干燥方式對(duì)三七葉主要活性成分、體外抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性、揮發(fā)性成分和代謝物的影響

李云嵌，何霞紅，吳光順，滿金花，張雪春，王振興,*

（1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省林下資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224）

三七（Panax notoginseng(Burk.) F. H. Chen）為五加科人參屬多年生草本植物，主產(chǎn)于云南省文山州，主要以其干燥根莖入藥，具有化瘀止血、活血鎮(zhèn)痛等功效，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材[1]。三七葉（P. notoginsengleaves，PNL）是三七地上主要部分，也是三七生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，其富含皂苷、多酚、多糖、黃酮等活性成分，具有很高的食用和藥用價(jià)值[1]。云南當(dāng)?shù)匾恢庇惺秤肞NL的傳統(tǒng)，2016年云南省衛(wèi)生計(jì)生委正式批復(fù)同意將其作為普通地方特色食品原料[2]?！侗静菥V目》記錄PNL具有“治折傷、跌撲出血，敷之即止，青腫經(jīng)夜即散，余功同根”的功能，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗衰老、止血等功效[1,3]。Liu Fang等[4]利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜從PNL甲醇提取物中檢測(cè)到人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3以及三七皂苷Fc、Fe、Fd。但目前大部分PNL未被利用，常被丟棄，造成PNL資源的極大浪費(fèi)。三七的主要收獲季節(jié)集中在每年10月至次年1月，此間采收的大量新鮮PNL水分含量較高，采摘后容易發(fā)生萎蔫、腐爛，極大地限制了PNL的貯藏和加工利用。干燥是一種最常見(jiàn)的植物采摘后預(yù)處理和加工貯藏手段，對(duì)PNL進(jìn)行及時(shí)的干燥處理可避免其品質(zhì)劣變，有效延長(zhǎng)其保藏時(shí)間，有利于其運(yùn)輸和加工，對(duì)PNL的綜合利用有重要意義。目前已有學(xué)者利用干燥PNL開(kāi)發(fā)了氣泡水飲料[5]、醋[6]、桃酥[7]等產(chǎn)品。

在干燥過(guò)程中，植物原料中的熱敏性成分在熱、光等作用下會(huì)發(fā)生不同程度的降解與轉(zhuǎn)化[8]。不同干燥方式的處理?xiàng)l件和干燥機(jī)理不一致，因此具有不同的干燥效果，使得原料的化學(xué)成分、生物活性及感官特征存在差異。此外，干燥方式也影響著原料的揮發(fā)性成分以及代謝物的種類和含量。林羨等[9]比較了熱風(fēng)干燥（hot air drying，HAD）、真空微波干燥及真空冷凍干燥對(duì)辣木葉營(yíng)養(yǎng)活性成分、抗氧化活性及色澤的影響，結(jié)果表明真空微波干燥更適合作為辣木葉的干燥方式。趙珊等[10]研究發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥和蒸干結(jié)合HAD的甘薯葉中總酚含量（total phenolic content，TPC）和總黃酮含量（total flavonoids content，TFC）較高，且具有較強(qiáng)的抗氧化能力。真空冷凍干燥、遠(yuǎn)紅外干燥等新型干燥方式雖然可較好地保持樣品的品質(zhì)和活性，但存在設(shè)備昂貴或加工成本高等缺點(diǎn)。傳統(tǒng)曬干處理的干燥效率較低，產(chǎn)品質(zhì)量不佳，且受天氣影響較大。HAD、真空干燥（vacuum drying，VD）、熱泵干燥（heat pump drying，HPD）等基于熱加工的干燥處理方式憑借設(shè)備簡(jiǎn)單、效率高、成本低等特點(diǎn)，仍是目前較常用的處理手段。安朝麗門(mén)等[11]研究了HAD、HPD和微波干燥對(duì)滑子蘑中滋味物質(zhì)的影響；王兆凱等[12]綜述了預(yù)處理與干燥方式對(duì)枸杞干燥特性及品質(zhì)的影響，結(jié)果表明HPD可同時(shí)控制干燥濕度和干燥環(huán)境氣體種類，可替代商業(yè)生產(chǎn)中的傳統(tǒng)太陽(yáng)能干燥及HAD。但目前關(guān)于干燥方式尤其是熱處理對(duì)PNL的化學(xué)成分、功能活性、揮發(fā)性成分等方面的影響鮮有報(bào)道。

