蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)及共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分的研究進(jìn)展

梁洛丹，曹偉偉，李琳琳，任廣躍，陳俊亮，許韓山，段 續(xù),*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000；2.杭州市臨平區(qū)質(zhì)量計(jì)量監(jiān)測(cè)中心，浙江 杭州 311199）

蛋白質(zhì)和多糖作為食品中兩類主要的大分子，被廣泛用作納米粒子的壁材及乳液的穩(wěn)定劑。采用蛋白質(zhì)和多糖作為天然的生物聚合物包埋活性成分，具有操作簡(jiǎn)單、低成本和重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[3]。蛋白質(zhì)和多糖在一定條件下會(huì)發(fā)生相互作用，這有助于形成具有許多特異特征的納米結(jié)構(gòu)，如較好的生物相容性、可生物降解、位點(diǎn)特異性傳遞、有效控制釋放等優(yōu)點(diǎn)。利用蛋白質(zhì)和多糖相互作用產(chǎn)生的復(fù)合物來(lái)保護(hù)生物活性成分和提高其生物利用度的研究已有報(bào)道，如王植等[4]報(bào)道了美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物在遞送生物活性物質(zhì)方面的應(yīng)用研究進(jìn)展；Liu Fuguo等[5]主要綜述了蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)復(fù)合物、多糖-多糖共價(jià)復(fù)合物及蛋白質(zhì)-多糖-多酚共價(jià)復(fù)合物的制備方法及其對(duì)遞送活性物質(zhì)生物利用度的影響；Wei Zihao等[6]總結(jié)了不同類型的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物的制備方法，介紹了核殼粒子、微膠囊及分子復(fù)合物等方法在遞送活性成分方面的應(yīng)用進(jìn)展。然而，目前關(guān)于反溶劑沉淀法、pH驅(qū)動(dòng)法、熱凝膠法等方法同時(shí)在蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)和非共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分方面的系統(tǒng)綜述鮮有報(bào)道。因此，本綜述對(duì)蛋白質(zhì)和多糖共價(jià)復(fù)合物及非共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分均進(jìn)行了詳細(xì)闡述，總結(jié)了反溶劑沉淀法、pH驅(qū)動(dòng)法、熱凝膠法和乳化法在蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物遞送活性成分中的應(yīng)用情況，以期為制備蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物包埋生物活性成分提供借鑒。

1 蛋白質(zhì)與多糖的非共價(jià)及共價(jià)復(fù)合物的形成

1.1 蛋白質(zhì)與多糖的非共價(jià)復(fù)合物形成

蛋白質(zhì)與多糖非共價(jià)復(fù)合物的形成主要通過(guò)相對(duì)較弱的物理相互作用，如靜電相互作用、空間排斥、疏水相互作用、氫鍵等，這些物理相互作用對(duì)于在一相中形成復(fù)合物并在兩相中凝聚或沉淀是有利的[7]。由于蛋白質(zhì)和多糖在溶液中主要以帶電分子的形式存在，所以，靜電相互作用是蛋白質(zhì)和多糖之間主要的作用形式[8]。因此，蛋白質(zhì)和多糖結(jié)構(gòu)中所帶電荷的高低是影響蛋白質(zhì)和多糖形成非共價(jià)復(fù)合物的重要因素。如果溶解在水中的蛋白質(zhì)和多糖同時(shí)攜帶相反的電荷，二者通過(guò)靜電絡(luò)合較易形成復(fù)合的生物聚合物，并最終變成均相[9]。隨著體系自由能的降低，生物聚合物會(huì)進(jìn)一步發(fā)生聚集、沉淀等現(xiàn)象。如果同時(shí)溶解在水中的蛋白質(zhì)和多糖攜帶相同的電荷，則兩者之間的靜電斥力會(huì)增加，最終形成兩相溶液。具有弱聚電解質(zhì)的蛋白質(zhì)和多糖是以熵驅(qū)動(dòng)機(jī)制形成非共價(jià)復(fù)合物的[10]，在這種情況下，二者可以發(fā)生疏水相互作用、氫鍵和空間排斥等相互作用，從而形成聚集、凝聚或相分離形式的生物聚合物。當(dāng)溶液的pH值大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)和多糖具有相似的電荷，兩者之間可能會(huì)發(fā)生氫鍵結(jié)合。當(dāng)溶液中粒子相互靠近時(shí)，可能會(huì)發(fā)生范德華力，使兩者之間引力增大。因此，外界條件及蛋白質(zhì)和多糖的理化性質(zhì)是形成均相的蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物的關(guān)鍵因素。

