食源性致病菌活的不可培養(yǎng)狀態(tài)誘導(dǎo)、復(fù)蘇及檢測(cè)的研究進(jìn)展

趙 青，劉 欣，牛洪梅，朱華劍，潘馨葉，劉陽(yáng)泰，楊捷琳，董慶利,*

（1.上海理工大學(xué)材料與化學(xué)學(xué)院，上海 200093；2.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093；3.上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

細(xì)菌活的不可培養(yǎng)（viable but nonculturable，VBNC）狀態(tài)，通常是指細(xì)菌在不利于自身生存環(huán)境條件下失去可培養(yǎng)性的一種休眠狀態(tài)[1]。Xu Huaishu等[2]最早于1982年發(fā)現(xiàn)了VBNC狀態(tài)存在的直接證據(jù)，其后Mukamolova等[3]發(fā)現(xiàn)了黃體微球菌分泌的蛋白質(zhì)Rpf（復(fù)蘇促進(jìn)因子），為VBNC狀態(tài)的研究提供了一個(gè)良好的開(kāi)端?，F(xiàn)已有大量的實(shí)質(zhì)性證據(jù)表明，大多數(shù)細(xì)菌在處于對(duì)其生長(zhǎng)繁殖不利的環(huán)境條件時(shí)，都能夠進(jìn)入VBNC狀態(tài)休眠或是降低細(xì)胞活性，以規(guī)避不良環(huán)境條件的影響[4]，這種狀態(tài)下的細(xì)菌仍具有致病性或潛在致病性，并在適宜的條件下可以復(fù)蘇，因此對(duì)食品和環(huán)境存在潛在的威脅[5-6]。2018年，Schottroff等[7]闡述了VBNC細(xì)菌的存在可能會(huì)引起食品安全狀況誤判，由此引起食品安全事件，并再次強(qiáng)調(diào)了VBNC細(xì)菌對(duì)食品安全的威脅，使VBNC狀態(tài)細(xì)菌的關(guān)注度提升。

迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的100多種在逆境條件下可以進(jìn)入VBNC狀態(tài)的微生物絕大多數(shù)為食源性致病菌[8-9]。食源性致病菌可通過(guò)受污染的水或食物傳播，消費(fèi)者攝入之后會(huì)在人體內(nèi)引起嚴(yán)重疾病，是影響食品安全的重要隱患，包括沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌（以下簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌）、空腸彎曲桿菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、阪崎克羅諾桿菌等[10]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)食源性致病菌在食品加工加工過(guò)程中遇到低溫[11]、高壓[12]、低強(qiáng)度光照、高/低鹽度[13]、紫外[14]、氯脅迫[15-16]和電化學(xué)處理[17]等條件時(shí)，有較大可能會(huì)進(jìn)入VBNC狀態(tài)。進(jìn)入VBNC狀態(tài)的致病菌雖然暫時(shí)喪失了生長(zhǎng)繁殖的能力，但仍具有致病菌原本的抗原成分、毒力因子，且部分致病菌在VBNC狀態(tài)下可以直接表達(dá)毒性因子[18]。細(xì)菌處于VBNC狀態(tài)時(shí)，采用常規(guī)的檢測(cè)手段易造成漏檢，但當(dāng)VBNC狀態(tài)的致病菌遇到適宜的條件后又可以復(fù)蘇，重新對(duì)周?chē)h(huán)境和人類(lèi)安全造成一定的威脅。不同食源性致病菌在VBNC狀態(tài)下的毒性表達(dá)能力也有所不同。因此，出于對(duì)食品安全和公眾健康的考慮，對(duì)食源性致病菌VBNC狀態(tài)生理生化特性及其檢測(cè)方法的研究具有積極和重要的意義。

基于此，本文總結(jié)了細(xì)菌VBNC狀態(tài)的定義發(fā)展、形態(tài)特征、生理生化性質(zhì)、毒力因子等，再將近年來(lái)VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)因素和復(fù)蘇條件進(jìn)行梳理歸納，最后著重介紹了檢測(cè)VBNC狀態(tài)的分子生物學(xué)、流式細(xì)胞儀、光學(xué)檢測(cè)方法，并比較分析了3 種方法的優(yōu)劣。通過(guò)進(jìn)行進(jìn)一步的學(xué)術(shù)探討，圍繞細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的影響因素和復(fù)蘇條件進(jìn)行全面的總結(jié)，為防控食源性致病菌的潛在危害提供參考。