本研究以新鮮PNL為原料，分別采用HAD、HPD、VD對(duì)其進(jìn)行干燥處理，測(cè)定不同干燥方式下PNL的主要化學(xué)成分含量、體外抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，采用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）分析單體皂苷含量，并采用氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）分析不同干燥方式對(duì)其揮發(fā)性成分的影響，從而篩選出PNL的最適干燥方式，然后使用基于超高效液相色譜-四極桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的非靶向代謝組學(xué)分析干燥前后PNL的代謝物變化情況，對(duì)差異代謝物進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，探討PNL在干燥過(guò)程中可能的代謝途徑，以期為PNL的干燥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮PNL于2021年11月采收于云南省昆明市尋甸縣羊街鎮(zhèn)豐樂(lè)林下三七種植基地，選擇長(zhǎng)度范圍為5～9 cm、寬度范圍為3～4 cm的葉片用于實(shí)驗(yàn)。

纖維素酶（50 U/mg） 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；沒(méi)食子酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠；果膠酶（500 U/mg）、D(＋)-無(wú)水葡萄糖（純度≥98%）、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、阿卡波糖、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenylα-D-glucopyranoside，PNPG）、VC、三七總皂苷（P. notoginsengleaves saponins，PNLS）（純度≥90%）、人參皂苷Rb1（純度≥98%）、人參皂苷Rb3（純度≥97%）、三七皂苷Fc（純度≥98%）、三七皂苷Fe（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（700 000 U/mL） 北京索萊寶科技有限公司；蘆?。兌取?5%）、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT） 上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FD-304真空冷凍干燥機(jī) 濟(jì)南駿德儀器有限公司；DNF-4K智能熱泵烘干設(shè)備 北京東南風(fēng)科技有限公司；DZF-6090真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SB-400DTY超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；Infinite F50酶標(biāo)儀 帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；SC-80色差計(jì) 北京康光光學(xué)儀器有限公司；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；1260 HPLC儀 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；Flavour Spec?風(fēng)味分析儀 德國(guó)G.A.S.公司；Nexera X2 LC-30AD超高壓液相色譜儀 日本島津公司；Q Exactive Plus高分辨質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Concentrator plus真空離心濃縮儀 艾本德中國(guó)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PNL的不同干燥處理

分別稱取150 g左右的新鮮PNL，將其平鋪于不銹鋼托盤(pán)內(nèi)進(jìn)行不同干燥處理，厚度約為0.3 cm，干燥至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%以下，為保證干燥充分和統(tǒng)一干燥條件，所有干燥處理均在50 ℃下進(jìn)行24 h，為排除各樣品組之間因水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同造成的差異，后續(xù)所有計(jì)算均以樣品的干質(zhì)量計(jì)。樣品分組如下：1）新鮮（fresh，F(xiàn)）組，新鮮未經(jīng)處理的PNL；2）VD組，將PNL置于真空干燥箱中，溫度50 ℃，真空度65 Pa，干燥時(shí)間24 h，粉碎并過(guò)60 目篩后備用；3）HPD組，將PNL置于智能熱泵烘干設(shè)備中，溫度50 ℃，相對(duì)濕度0～5%，風(fēng)速0.8 m/s，干燥時(shí)間24 h，粉碎并過(guò)60 目篩后備用；4）HAD組，將PNL置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，溫度50 ℃，干燥時(shí)間24 h，風(fēng)速0.8 m/s，粉碎并過(guò)60 目篩后備用。