蛋白質(zhì)和多糖之間的作用力不僅會(huì)受到大分子的類型、分子結(jié)構(gòu)等內(nèi)在因素的影響，而且會(huì)受到pH值、溫度、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)/多糖比例等外在因素的影響（圖1）[11]。溫度會(huì)影響蛋白質(zhì)和多糖的構(gòu)象，導(dǎo)致更多相互作用的位點(diǎn)暴露出來(lái)，低溫有利于氫鍵的形成，而提高溫度會(huì)增強(qiáng)疏水相互作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物形成[12]。Liu Shuanghui等[13]發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)改變溫度改善豌豆分離蛋白和阿拉伯樹(shù)膠之間的絡(luò)合作用。Chen Feiping等[14]發(fā)現(xiàn)在酸性條件下大豆分離蛋白通過(guò)靜電和疏水相互作用與大豆多糖結(jié)合，形成的復(fù)合物可用于包埋姜黃素以改善其水溶性和穩(wěn)定性。Liu Jun等[15]研究發(fā)現(xiàn)pH值會(huì)影響蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物的電荷密度，使制備的牛血清白蛋白-亞麻籽膠復(fù)合物在不同pH值下表現(xiàn)出不同的粒度分布。綜上，根據(jù)蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物的形成機(jī)理和影響因素，可以制備特定的生物聚合物包封活性成分，以滿足不同包埋方法的特殊需求。

1.2 蛋白質(zhì)與多糖的共價(jià)復(fù)合物形成

蛋白質(zhì)與多糖共價(jià)復(fù)合物的形成方法有美拉德反應(yīng)和酶催化反應(yīng)，常見(jiàn)的蛋白質(zhì)和多糖共價(jià)復(fù)合物主要是通過(guò)美拉德反應(yīng)來(lái)獲得的。美拉德反應(yīng)可分為早期、中期和晚期3 個(gè)階段，早期階段會(huì)發(fā)生羰氨縮合和分子重排，中期階段會(huì)發(fā)生Amadori產(chǎn)物或Heyns產(chǎn)物的降解，晚期階段發(fā)生環(huán)化、脫水、異構(gòu)化、縮合等反應(yīng)，生成含氮大分子物質(zhì)類黑精[4]。美拉德反應(yīng)是蛋白質(zhì)的氨基與多糖的羰基發(fā)生的羰氨反應(yīng)，主要產(chǎn)物為類黑精及一系列中間體還原酮、醛類及揮發(fā)性雜環(huán)化合物。蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物主要形成于美拉德反應(yīng)早期階段，蛋白質(zhì)中的氨基特別是賴氨酸上的?-氨基與多糖中的還原羰基之間通過(guò)共價(jià)鍵發(fā)生縮合反應(yīng)，形成N-糖基胺，并失去1 個(gè)水分子。不穩(wěn)定的N-糖基胺發(fā)生不可逆的Amadori電子重排，形成了具有1-氨基-1-脫氧酮糖結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物（圖2）[16]。

圖2 蛋白質(zhì)和多糖通過(guò)美拉德反應(yīng)形成復(fù)合物的機(jī)理[8]Fig. 2 Mechanism of the formation of protein-polysaccharide complexes through Maillard reaction[8]