1 VBNC狀態(tài)的定義及特征

1.1 VBNC狀態(tài)的定義

VBNC狀態(tài)是指細(xì)菌在受到不利于自身生長(zhǎng)環(huán)境下導(dǎo)致的一種休眠狀態(tài)，常規(guī)培養(yǎng)條件下細(xì)菌不能增殖，但是仍具有代謝活性，給予適宜條件時(shí)細(xì)菌可復(fù)蘇[19]。通常，保持在VBNC狀態(tài)的細(xì)菌保留了毒力基因和致病基因，復(fù)蘇后會(huì)產(chǎn)生致病性和感染性[20]。如圖1所示，VBNC狀態(tài)細(xì)菌菌體中細(xì)胞質(zhì)密度、蛋白質(zhì)、核糖體、DNA的改變會(huì)引起菌體收縮變小，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜也會(huì)分離。從近年來(lái)的研究看，VBNC狀態(tài)并沒(méi)有一個(gè)固定的解釋?zhuān)袑W(xué)者認(rèn)為其是細(xì)菌在不利環(huán)境條件下生存的一種休眠狀態(tài)[21]，另外一些學(xué)者認(rèn)為其是細(xì)菌為了延續(xù)生命而采取的一種特殊的生存策略[22-24]，總地來(lái)說(shuō)，各種對(duì)于VBNC狀態(tài)的定義都具有不可培養(yǎng)這一共同的外部特征，但對(duì)細(xì)菌本身缺少一個(gè)明確的特征指標(biāo)。

圖1 細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)后形態(tài)、生理和毒力特征的變化[25]Fig. 1 Changes in morphological, physiological and virulence characteristics of bacteria after entering the VBNC state[25]

1.2 VBNC狀態(tài)的特征

關(guān)于VBNC細(xì)胞的特征研究有很多，以下從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)大分子方面分別闡述。

1.2.1 細(xì)胞形態(tài)

從細(xì)胞形態(tài)看，VBNC狀態(tài)細(xì)胞與指數(shù)中期和壞死狀態(tài)的細(xì)胞間存在明顯差異。Wei Caijiao等[26]用掃描電子顯微鏡觀察不同狀態(tài)的細(xì)菌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，處于指數(shù)中期的細(xì)胞呈典型的棒狀，表面光滑、大小正常、分布均勻；死亡的大腸桿菌O157:H7細(xì)胞表面相對(duì)粗糙、聚集，甚至部分細(xì)胞表面出現(xiàn)損傷；而在VBNC狀態(tài)下，細(xì)胞由典型的棒狀變?yōu)槎贪魻睿?xì)胞體積減小，細(xì)胞相對(duì)粗糙、萎縮，形狀不規(guī)則，部分細(xì)胞趨于成簇。

1.2.2 組織結(jié)構(gòu)

Bai Hong等[27]從細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)方面開(kāi)展典型特征研究，用透射電子顯微鏡觀察未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)第20天的VBNC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者有著同樣明顯的形態(tài)學(xué)變化。基于微觀分子層面，許多未誘導(dǎo)的細(xì)胞處于分裂期，細(xì)胞壁完整光滑，細(xì)胞膜緊密貼合。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核物質(zhì)被新生的細(xì)胞壁均勻地分離，核糖體均勻分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，位于細(xì)胞中心的類(lèi)核具有致密、濃縮的結(jié)構(gòu)。與未誘導(dǎo)的細(xì)胞相比，VBNC細(xì)胞質(zhì)中電子密度增加，部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間的間隙，導(dǎo)致細(xì)胞壁有一定程度的變形，使VBNC細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，這可能是細(xì)胞質(zhì)濃縮所致。另一方面，與未誘導(dǎo)的細(xì)胞相比，VBNC細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)域出現(xiàn)了電子密度下降的現(xiàn)象，表現(xiàn)為明亮的中空或呈放射狀分布的淺色結(jié)構(gòu)。