1.3.2 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》[13]中的直接干燥法測(cè)定水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 色澤的測(cè)定

使用色差儀分別測(cè)定新鮮PNL和干燥PNL的色澤（L*值（亮度）、a*值（紅綠度）、b*值（黃藍(lán)度）），按式（1）計(jì)算色差ΔE。

式中：L*、a*、b*值分別為PNL干燥處理后的亮度、紅綠度、黃藍(lán)度；值分別為新鮮PNL的亮度、紅綠度、黃藍(lán)度。

1.3.4 PNL提取物的制備

采用超聲波輔助復(fù)合酶解法提取PNL中的活性成分[14]。將不同處理組的PNL粉末按料液比1∶8（m/V）加入蒸餾水，使用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.5后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%的纖維素酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.028%的果膠酶，50 ℃水浴超聲（160 W、40 kHz）酶解2 h，然后按料液比1∶32（m/V）加入無(wú)水乙醇，同樣條件下超聲提取1 h，抽濾后濾渣按料液比1∶40（m/V）加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液，重復(fù)提取1 次。合并2 次濾液，于50 ℃下真空濃縮至浸膏，凍干，即得到PNL提取物，使用時(shí)用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液配制成合適的質(zhì)量濃度。

1.3.5 PNLS含量的測(cè)定

采用香草醛-高氯酸-冰乙酸法測(cè)定PNLS含量[15]。取40 μL樣品溶液置于80 ℃水浴鍋恒溫加熱，蒸干溶劑后加入20 μL 50 g/L香草醛-冰乙酸溶液和80 μL高氯酸，60 ℃水浴恒溫15 min，冰浴5 min后加入200 μL冰乙酸停止反應(yīng)，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。在同等條件下測(cè)定質(zhì)量濃度分別為10、50、100、150、200、250、300 μg/mL PNLS溶液的吸光度，以PNLS質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝2.525 2X＋0.003 4（R2＝0.996 6），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算PNLS含量。

1.3.6 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定PNL多糖（P. notoginsengleaves polysaccharide，PNLP）含量[16]。取50 μL樣品溶液，加入50 μL 50 g/L苯酚溶液，隨后緩慢加入250 μL濃硫酸，于40 ℃恒溫水浴10 min，冷卻后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。在同等條件下測(cè)定質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mLD(＋)-無(wú)水葡萄糖溶液的吸光度，以D(＋)-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝3.981 3X＋0.029 8（R2＝0.995 9），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算PNLP含量。

1.3.7 TPC的測(cè)定

采用福林-酚法測(cè)定TPC[17]。取50 μL樣品溶液，加入125 μL 0.1 mol/L福林-酚溶液，最后加入100 μL 75 g/L Na2CO3溶液，避光反應(yīng)30 min后于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以100 μL蒸餾水代替Na2CO3溶液作為樣品對(duì)照組。在同等條件下測(cè)定質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL沒(méi)食子酸溶液的吸光度，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝0.010 7X＋0.003（R2＝0.997 5），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算TPC。

1.3.8 TFC的測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定TFC[18]。取40 μL樣品溶液，加入20 μL 50 g/L NaNO2溶液，室溫反應(yīng)6 min，加入20 μL 100 g/L Al(NO3)3溶液，室溫反應(yīng)6 min，加入140 μL 40 g/L NaOH溶液，室溫反應(yīng)15 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液代替同樣體積的NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液和NaOH溶液作為樣品對(duì)照組。在同等條件下測(cè)定質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL蘆丁溶液的吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝0.001 3X－0.005 4（R2＝0.99），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算TFC。