影響美拉德反應(yīng)的重要因素有時(shí)間、溫度、pH值、水分活度、亞硫酸鹽、反應(yīng)中可用的氨基化合物及羰基的數(shù)量等。如對(duì)于堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸）更易發(fā)生美拉德反應(yīng)，美拉德反應(yīng)速率隨溫度升高而增大，此外，當(dāng)反應(yīng)體系的水分活度在0.3～0.7時(shí)反應(yīng)可達(dá)到最大速率。多糖是高度穩(wěn)定、安全無(wú)毒和可生物降解的天然聚合物，由多種多樣的活性基團(tuán)組成，這導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的可變性，多糖的這些優(yōu)點(diǎn)可在與蛋白質(zhì)的接枝反應(yīng)中應(yīng)用。多糖的種類、結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量等特性也會(huì)影響美拉德反應(yīng)的速率。Niu Liya等[17]研究發(fā)現(xiàn)多糖的分子質(zhì)量對(duì)于共價(jià)復(fù)合物的功能性質(zhì)很重要，木糖與蛋白質(zhì)的接枝程度最高，而麥胚蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的溶解性和乳化穩(wěn)定性要顯著高于其他幾種復(fù)合物。通過(guò)美拉德反應(yīng)制備的蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物可以改善蛋白質(zhì)的乳化性、發(fā)泡性、凝膠性和熱穩(wěn)定性等功能特性，可用作遞送活性成分的載體，用來(lái)封裝保護(hù)活性成分，以提高其生物利用度。如Fan Yuting等[18]制備了由乳清蛋白-右旋糖酐共軛物穩(wěn)定的β-胡蘿卜素納米乳液，負(fù)載β-胡蘿卜素的納米乳液在25 ℃和50 ℃下存儲(chǔ)30 d，仍具有較好的穩(wěn)定性，且該共軛物可作為乳化劑提高β-胡蘿卜素在胃腸道中的穩(wěn)定性和生物可及性。Yang Yuexi等[19]發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白和多糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以在熱處理和模擬胃腸消化條件下長(zhǎng)時(shí)間保持檸檬酸乳液的物理穩(wěn)定性。Wang Chaonan等[20]通過(guò)美拉德反應(yīng)制備牛血清白蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物負(fù)載姜黃素，提高了姜黃素在胃腸道中的穩(wěn)定性。

酶催化法是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶通過(guò)催化氨基糖上的伯氨基團(tuán)和蛋白質(zhì)多肽鏈中的?；w，將具有伯胺基團(tuán)的氨基糖分子結(jié)合到蛋白質(zhì)分子中，從而制備糖基化蛋白質(zhì)（即蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物）的方法[21]。例如在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的催化作用下，殼聚糖上的氨基和小麥醇溶蛋白中的谷氨酰胺殘基發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，改變殼聚糖的結(jié)構(gòu)，使殼聚糖與小麥醇溶蛋白發(fā)生共價(jià)結(jié)合[22]。溫度、pH值、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)種類、酶濃度等的變化均會(huì)影響酶催化，從而使糖基化蛋白質(zhì)的功能特性發(fā)生不同程度的改變[23]。Fu Miao等[24]的研究表明酶催化大豆蛋白和多糖共價(jià)結(jié)合后，使糖基化大豆蛋白可以結(jié)合更多的水，比純大豆蛋白的水合作用更大。王坦等[25]通過(guò)酶催化法制備出了胺乙基殼聚糖-膠原蛋白肽復(fù)合物，該復(fù)合物具有很好的羥自由基清除能力和鐵離子還原能力。朱常月[26]利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，分別催化酪蛋白和大豆蛋白與殼聚糖降解物發(fā)生糖基化交聯(lián)反應(yīng)，制備糖基化產(chǎn)物，結(jié)果表明糖基化酪蛋白的流變學(xué)性質(zhì)和持水性均得到顯著改善，糖基化大豆蛋白與大豆蛋白相比有較高的持水性和吸油性。

“底本”(Pre-Narrated)與“述本”(Narrated)是敘述學(xué)中的基本概念，按照趙毅衡的說(shuō)法，“述本就是‘?dāng)⑹鑫谋尽?，底本并非文本之底，而是敘述之所‘本’，?yīng)當(dāng)被理解為述本形成之前的敘述形態(tài)?！盵注]趙毅衡：《廣義敘述學(xué)》，第121頁(yè)。述本的概念比較容易理解。任何已經(jīng)成形的敘述文本，比如一部上映的電影或是一則見(jiàn)報(bào)的新聞都可視為一個(gè)“述本”。那么述本成形之前的底本是否可見(jiàn)呢？答案是否定的。