1.2.3 蛋白質(zhì)大分子

Bollen等[28]討論了VBNC狀態(tài)與蛋白質(zhì)聚集的關(guān)系；Kan Yumin等[29]采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)比較了西瓜噬酸菌VBNC細(xì)胞、復(fù)蘇細(xì)胞和對(duì)數(shù)期細(xì)胞的蛋白圖譜，在VBNC細(xì)胞和對(duì)數(shù)期細(xì)胞的對(duì)比中有60 個(gè)蛋白差異表達(dá)，在VBNC細(xì)胞和復(fù)蘇細(xì)胞的對(duì)比中有469 個(gè)蛋白差異表達(dá)。Zhong Qingping等[30]同樣采用iTRAQ技術(shù)對(duì)副溶血性弧菌復(fù)蘇后與VBNC狀態(tài)和指數(shù)期的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，證明了復(fù)蘇細(xì)胞中蛋白全面上調(diào)，主要包括參與蛋白質(zhì)合成、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)、黏附等生命過(guò)程的蛋白；Se Jing等[31]研究了在低水分的情況下細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)、蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制能力；Ye Chengsong等[32]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在VBNC狀態(tài)下，大腸桿菌共有16 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，其中包括3 個(gè)編碼毒性蛋白的基因（ygeG、ibsD、shoB）。以上研究表明在VBNC狀態(tài)下，細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)能力、蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制能力降低，其中參與DNA復(fù)制和重組、糖類(lèi)運(yùn)輸和代謝的蛋白均下調(diào)，與鞭毛運(yùn)動(dòng)、致病性和營(yíng)養(yǎng)吸收相關(guān)的蛋白均上調(diào)；同時(shí)，該研究也證實(shí)了處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌在復(fù)蘇后表達(dá)致病蛋白，對(duì)人類(lèi)健康安全構(gòu)成威脅。

2 細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的因素及復(fù)蘇條件

2.1 VBNC狀態(tài)細(xì)菌形成

1982年，Xu Huaishu等[2]首次在海洋和河口水中分離獲得VBNC細(xì)胞并對(duì)其狀態(tài)進(jìn)行了描述，之后在自來(lái)水、海底沉積物或土壤中都檢測(cè)到了VBNC狀態(tài)細(xì)胞存在。此外，在一些食品中也發(fā)現(xiàn)了VBNC狀態(tài)細(xì)菌的存在，如飲用水、葡萄酒、啤酒、葡萄果汁、成熟蘋(píng)果果核、生菜、歐芹等[33]。這是因?yàn)樵谑称芳庸ぜ百A藏過(guò)程中存在著許多能夠?qū)е率称分兴虏【黄冗M(jìn)入VBNC狀態(tài)的環(huán)境因素，主要包括低溫、高溫、高滲透壓、低氧濃度、極端pH值、寡營(yíng)養(yǎng)等[20]。換言之，在外界環(huán)境中能使細(xì)菌偏離最佳生長(zhǎng)條件的脅迫因素（包括物理因素和化學(xué)因素）均可能使細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。

圖2為VBNC細(xì)菌的形成機(jī)制示意圖，主要涉及4 條通路，包括毒素-抗毒素（toxin-antitoxi，TA）系統(tǒng)、嚴(yán)緊反應(yīng)、一般應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞膜作用。1）在TA系統(tǒng)中，對(duì)細(xì)菌VBNC狀態(tài)起調(diào)控作用的毒素基因（mazF、relE、higB、hipB、vapC、parE2）干擾翻譯，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，使細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。TA系統(tǒng)又受?chē)?yán)緊反應(yīng)調(diào)節(jié)，因?yàn)橥馇芯哿姿峒っ福╬olyphosphokinase，PPK）和鳥(niǎo)苷五磷酸磷酸水解酶（guanosine pentaphosphate phosphohydrolase，GPPA）具有鳥(niǎo)苷四磷酸[(p)ppGpp]磷酸水解酶活性，導(dǎo)致降解多聚磷酸鹽（polyphosphates，PolyP）積聚，從而激活蛋白酶Lon/ClpP并降解抗毒素，促進(jìn)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)（圖2A）。2）在嚴(yán)緊反應(yīng)中，由于氨基酸饑餓而激活RelA蛋白，(p)ppGpp又受RelA催化合成，進(jìn)而影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯（圖2B）。3）一般應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)Sigma因子RpoS和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OxyR作為調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的主要信號(hào)因子對(duì)VBNC細(xì)菌的形成和作用具有重要的激活作用，RpoS也受?chē)?yán)緊反應(yīng)和ClpX蛋白酶的調(diào)控，clpX基因突變導(dǎo)致RpoS降解減少，最終延遲細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)（圖2C）。4）細(xì)胞膜上的毒素轉(zhuǎn)錄激活因子ToxR的降解也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，其功能可能是對(duì)環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)[25]（圖2D）。