1.3.9 HPLC分析

1.3.9.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液的制備

精準(zhǔn)稱取人參皂苷Rb1、Rb3和三七皂苷Fc、Fe標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg，使用色譜級(jí)甲醇配制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，再稀釋成質(zhì)量濃度分別為50、100、200、300、400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。分別稱取不同方式干燥PNL提取物20 mg，使用色譜級(jí)甲醇配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的樣品溶液，備用。

1.3.9.2 HPLC條件

按照1.3.9.1節(jié)方法配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液和PNL提取物溶液，過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，采用HPLC法分析不同處理組PNL中皂苷的分布情況。色譜柱為Silgreen C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）和體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液（B）；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%以下，為保證干燥充分和統(tǒng)一干燥條件，所有干燥處理均在50 ℃下進(jìn)行24 h，為排除各樣品組之間因水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同造成的差異，后續(xù)所有計(jì)算均以樣品的干質(zhì)量計(jì)。樣品分組如下：1）新鮮（fresh，F(xiàn)）組，新鮮未經(jīng)處理的PNL；2）VD組，將PNL置于真空干燥箱中，溫度50 ℃，真空度65 Pa，干燥時(shí)間24 h，粉碎并過(guò)60 目篩后備用；3）HPD組，將PNL置于智能熱泵烘干設(shè)備中，溫度50 ℃，相對(duì)濕度0～5%，風(fēng)速0.8 m/s，干燥時(shí)間24 h，粉碎并過(guò)60 目篩后備用；4）HAD組，將PNL置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，溫度50 ℃，干燥時(shí)間24 h，風(fēng)速0.8 m/s，粉碎并過(guò)60 目篩后備用。

1.3.2 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》[13]中的直接干燥法測(cè)定水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 色澤的測(cè)定

使用色差儀分別測(cè)定新鮮PNL和干燥PNL的色澤（L*值（亮度）、a*值（紅綠度）、b*值（黃藍(lán)度）），按式（1）計(jì)算色差ΔE。

式中：L*、a*、b*值分別為PNL干燥處理后的亮度、紅綠度、黃藍(lán)度；值分別為新鮮PNL的亮度、紅綠度、黃藍(lán)度。

1.3.4 PNL提取物的制備

采用超聲波輔助復(fù)合酶解法提取PNL中的活性成分[14]。將不同處理組的PNL粉末按料液比1∶8（m/V）加入蒸餾水，使用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.5后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%的纖維素酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.028%的果膠酶，50 ℃水浴超聲（160 W、40 kHz）酶解2 h，然后按料液比1∶32（m/V）加入無(wú)水乙醇，同樣條件下超聲提取1 h，抽濾后濾渣按料液比1∶40（m/V）加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液，重復(fù)提取1 次。合并2 次濾液，于50 ℃下真空濃縮至浸膏，凍干，即得到PNL提取物，使用時(shí)用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液配制成合適的質(zhì)量濃度。

1.3.5 PNLS含量的測(cè)定

采用香草醛-高氯酸-冰乙酸法測(cè)定PNLS含量[15]。取40 μL樣品溶液置于80 ℃水浴鍋恒溫加熱，蒸干溶劑后加入20 μL 50 g/L香草醛-冰乙酸溶液和80 μL高氯酸，60 ℃水浴恒溫15 min，冰浴5 min后加入200 μL冰乙酸停止反應(yīng)，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。在同等條件下測(cè)定質(zhì)量濃度分別為10、50、100、150、200、250、300 μg/mL PNLS溶液的吸光度，以PNLS質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝2.525 2X＋0.003 4（R2＝0.996 6），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算PNLS含量。

1.3.6 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定PNL多糖（P. notoginsengleaves polysaccharide，PNLP）含量[16]。取50 μL樣品溶液，加入50 μL 50 g/L苯酚溶液，隨后緩慢加入250 μL濃硫酸，于40 ℃恒溫水浴10 min，冷卻后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。在同等條件下測(cè)定質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mLD(＋)-無(wú)水葡萄糖溶液的吸光度，以D(＋)-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝3.981 3X＋0.029 8（R2＝0.995 9），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算PNLP含量。