2 蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物包埋活性成分的方法

2.1 反溶劑沉淀法

2.1.1 反溶劑沉淀法的原理及影響因素

反溶劑沉淀法涉及溶劑互混理論和生物聚合物自組裝的熱力學(xué)過(guò)程理論。其原理是通過(guò)控制溶解生物活性物質(zhì)溶劑量的減少，導(dǎo)致生物聚合物的自組裝，從而形成納米粒子（圖3）。將溶解在純乙醇中的親脂性生物活性物質(zhì)在溫和攪拌條件下滴入蛋白質(zhì)溶液中，通過(guò)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法將乙醇去除，然后將混合物添加到多糖溶液中，從而得到包埋生物活性物質(zhì)的蛋白質(zhì)-多糖納米粒子[27]。常用的脫溶劑包括乙醇、丙酮和水，這取決于所選擇的溶解生物聚合物和芯材的溶劑類型。反溶劑沉淀法的影響因素有生物聚合物類型、攪拌強(qiáng)度、pH值、離子強(qiáng)度、脫溶劑的流速和體積、交聯(lián)劑的濃度、芯材的用量等。作為制備蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物包埋生物活性物質(zhì)的常用方法之一，反溶劑沉淀法具有多種優(yōu)勢(shì)，如操作在低溫下進(jìn)行，能夠有效保護(hù)熱不穩(wěn)定的活性化合物，而且不需要專門的設(shè)備和復(fù)雜的操作條件。

圖3 反溶劑沉淀法制備納米粒子的流程Fig. 3 Process flow chart of preparation of nanoparticles by liquid antisolvent precipitation

2.1.2 反溶劑沉淀法在蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分中的應(yīng)用

反溶劑沉淀法制備的非共價(jià)蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物-多酚納米粒子可以提高多酚的包埋率、穩(wěn)定性和抗氧化活性等特性。例如Dai Lei等[28]成功制備玉米醇溶蛋白-鼠李糖脂非共價(jià)復(fù)合物包埋姜黃素，與未包埋的姜黃素相比，該復(fù)合物可以更好地防止姜黃素被光降解，提高了姜黃素的穩(wěn)定性。Li Hao等[29]使用反溶劑沉淀法實(shí)現(xiàn)了玉米醇溶蛋白-大豆多糖非共價(jià)復(fù)合物包封葉黃素，復(fù)合物中的葉黃素在保存15 d后仍能保留96%左右，而未包封的葉黃素降解率超過(guò)50%，表明復(fù)合物對(duì)葉黃素起到了較好的保護(hù)作用。Li Juan等[30]使用反溶劑沉淀法制備了玉米醇溶蛋白-阿拉伯樹(shù)膠非共價(jià)復(fù)合物包埋生育酚的納米粒子，該納米粒子實(shí)現(xiàn)了在模擬胃腸消化過(guò)程中對(duì)生育酚的緩慢釋放。

2.1.3 反溶劑沉淀法在蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分中的應(yīng)用

反溶劑沉淀法也被應(yīng)用于蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分方面，以改善生物活性物質(zhì)的功能。據(jù)Wu Nana等[31]的報(bào)道，通過(guò)反溶劑沉淀法制備的β-甘氨酸-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物納米顆粒具有較高的表面疏水性，能增強(qiáng)分子間相互作用，使其具有較高的界面張力和膨脹模量，其共價(jià)復(fù)合物的這些特性在遞送生物活性物質(zhì)方面有較大的應(yīng)用潛力。Davidov-Pardo等[32]通過(guò)美拉德反應(yīng)制備了玉米醇溶蛋白-右旋糖酐共價(jià)復(fù)合物，并采用反溶劑沉淀法得到了負(fù)載白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白-右旋糖酐復(fù)合物納米粒子，該納米粒子在pH值、溫度等條件改變時(shí)仍可保持白藜蘆醇的穩(wěn)定性。Davidov-Pardo等[33]采用美拉德反應(yīng)制備出玉米醇溶蛋白-葡聚糖復(fù)合物，通過(guò)反溶劑沉淀法將白藜蘆醇包埋在復(fù)合物中，結(jié)果表明該復(fù)合物納米粒子阻止了紫外光誘導(dǎo)的白藜蘆醇異構(gòu)化，并可保持其在胃腸條件下的穩(wěn)定性。這些研究為反溶劑沉淀法在蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物包埋活性成分方面的應(yīng)用提供了良好的借鑒。