圖2 VBNC細(xì)胞的形成機(jī)制[25]Fig. 2 Formation mechanism of VBNC cells[25]

2.2 VBNC狀態(tài)細(xì)菌復(fù)蘇

VBNC狀態(tài)細(xì)菌復(fù)蘇是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，并不只是通過(guò)簡(jiǎn)單除去環(huán)境脅迫因素來(lái)實(shí)現(xiàn)，有時(shí)還需要添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、化學(xué)物質(zhì)或依靠食品基質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，而且并不是所有的VBNC菌株都可以復(fù)蘇。處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌具有一定的可復(fù)蘇的“復(fù)蘇窗口期”[34]，一旦過(guò)了這個(gè)窗口期，復(fù)蘇難度較大，并且窗口期在不同菌株之間差異很大。目前關(guān)于VBNC狀態(tài)菌的研究較多，但研究VBNC狀態(tài)復(fù)蘇成功與否卻存在爭(zhēng)議，關(guān)于復(fù)蘇的是亞致死細(xì)胞還是VBNC細(xì)胞尚不清楚，且這兩者有極大的相似之處。亞致死狀態(tài)是由于化學(xué)或物理過(guò)程而受到細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，但沒(méi)有被殺死，并且有能力在適當(dāng)?shù)臈l件下修復(fù)它們的損傷時(shí)，它們就處于亞致死狀態(tài)。亞致死細(xì)胞是休眠的初始階段，隨后是VBNC狀態(tài)[33]。此外，同樣的復(fù)蘇方法對(duì)不同種類(lèi)的細(xì)菌有不同的復(fù)蘇效果，甚至同一細(xì)菌不同菌株的復(fù)蘇效果也不一樣。例如，Pinto等[35]發(fā)現(xiàn)氨基酸可以使溶血性大腸桿菌的VBNC細(xì)胞復(fù)蘇，但不能使VBNC腸出血性大腸桿菌O157:H7復(fù)蘇。Wagley等[36]研究發(fā)現(xiàn)菌株的“年齡”也可影響VBNC的形成和復(fù)蘇。在Afari等[37]的研究中，大腸桿菌O157:H7撤去應(yīng)激條件，升溫加丙酮酸鈉和吐溫20即復(fù)蘇成功，但同樣條件下單增李斯特菌的復(fù)蘇卻未成功。