1.3.7 TPC的測(cè)定

采用福林-酚法測(cè)定TPC[17]。取50 μL樣品溶液，加入125 μL 0.1 mol/L福林-酚溶液，最后加入100 μL 75 g/L Na2CO3溶液，避光反應(yīng)30 min后于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以100 μL蒸餾水代替Na2CO3溶液作為樣品對(duì)照組。在同等條件下測(cè)定質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL沒(méi)食子酸溶液的吸光度，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝0.010 7X＋0.003（R2＝0.997 5），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算TPC。

1.3.8 TFC的測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定TFC[18]。取40 μL樣品溶液，加入20 μL 50 g/L NaNO2溶液，室溫反應(yīng)6 min，加入20 μL 100 g/L Al(NO3)3溶液，室溫反應(yīng)6 min，加入140 μL 40 g/L NaOH溶液，室溫反應(yīng)15 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液代替同樣體積的NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液和NaOH溶液作為樣品對(duì)照組。在同等條件下測(cè)定質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL蘆丁溶液的吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝0.001 3X－0.005 4（R2＝0.99），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算TFC。

1.3.9 HPLC分析

1.3.9.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液的制備

精準(zhǔn)稱取人參皂苷Rb1、Rb3和三七皂苷Fc、Fe標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg，使用色譜級(jí)甲醇配制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，再稀釋成質(zhì)量濃度分別為50、100、200、300、400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。分別稱取不同方式干燥PNL提取物20 mg，使用色譜級(jí)甲醇配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的樣品溶液，備用。

1.3.9.2 HPLC條件

按照1.3.9.1節(jié)方法配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液和PNL提取物溶液，過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，采用HPLC法分析不同處理組PNL中皂苷的分布情況。色譜柱為Silgreen C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）和體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液（B）；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液，冰浴超聲30 min后－20 ℃靜置2 h，然后在4 ℃環(huán)境下離心（16 000×g、20 min）取上清液。將上清液在高速真空濃縮離心機(jī)中揮發(fā)蒸干，加入100 μL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液復(fù)溶，在4 ℃環(huán)境下離心（20 000×g、20 min）取上清液用于質(zhì)譜分析，同時(shí)從每個(gè)樣品中取等體積樣品混勻制備質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品，以驗(yàn)證系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

超高效液相色譜條件：ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫程序如下：0～2 min，0 B；2～6 min，0～48% B；6～10 min，48%～100% B；10～12 min，100% B；12～12.1 min，100%～0 B；12.1～15 min，0 B；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量6 μL。整個(gè)分析過(guò)程中樣品一直置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中。

質(zhì)譜條件：樣品采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）進(jìn)行正離子和負(fù)離子模式檢測(cè)。正離子模式噴霧電壓為3 800 V，負(fù)離子模式為3 200 V；離子傳輸管溫度為320 ℃；母離子掃描范圍為m/z70～1 050 。

數(shù)據(jù)處理：原始數(shù)據(jù)采用MSDIAL軟件進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和峰面積提取。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配（質(zhì)量偏差小于20×10－6Da）和二級(jí)譜圖匹配（質(zhì)量偏差小于0.02 Da）的方式，檢索HMDB、MassBank等公共數(shù)據(jù)庫(kù)及自建數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)提取得到的數(shù)據(jù)，刪除組內(nèi)缺失值超過(guò)50%的離子峰；對(duì)正、負(fù)離子數(shù)據(jù)分別進(jìn)行總峰面積歸一化，整合正、負(fù)離子峰并應(yīng)用R軟件進(jìn)行模式識(shí)別，數(shù)據(jù)經(jīng)方差縮放（unit variance scaling）預(yù)處理后進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Origin 2018和GraphPad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和繪圖，使用SPSS 25.0軟件中的單因素方差進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05表示樣品間差異顯著。使用OmicStudio云平臺(tái)（https://www.omicstudio.cn/tool）和歐易集團(tuán)云平臺(tái)（https://cloud.oebiotech.cn/task/）進(jìn)行熱圖、火山圖、相關(guān)性以及主坐標(biāo)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式對(duì)PNL色澤和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