2.2 pH驅(qū)動(dòng)法

2.2.1 pH驅(qū)動(dòng)法的原理及影響因素

一般來(lái)說(shuō)，大多數(shù)蛋白質(zhì)和多糖的電荷密度和分布較易被氫離子和氫氧根離子的濃度調(diào)節(jié)。因此，pH驅(qū)動(dòng)法只需要調(diào)節(jié)溶液的pH值，將pH值設(shè)定在多糖的酸度系數(shù)和蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)之間，使蛋白質(zhì)和多糖形成復(fù)合物，然后加入生物活性成分，即可制備負(fù)載活性成分的納米粒子（圖4）。如酪蛋白顆粒在堿化過(guò)程中分子質(zhì)量降低，姜黃素等生物活性物質(zhì)在中性和酸性條件下不溶，在堿性條件下溶解，它們可以與堿性條件下解離的酪蛋白共溶解，并在酸化過(guò)程中被包封在自組裝的酪蛋白納米顆粒中[34]。pH驅(qū)動(dòng)法的影響因素有蛋白質(zhì)類型、蛋白質(zhì)濃度、多糖濃度、交聯(lián)劑種類、溶液混合和酸化的順序等。pH驅(qū)動(dòng)法作為一種簡(jiǎn)便且綠色的方法，在蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物包埋生物活性物質(zhì)方面得到了廣泛的應(yīng)用。

圖4 pH驅(qū)動(dòng)法制備納米粒子的流程Fig. 4 Process flow char of preparation of nanoparticles by pH-driving method

2.2.2 pH驅(qū)動(dòng)法在蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分中的應(yīng)用

無(wú)論生物聚合物溶液發(fā)生酸化或堿化，pH驅(qū)動(dòng)的蛋白質(zhì)和帶相反電荷的多糖之間的非共價(jià)作用都被證實(shí)對(duì)生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性和抗氧化性等方面有重要作用。例如，Hosseini等[35]采用pH驅(qū)動(dòng)法制備了姜黃素-β-乳球蛋白-海藻酸鈉非共價(jià)納米復(fù)合物，在水中低溶解度的姜黃素成功地被包埋在靜電穩(wěn)定的由β-乳球蛋白-海藻酸鈉相互作用產(chǎn)生的納米復(fù)合物中，所制備的可溶性納米復(fù)合物具有良好的抗聚集穩(wěn)定性。Xie Hujun等[36]通過(guò)pH驅(qū)動(dòng)法實(shí)現(xiàn)了姜黃素在卵清蛋白-κ-角叉菜膠非共價(jià)復(fù)合物納米顆粒中的包封，負(fù)載的姜黃素顯示出較高的抗氧化活性，且其熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性均有所增加。Razi等[37]使用酪蛋白酸鹽和殼聚糖作為包埋壁材，通過(guò)pH驅(qū)動(dòng)法制備了負(fù)載姜黃素的蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物納米粒子。與游離姜黃素相比，負(fù)載姜黃素的納米復(fù)合物顯著增強(qiáng)了姜黃素在水中的溶解性和穩(wěn)定性。

2.2.3 pH驅(qū)動(dòng)法在蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)和多糖可以在天然蛋白的等電點(diǎn)處發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成具有納米結(jié)構(gòu)的球形膠束包埋生物活性物質(zhì)。例如，Pan Xiaoyun等[38]使用美拉德反應(yīng)制備出酪蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物，通過(guò)pH驅(qū)動(dòng)法將β-胡蘿卜素包埋在復(fù)合物中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)pH值、溫度和離子濃度等外界條件變化時(shí)，負(fù)載β-胡蘿卜素的納米顆粒仍表現(xiàn)出很強(qiáng)的穩(wěn)定性。Meng Jun等[39]通過(guò)美拉德反應(yīng)制備出酪蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物，采用pH驅(qū)動(dòng)法將姜黃素包埋在共價(jià)復(fù)合物中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，包埋后的納米顆粒表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性、胃腸穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。未來(lái)還需進(jìn)行更多的研究來(lái)探索pH驅(qū)動(dòng)法在其他蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物包封生物活性物質(zhì)中的應(yīng)用可能性。