復(fù)蘇VBNC狀態(tài)下的細(xì)胞一般為消除壓力因素或添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但復(fù)蘇的分子機(jī)制并不是一個(gè)簡(jiǎn)單的逆轉(zhuǎn)過(guò)程，圖3為VBNC狀態(tài)細(xì)胞復(fù)蘇機(jī)制示意圖[38]。在靶向自誘導(dǎo)信號(hào)分子（autoinducer-2，AI-2）缺失的情況下，其受體由周質(zhì)結(jié)合蛋白LuxP和酶?jìng)鞲衅鱈uxQ結(jié)合LuxPQ作為激酶催化組氨酸磷酸化，磷酸鹽隨后轉(zhuǎn)移到酶蛋白LuxU和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LuxO。LuxU和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子σ54結(jié)合促進(jìn)了sRNAs的轉(zhuǎn)錄，sRNAs與伴侶Hfq一起破壞了轉(zhuǎn)錄因子LuxR的編碼。LuxR是RpoS的正調(diào)控因子，LuxR被破壞后，RpoS活性降低，過(guò)氧化氫酶KatG的產(chǎn)生也會(huì)隨之減少，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)過(guò)氧化氫的敏感性和不可培養(yǎng)性（圖3A）。當(dāng)AI-2濃度較高時(shí)，LuxPQ結(jié)合AI-2，并作為磷酸酶剝奪LuxO和LuxU的磷酸基，低活性LuxO導(dǎo)致LuxR失去抑制后，RpoS活性的增加導(dǎo)致KatG產(chǎn)量的增加，抗氧化活性的增加使VBNC細(xì)胞再次可培養(yǎng)（圖3B）。Rpf蛋白結(jié)合VBNC細(xì)胞表面的Rpf受體，觸發(fā)復(fù)蘇（圖3C）。Rpf和Rif組成的復(fù)合物作用于細(xì)胞壁。Rpf和Rip分別分裂糖苷鍵和肽鍵，細(xì)胞壁被重塑，進(jìn)而刺激VBNC細(xì)胞的復(fù)蘇（圖3D）。Rpf和Rif復(fù)合體作用于VBNC細(xì)胞的細(xì)胞壁，并將其裂解產(chǎn)生肽聚糖片段。肽聚糖片段與PknB受體（一種跨膜蛋白）結(jié)合并觸發(fā)復(fù)蘇（圖3E）。VBNC細(xì)胞在去除氧化、冷、饑餓、滲透應(yīng)激和離子應(yīng)激等應(yīng)激后可以復(fù)蘇（圖3F）。VBNC細(xì)胞宿主可提供營(yíng)養(yǎng)或刺激因子促進(jìn)復(fù)蘇[38]（圖3G）。

圖3 VBNC細(xì)胞的復(fù)蘇機(jī)制[38]Fig. 3 Resuscitation model of VBNC cells[38]

為了解食源性致病菌VBNC狀態(tài)及其復(fù)蘇后對(duì)人類(lèi)的威脅，已對(duì)食源性致病菌VBNC狀態(tài)的影響因素和復(fù)蘇條件開(kāi)展了相關(guān)研究（表1）。典型研究包括通過(guò)物理方法誘導(dǎo)致病菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，包括紫外線[39]、高溫[40]、低水分[31]、高壓二氧化碳[41]，而復(fù)蘇后致病菌可恢復(fù)其培養(yǎng)性和代謝活性，證實(shí)了毒力基因在VBNC狀態(tài)和復(fù)蘇的細(xì)胞中均為高表達(dá)，但隨著蛋白質(zhì)聚集和活性氧水平的增加，細(xì)胞會(huì)逐漸失去復(fù)蘇的能力；Liu Yanming[42]、Phung[43]、Gi?o[44]等的研究表明自來(lái)水中也存在VBNC狀態(tài)的細(xì)菌，所以為消除這一潛在風(fēng)險(xiǎn)，需要將水煮沸至少15 min以上使其完全滅活；Zolfaghari等[45]發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在NaCl溶液的脅迫下進(jìn)入VBNC狀態(tài)，且保留了hly和inlA基因的表達(dá)；此外，在營(yíng)養(yǎng)耗盡的培養(yǎng)基中也可誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，并且細(xì)菌存活時(shí)長(zhǎng)可達(dá)2 個(gè)月[46-47]。由此可以得出，細(xì)菌在不利于自身生長(zhǎng)繁殖的物理或化學(xué)條件下，均可進(jìn)入VBNC狀態(tài)，而不同的食源性致病菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的時(shí)間、條件也不相同，這可能與致病菌本身的生存環(huán)境、生存溫度、營(yíng)養(yǎng)需求、耐酸堿度有關(guān)。

表1 食源性致病菌VBNC狀態(tài)的影響因素及復(fù)蘇條件Table 1 Influential factors and resuscitation conditions of foodborne pathogens in the VBNC state