L*值表示明亮度（0～100表示由黑色到白色），a*值表示紅綠度（正值表示紅色，負(fù)值表示綠色）、b*值表示黃藍(lán)度（正值表示黃色，負(fù)值表示藍(lán)色），ΔE表示色差值，其值越小，說(shuō)明樣品的色澤與對(duì)照組的色澤越接近。由表1可知，干燥對(duì)PNL的色澤具有顯著影響（P＜0.05），相較于F組，3 種干燥方式均顯著降低了PNL的L*值，說(shuō)明干燥后PNL亮度降低；VD組的a*值與F組接近，其余兩組顯著降低；3 種干燥方式下b*值均顯著升高。ΔE從大到小依次為HPD組＞HAD組＞VD組，說(shuō)明相較于F組，HPD組和HAD組PNL色澤變化更為明顯，而VD組色澤變化相對(duì)較小。PNL色澤的變化與干燥過(guò)程中溫度、氧氣濃度等因素密切相關(guān)，3 種干燥方式均在50 ℃下進(jìn)行，在此溫度下，樣品容易發(fā)生美拉德反應(yīng)及焦糖化反應(yīng)等，從而導(dǎo)致樣品色澤變得暗淡，L*值降低。此外，溫度、氧氣濃度等因素也會(huì)影響葉綠素的分解，從而改變樣品色澤[24]。干燥可降低葉片等原料的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而降低其酶活力，抑制微生物繁殖，因此可在一定程度上緩解葉片的腐敗變質(zhì)問(wèn)題，延長(zhǎng)其貯存期[25]。如表1所示，F(xiàn)組水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.15%，說(shuō)明PNL水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，不利于貯藏。經(jīng)干燥后，各組水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降至10%以下，其中HAD組的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。

表1 不同干燥方式對(duì)PNL色澤和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table 1 Effects of different drying methods on the color and moisture content of PNL

2.2 不同干燥方式對(duì)PNL主要化學(xué)成分的影響

如表2所示，干燥方式對(duì)PNLS、PNLP含量及TPC、TFC均有較大影響。與F組相比，干燥組的PNLS含量更高，這是因?yàn)镻NL中皂苷類成分復(fù)雜多樣，而溫度、酶活性等因素會(huì)促使皂苷發(fā)生脫羧、脫糖、脫水反應(yīng)而發(fā)生轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致PNLS含量發(fā)生變化。王紅等[26]采用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱質(zhì)譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)人參在烘干或凍干后部分皂苷含量明顯上升，但也有部分皂苷含量降低。干燥后各組PNLP含量均升高，PNLP含量依次為HPD組＞HAD組＞VD組，這與干燥過(guò)程中濕度、氧氣濃度等因素發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致其溶出程度改變有關(guān)。陳璁等[27]研究發(fā)現(xiàn)HPD雙孢蘑菇粗多糖溶出量高于HAD。相比F組，VD組的TPC顯著降低（P＜0.05），而HAD組和HPD組無(wú)顯著變化；干燥后VD組、HAD組和HPD組的TFC均顯著降低（P＜0.05），其中VD組最低，可能是因?yàn)樵诟稍镞^(guò)程中，總酚、總黃酮等功能成分會(huì)受到溫度、氧分壓、水分活度等因素的影響，發(fā)生氧化、聚合或分解等反應(yīng)[28-30]。

表2 不同干燥方式對(duì)PNL中主要化學(xué)成分的影響Table 2 Effects of different drying methods on major chemical components of PNL