2.3 熱凝膠法

2.3.1 熱凝膠法的原理及影響因素

變性可使天然蛋白質(zhì)的功能得到修飾，加熱是常見(jiàn)的變性方法，也是蛋白質(zhì)類食品加工中最直接、綠色的方法。熱凝膠法是將溶液的pH值調(diào)整為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)值，將溶液加熱到高于蛋白質(zhì)的變性溫度，使蛋白質(zhì)與多糖可以相互作用，形成具有膠體穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物納米顆粒以負(fù)載活性成分（圖5）。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處的凈電荷為零，此時(shí)靜電斥力最小，疏水相互作用較強(qiáng)，因此，將溶液的pH值選擇在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)可防止其形成可溶性聚集體[40]。熱凝膠法的關(guān)鍵步驟是加熱和調(diào)節(jié)溶液pH值，前者可使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，后者可使蛋白質(zhì)通過(guò)非靜電作用等形式與多糖形成納米粒子，以此來(lái)包埋生物活性物質(zhì)。影響熱凝膠法的因素有溶液的pH值、加熱溫度和加熱時(shí)間等。由于熱凝膠法易于操作且無(wú)需專門設(shè)備，此方法也常用于制備蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物來(lái)包埋生物活性物質(zhì)。

圖5 熱凝膠法制備納米粒子的流程Fig. 5 Process flow chart of preparation of nanoparticles by thermal gelation

2.3.2 熱凝膠法在蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分中的應(yīng)用

對(duì)于熱凝膠法而言，選擇合適的加熱溫度和時(shí)間，可以形成穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物，進(jìn)一步提高其包埋的生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性和生物利用度。例如，Xiong Wenfei等[41]通過(guò)熱凝膠法制備了卵清蛋白-羧甲基纖維素復(fù)合物納米粒子，并將白藜蘆醇包埋在納米粒子中，與天然白藜蘆醇相比，納米粒子包埋的白藜蘆醇光穩(wěn)定性和生物可及性均有所提高。Ding Xuzhe等[42]使用熱凝膠法通過(guò)調(diào)節(jié)pH值和溫度制備了負(fù)載葉酸的大豆蛋白-大豆可溶性多糖納米粒子，結(jié)果表明，該納米粒子可使葉酸對(duì)溫度、光照表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性，并在中性pH值下快速釋放。然而，該方法不適用于所有生物活性物質(zhì)，如Arroyo-Maya等[43]使用熱凝膠法制備了乳清蛋白分離物和甜菜果膠復(fù)合物納米顆粒負(fù)載花青素，結(jié)果表明，加熱處理使花青素的結(jié)構(gòu)遭到破壞，與未負(fù)載的花青素相比，在負(fù)載的花青素納米顆粒中觀察到較低的抗氧化活性，即熱凝膠法不適用于花青素的包埋。因此，使用熱凝膠法包埋時(shí)要選擇合適的加熱溫度和時(shí)間，以保證形成穩(wěn)定性高的負(fù)載生物活性物質(zhì)的納米顆粒。

2.3.3 熱凝膠法在蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分中的應(yīng)用

作為制備以大分子聚合物為包封材料的核殼結(jié)構(gòu)納米粒子技術(shù)，熱凝膠法也被廣泛應(yīng)用于制備蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物納米粒子。蛋白質(zhì)在加熱到其變性溫度或與多糖發(fā)生糖基化反應(yīng)時(shí)，可以增加其疏水性，使其更適合用作包封親脂性生物活性物質(zhì)的核心材料。此外，由于多糖組成的殼是親水性的，使納米顆?？扇苡谒?。因此，熱凝膠法也可用于蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物包埋脂溶性生物活性物質(zhì)。如Fan Yuting等[44]使用熱凝膠法制備出牛血清白蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物納米顆粒包埋姜黃素，與游離姜黃素相比，牛血清白蛋白-葡聚糖納米顆粒中的姜黃素顯示出更好的穩(wěn)定性。此外，牛血清白蛋白-葡聚糖納米顆粒還可改善姜黃素的抗氧化活性。Feng Jin等[45]使用熱凝膠法制備卵清蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物納米顆粒來(lái)包埋姜黃素。結(jié)果表明，這些納米顆粒顯示出球形結(jié)構(gòu)，可使姜黃素的穩(wěn)定性、再分散性和生物利用度得到改善。Qi Jianing等[46]使用熱凝膠法制備出牛血清白蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物納米顆粒，將納米顆粒的pH值調(diào)為7.4后，利用納米顆粒與阿霉素之間的靜電作用和疏水相互作用，可有效地將阿霉素包埋在納米顆粒中，該納米顆?？娠@著降低阿霉素的毒性。