3 VBNC細(xì)菌檢測(cè)方法

由于VBNC狀態(tài)細(xì)菌使用常規(guī)培養(yǎng)方法無(wú)法增殖，因此無(wú)法被檢測(cè)到，容易對(duì)食品安全和公共衛(wèi)生形成潛在威脅。因此建立針對(duì)VBNC狀態(tài)的食源性致病菌有效且快速檢測(cè)的方法較為迫切。目前針對(duì)VBNC狀態(tài)的食源性致病菌的檢測(cè)方法主要包括分子生物學(xué)檢測(cè)法、流式細(xì)胞術(shù)和光學(xué)檢測(cè)法。

3.1 分子生物學(xué)檢測(cè)法

分子生物學(xué)檢測(cè)法一般采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)，疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）能夠進(jìn)入細(xì)胞壁和細(xì)胞膜已破損的細(xì)胞，但由于VBNC狀態(tài)下的細(xì)菌細(xì)胞膜是完整的，因此PMA只能對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色，一般將其與PCR結(jié)合測(cè)VBNC細(xì)胞數(shù)，或?qū)PCR與活/死細(xì)胞染色法結(jié)合得出總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)，通過(guò)總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)差值來(lái)確定VBNC細(xì)胞數(shù)。

Zhou Wenqu等[60]應(yīng)用快速、特異、操作簡(jiǎn)便的單氮丙啶交叉引物擴(kuò)增（propidium monoazide-crossing priming amplification，PMA-CPA）法檢測(cè)VBNC狀態(tài)下的大腸桿菌O157:H7。Debnath等[61]通過(guò)qPCR對(duì)VBNC狀態(tài)下的霍亂弧菌分析，證實(shí)了此狀態(tài)下細(xì)菌具有活性?？梢酝茰y(cè)，在逆境中生存時(shí)，這些分子伴侶的作用是維持重要蛋白的結(jié)構(gòu)完整性。Faille等[62]用qPCR和PMA-qPCR分別對(duì)單增李斯特菌死亡、VBNC、可培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)使用的采樣方法對(duì)清洗消毒操作效率的評(píng)估有顯著影響。Li Yanmei團(tuán)隊(duì)[63-64]用PMA-PCR計(jì)數(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了營(yíng)養(yǎng)、酸、鹽對(duì)金黃色葡萄球菌（營(yíng)養(yǎng)＞酸＞鹽）和大腸桿菌O157:H7（酸＞營(yíng)養(yǎng)＞鹽）的影響。Lv Xinrui等[65]開(kāi)發(fā)并使用PMAxx（以分子檢測(cè)法為主，對(duì)PMA染料進(jìn)行改良后的一種方法）＋單細(xì)胞數(shù)字滴定PCR（single intact cell droplet digital PCR，SIC ddPCR）法對(duì)嬰兒食品中阪崎克羅諾桿菌在VBNC狀態(tài)下快速定量檢測(cè)，得出檢測(cè)限2.3×101CFU/mL，且僅需3 h就可得出結(jié)果，并且具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。分子生物學(xué)檢測(cè)法以準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)并且能夠極大提高檢測(cè)速度等優(yōu)勢(shì)在VBNC狀態(tài)細(xì)菌的檢測(cè)和分析中得到了廣泛的應(yīng)用。但是，分子檢測(cè)法也有一定的劣勢(shì)，比如其程序復(fù)雜，需要技術(shù)精通的研究人員操作，同時(shí)檢測(cè)儀器也十分昂貴。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)可以快速測(cè)量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞并進(jìn)行自動(dòng)分析和分選，該技術(shù)可以用于分析和檢測(cè)那些不能用常規(guī)方法培養(yǎng)而得到的細(xì)胞特征參數(shù)。Live/Dead BacLight試劑盒是目前應(yīng)用較多的判定活菌的方法，采用流式細(xì)胞術(shù)可以區(qū)分出只被SYTO9染色的細(xì)菌，從而得到活菌的含量，而檢測(cè)到細(xì)胞處于活細(xì)胞區(qū)但平板富集后不可培養(yǎng)的細(xì)胞被歸類(lèi)為VBNC細(xì)胞。

