組裝后的體外消化生物可及性大幅提高，由30.2%～40.9%增加至66.3%～73.6%。本研究表明，由兼具生物活性與兩親性的EYP自組裝形成的納米膠束顆粒是一種新型高效的納米遞送載體，可大幅提升疏水性功能因子的水溶性、穩(wěn)定性和生物可及性，在功能性食品與營養(yǎng)品以及生物醫(yī)藥等領域具有重要的應用價值。