2.4 乳化法

2.4.1 乳化法的原理及影響因素

乳化法是通過(guò)合適的乳化劑或表面活性劑使兩種或更多種不相溶的溶液相同時(shí)溶解，增加了在相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)下油水混合的可能性，從而克服了生物活性物質(zhì)的水不溶性或油不溶性問(wèn)題。蛋白質(zhì)具有表面活性，可作為有效的乳化劑，通過(guò)靜電相互作用等形式賦予乳液較好的膠體穩(wěn)定性。但有些蛋白質(zhì)是難溶的，通過(guò)與多糖形成非共價(jià)或共價(jià)復(fù)合物，可以調(diào)控液相的流變學(xué)特性，進(jìn)一步增強(qiáng)乳液的穩(wěn)定性[10]。將生物活性物質(zhì)溶液加入到蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物穩(wěn)定的水包油或油包水的乳液中，經(jīng)高速剪切、高壓均質(zhì)或微流化等操作進(jìn)一步形成微乳液，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物穩(wěn)定的乳液對(duì)生物活性物質(zhì)的遞送（圖6），這些乳狀液具有提高生物活性物質(zhì)穩(wěn)定性及使活性物質(zhì)在胃腸道條件下延緩釋放的作用。影響乳化法的因素主要有乳液的類型、生物活性物質(zhì)的類型、剪切速度和時(shí)間、溫度等。乳化法在蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物遞送活性成分方面得到了廣泛應(yīng)用。

圖6 乳化法制備納米粒子的流程Fig. 6 Process flow chart of preparation of nanoparticles by emulsification

2.4.2 乳化法在蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分中的應(yīng)用

由于乳液特有的理化性質(zhì)，疏水性和親水性生物活性物質(zhì)大都可以被包埋于蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液中。Esfanjani等[47]使用乳化法制備了由乳清蛋白濃縮物/麥芽糖糊精/果膠穩(wěn)定的遞送藏紅花、番紅花中生物活性成分的乳液，即使在30 ℃下儲(chǔ)存22 d后，載有生物活性物質(zhì)的乳液仍可保持穩(wěn)定的納米級(jí)結(jié)構(gòu)，表明蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液具有良好的遞送活性成分的性質(zhì)。Cheng Hao等[48]采用乳液均質(zhì)化方法實(shí)現(xiàn)了酪蛋白酸鈉-果膠或阿拉伯樹(shù)膠復(fù)合物納米顆粒在水包油乳液中對(duì)α-生育酚和白藜蘆醇的共包封作用。結(jié)果表明，該納米顆?？筛纳痞?生育酚和白藜蘆醇在儲(chǔ)存和體外消化過(guò)程中的穩(wěn)定性，提高它們的生物可及性，進(jìn)一步表明蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物具有穩(wěn)定包封脂溶性活性成分乳液的優(yōu)勢(shì)。張羽[49]制備了由玉米醇溶蛋白-改性淀粉非共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的Pickering乳液，用于姜黃素和VC的遞送，該乳液對(duì)兩種活性物質(zhì)都有接近90%的包埋率，模擬小腸消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Pickering乳液提高了姜黃素及VC的穩(wěn)定性及生物利用率。乳化法也可以與噴霧干燥和冷凍干燥等脫水方法結(jié)合，用來(lái)制備蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)復(fù)合物負(fù)載生物活性物質(zhì)的固體納米粒子，使生物活性物質(zhì)具有更好的穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的保質(zhì)期[50]。Assadpour等[51]通過(guò)乳化法成功制備出麥芽糖糊精-乳清蛋白復(fù)合物穩(wěn)定葉酸的油包水納米乳液，在250 kPa、進(jìn)風(fēng)溫度（180±5）℃、出風(fēng)溫度（90±5）℃、進(jìn)料速率450 mL/h的條件下使用噴霧干燥將乳液轉(zhuǎn)化為粉末，使葉酸成功地包埋在固體納米粒子中，為強(qiáng)化水溶性營(yíng)養(yǎng)成分的固體食品提供了參考。Assadpour等[52]研究了果膠-乳清蛋白復(fù)合物穩(wěn)定葉酸的水包油包水乳液，通過(guò)果膠-乳清蛋白復(fù)合物乳化劑的作用，有效地控制了葉酸從水包油包水乳液內(nèi)相到外相的運(yùn)輸，并在保質(zhì)期內(nèi)保持了其完整性。