Afari等[37]采用流式細(xì)胞儀，Live/Dead BacLight試劑盒對(duì)大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌VBNC狀態(tài)細(xì)胞的活性進(jìn)行評(píng)估，得出初始細(xì)菌種群規(guī)模大小影響電解水處理過(guò)程中的細(xì)菌減少程度。Power等[66]研究證明，高通量成像流式細(xì)胞術(shù)（imaging flow cytometry，IFC）具有高通量數(shù)據(jù)收集和圖像捕獲能力，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行可視化處理并提供詳細(xì)的形態(tài)分析，因此可以對(duì)VBNC細(xì)胞進(jìn)行高分辨率分類(lèi)，為詳細(xì)了解細(xì)菌表型變化及其生理影響提供了一個(gè)平臺(tái)，可以準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)和量化，從而更好地理解表型異質(zhì)性在動(dòng)態(tài)微生物組中的作用。具備篩選功能的流式細(xì)胞儀可以根據(jù)預(yù)先設(shè)置的參數(shù)范圍把指定的細(xì)胞亞群分選出來(lái)，但多數(shù)流式細(xì)胞計(jì)是一種細(xì)節(jié)分辨率為零的儀器，它只能測(cè)量一個(gè)細(xì)胞的諸如總核酸量、總蛋白量等指標(biāo)，而不能鑒別和測(cè)量出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。

3.3 光學(xué)檢測(cè)法

熒光顯微鏡法是研究VBNC狀態(tài)菌最基本的檢測(cè)方法，也稱(chēng)經(jīng)典方法。該方法是以吖啶橙染色熒光顯微鏡直接鏡檢（acridine orange direct count，AODC）法、活菌直接鏡檢（direct viable count，DVC）法和異養(yǎng)平板計(jì)數(shù)（heterotrophic plate count，HPC）法三者相結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)VBNC狀態(tài)菌的計(jì)數(shù)。

Zhu Lin等[67]通過(guò)Live/Dead BacLight細(xì)菌活力試劑盒、5-氰基-2,3-二聚四唑（5-cyano-2,3-ditolyltetrazolium chloride，CTC）對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色結(jié)合HPC的方法對(duì)死、活、可培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而計(jì)算出VBNC細(xì)胞數(shù)。Du Meng等[68]用AODC、DVC結(jié)合的方法檢測(cè)溶藻弧菌，發(fā)現(xiàn)4 ℃條件下總細(xì)胞數(shù)不變，但活菌數(shù)明顯下降，說(shuō)明有大量細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)。García-Hernández等[69]采用DVC和熒光原位（fluorescentin situhybridization，F(xiàn)ISH）雜交技術(shù)（DVC-FISH）和傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法，在不同溫度下對(duì)人工污染的食物基質(zhì)中感染致病菌的活細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和量化，總檢測(cè)和鑒定時(shí)間縮短了4 h，可以很好地彌補(bǔ)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)的缺點(diǎn)。光學(xué)檢測(cè)法結(jié)果直觀、清晰，但是細(xì)菌種類(lèi)之間沒(méi)有區(qū)分，可能導(dǎo)致對(duì)目標(biāo)菌株的錯(cuò)誤判斷。表2為常見(jiàn)的食源性致病菌VBNC狀態(tài)檢測(cè)方法比較。

表2 食源性致病菌VBNC狀態(tài)檢測(cè)方法比較Table 2 Molecular assays for detecting VBNC state of foodborne pathogens

為研究VBNC狀態(tài)的細(xì)菌，除了上述3 種主要的檢測(cè)方法外，還有酶分析法、種群基因檢測(cè)法、PMA-CPA檢測(cè)、免疫熒光和免疫傳感器等方法[80-81]。而大多數(shù)方法只考慮了1 種存活參數(shù)，如呼吸活性、膜完整性、代謝活性[82]，有一定的局限性。所以測(cè)定細(xì)胞的活力參數(shù)時(shí)，需要將幾種方式結(jié)合，從細(xì)胞的形態(tài)、呼吸活性和酶活性等方面進(jìn)行全面分析，使結(jié)果更有說(shuō)服力。并且針對(duì)不同的致病菌、實(shí)驗(yàn)條件、研究?jī)?nèi)容，必須謹(jǐn)慎選擇各自的方法。

4 結(jié) 語(yǔ)

食源性致病菌可在不利于自身生長(zhǎng)的環(huán)境條件下進(jìn)入VBNC狀態(tài)來(lái)維持自身生存，反觀大多數(shù)影響致病菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的條件與食品生產(chǎn)加工存儲(chǔ)方式密切相關(guān)，如低溫冷藏、高溫消毒、紫外線殺菌以及食品添加劑等。進(jìn)入VBNC狀態(tài)而未被殺死的食源性致病菌，一方面會(huì)導(dǎo)致常規(guī)方法對(duì)食源性致病菌VBNC狀態(tài)的漏檢，另一方面會(huì)造成食品安全問(wèn)題。因此針對(duì)目前食源性致病菌VBNC狀態(tài)的研究展望如下：1）加強(qiáng)對(duì)VBNC細(xì)菌復(fù)蘇條件優(yōu)化的研究。從目前的研究來(lái)看，VBNC狀態(tài)細(xì)菌復(fù)蘇主要是采用簡(jiǎn)單的升溫和培養(yǎng)基內(nèi)添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方式，今后應(yīng)考慮依靠食品基質(zhì)來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)條件復(fù)蘇，如把VBNC狀態(tài)的致病菌接種在新鮮水果、蔬菜、肉類(lèi)上以實(shí)現(xiàn)復(fù)蘇，這樣更加接近于食源性致病菌的生存環(huán)境；2）深入探討細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)后與正常生理狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異。目前的研究主要集中在影響細(xì)菌進(jìn)入VBNC的因素，缺乏針對(duì)食源性致病菌VBNC狀態(tài)以及復(fù)蘇狀態(tài)下全面的毒力基因、耐藥基因、運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因等的表達(dá)；目前關(guān)于細(xì)菌VBNC狀態(tài)形成及復(fù)蘇機(jī)制研究較少，且不同菌的生理生化特性不同，很難建立統(tǒng)一的機(jī)制；在以后的研究中通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的聯(lián)合分析，研究VBNC狀態(tài)形成機(jī)制和復(fù)蘇機(jī)制可能是未來(lái)食源性致病菌VBNC狀態(tài)研究的一個(gè)熱點(diǎn)；3）研發(fā)針對(duì)VBNC狀態(tài)細(xì)菌更加全面有效的檢測(cè)方法?，F(xiàn)有方法來(lái)看還存在一些不足，如目前對(duì)于VBNC狀態(tài)細(xì)菌的檢測(cè)還無(wú)法區(qū)分不同狀態(tài)下的細(xì)菌，需要提高靈敏度和精確度，開(kāi)發(fā)更多、更簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法來(lái)避免漏檢情況出現(xiàn)，為食品安全檢測(cè)、疾病預(yù)防提供更為有效的方法和途徑；4）深入探討細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的時(shí)間。由于檢測(cè)方法的限制，大部分VBNC細(xì)菌仍會(huì)逃過(guò)檢測(cè)，并且也無(wú)法判斷分離檢測(cè)出的細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的時(shí)間，對(duì)人類(lèi)的危害風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估仍是一個(gè)難點(diǎn)；5）研發(fā)分離VBNC狀態(tài)菌的方法。分離VBNC狀態(tài)菌也是非常困難的，需要研發(fā)更準(zhǔn)確、高效的技術(shù)來(lái)突破這一難關(guān)；6）深入研究亞致死損傷細(xì)胞、休眠細(xì)胞、VBNC細(xì)胞之間的區(qū)別。目前雖有大量研究證明VBNC狀態(tài)細(xì)胞可以復(fù)蘇成功，但研究VBNC狀態(tài)復(fù)蘇成功與否卻存在爭(zhēng)議，關(guān)于復(fù)蘇的是亞致死細(xì)胞還是VBNC細(xì)胞尚不清楚，且這兩者有極大的相似之處，因此需要深入探討這幾種細(xì)胞之間的生理生化特性，以判斷真正被復(fù)蘇的細(xì)胞。