2.4.3 乳化法在蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物包埋活性成分中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物可以通過(guò)乳化法實(shí)現(xiàn)對(duì)生物活性物質(zhì)的包封。如Fan Yuting等[53]使用乳化法制備了天然乳清蛋白分離物-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物遞送β-胡蘿卜素的納米乳液，并評(píng)估了不同糖基化分子質(zhì)量對(duì)β-胡蘿卜素的物理、化學(xué)性質(zhì)和生物可及性的影響。結(jié)果顯示，低分子質(zhì)量的葡聚糖接枝物（5 kDa和20 kDa）不會(huì)影響β-胡蘿卜素的生物可及性，高分子質(zhì)量（70 kDa）的葡聚糖接枝物可以降低β-胡蘿卜素的釋放速率，即高分子質(zhì)量的葡聚糖接枝物可用于調(diào)節(jié)活性成分的生物利用度。乳化法同樣可以用于蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物對(duì)兩種生物活性物質(zhì)的共包埋。Yi Jiang等[54]制備出乳清分離蛋白-葡聚糖復(fù)合物穩(wěn)定的負(fù)載β-胡蘿卜素和白藜蘆醇的乳液，該復(fù)合物使納米乳液的穩(wěn)定性提高，并顯著提高了負(fù)載的β-胡蘿卜素在光和熱處理下的穩(wěn)定性，這一研究結(jié)果為可食用乳化劑的制備和開(kāi)發(fā)提供了借鑒。在制備蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的負(fù)載生物活性物質(zhì)的乳液后，使用噴霧干燥處理也可獲得相應(yīng)的固體納米顆粒。如Shah等[55]在制備乳清蛋白分離物-麥芽糖糊精共價(jià)復(fù)合物后，使用乳化法得到包埋丁香酚的納米乳液，采用噴霧干燥獲得固體納米粒子。該復(fù)合物改善了丁香酚的溶解度，在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處得到的納米粒子仍可保持良好的溶解度，表明納米粒子在功能性飲料中遞送親脂性生物活性物質(zhì)時(shí)，可能不會(huì)對(duì)飲料視覺(jué)外觀產(chǎn)生不利影響。因此，蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物為乳化法遞送生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性提供了借鑒。

以上4 種方法在蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物遞送活性成分中的應(yīng)用及優(yōu)、缺點(diǎn)如表1所示。

表1 蛋白質(zhì)-多糖非共價(jià)及共價(jià)復(fù)合物包埋活性物質(zhì)的方法Table 1 Methods of encapsulating bioactive substances in protein-polysaccharide non-covalent and covalent complexes

3 結(jié) 語(yǔ)

大多數(shù)生物活性物質(zhì)在胃腸道中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，這導(dǎo)致其在體內(nèi)的生物利用度較低。通過(guò)包埋或者合理的遞送體系可以提高活性成分在不利環(huán)境下的穩(wěn)定性，提高其生物利用度，有效保證其發(fā)揮健康功效。蛋白質(zhì)和多糖作為食品中來(lái)源廣泛的天然生物大分子，二者之間的非共價(jià)相互作用（如靜電和疏水相互作用、氫鍵）或共價(jià)相互作用（如糖基化）可用來(lái)制備蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物，以微膠囊、乳液等遞送系統(tǒng)的形式實(shí)現(xiàn)對(duì)活性成分的包封保護(hù)、達(dá)到良好的遞送和控釋等效果。因此，蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物是遞送生物活性物質(zhì)的有效載體，可用于設(shè)計(jì)功能性食品。然而，目前關(guān)于蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物包埋活性成分的研究主要集中在遞送體系對(duì)活性成分的保護(hù)作用方面，未來(lái)應(yīng)開(kāi)展更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)結(jié)合代謝組學(xué)方法探究復(fù)合物封裝的生物活性物質(zhì)在血液和肝、腎、腦等器官中的積累量及其代謝物的種類、含量，探究復(fù)合物包封的活性成分母體及其代謝物的生理活性。此外，應(yīng)采用分子模擬、分子動(dòng)力學(xué)、多光譜手段及分子生物學(xué)方法探究蛋白質(zhì)-多糖相互作用發(fā)揮保護(hù)活性成分及影響活性成分在體內(nèi)吸收的機(jī)制，為活性成分在功能性食品中的應(yīng)用提供借鑒。