2.3 不同干燥方式對(duì)PNL單體皂苷含量和功能活性的影響

皂苷是苷元為三萜或者螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、止血等多種功效[31]。前人研究表明PNL中含有人參皂苷Rb1、Rb3和三七皂苷Fc、Fe等多種皂苷[4]?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品和不同處理組樣品的HPLC圖譜見(jiàn)附圖1，通過(guò)比對(duì)峰形和保留時(shí)間，共鑒定出4 種皂苷類化合物，分別為人參皂苷Rb1、Rb3和三七皂苷Fc、Fe。如圖1A、B所示，相比于F組，三七皂苷Fc、Fe含量在VD組中分別顯著增加至46.40 mg/g和32.44 mg/g，在HAD組中無(wú)顯著變化，但在HPD組中分別顯著降低至32.41 mg/g和22.04 mg/g；此外，由圖1C、D可知，3 種干燥方式對(duì)人參皂苷Rb1、Rb3的含量無(wú)顯著影響。

圖1 不同干燥方式對(duì)PNL中皂苷含量及功能活性的影響Fig. 1 Effects of different drying methods on saponin contents and functional activities of PNL

由于抗氧化作用機(jī)理復(fù)雜，因此可選擇多種不同作用原理的抗氧化方法對(duì)PNL的抗氧化能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[32]。由圖1E、F、G可知，經(jīng)干燥處理后，PNL的抗氧化能力均有不同程度的下降，其中，HPD組和VD組的DPPH自由基清除能力與F組無(wú)顯著差異，HAD組顯著下降，HPD組表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力（IC50為1 098.96 μg/mL）。此外，VD組表現(xiàn)出最強(qiáng)的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力（IC50為1 071.65 μg/mL），與F組相當(dāng)（P＞0.05）；HPD組ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力僅次于VD組，兩者之間無(wú)顯著差異，但均弱于F組；而HAD組的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最弱。3 個(gè)干燥組的FRAP均顯著弱于F組，其中HPD組FRAP最高（29.39 mg/g）。陳璁等[27]研究表明，HPD處理的雙孢蘑菇提取液的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力以及FRAP均顯著高于HAD組，本研究結(jié)果與之類似。α-葡萄糖苷酶是2型糖尿病的重要靶標(biāo)[33]，尋找天然高效、無(wú)毒副作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要意義。由圖1H可知，HAD和VD處理均使PNL的α-葡萄糖苷酶抑制能力顯著下降，而HPD組的α-葡萄糖苷酶抑制能力（IC50為6 542.38 μg/mL）與F組無(wú)顯著差異。綜合以上結(jié)果，HPD對(duì)PNL功能活性的保持效果最好。

為進(jìn)一步闡明PNL中化學(xué)成分含量與功能活性之間的關(guān)系，本研究對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析。如圖2A所示，抗氧化指標(biāo)與TFC之間相關(guān)性較高，說(shuō)明黃酮類化合物是PNL抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者；而α-葡萄糖苷酶抑制能力受到TFC、PNLP含量的影響，但不完全由它們決定。綜合來(lái)看，PNL的功能活性是其各種成分綜合作用的結(jié)果，并非主要由單一類型成分決定，這也體現(xiàn)了PNL多成分、多作用靶點(diǎn)的特點(diǎn)。此外，為探討干燥方式與PNL中化學(xué)成分含量和功能活性的聯(lián)系，本研究進(jìn)行了主坐標(biāo)分析，如圖2B所示，HPD組、VD組與F組在PC1上距離較相近，其中HPD組與F組最為接近，而HAD組距離F組最遠(yuǎn)，這也進(jìn)一步說(shuō)明HPD和VD處理對(duì)PNL的化學(xué)成分及其功能活性可以起到較好的保護(hù)作用。

圖2 各測(cè)定指標(biāo)間的相關(guān)性熱圖和各樣品組間的主坐標(biāo)分析Fig. 2 Heatmap showing correlation between measured indexes and principal coordinate analysis plot of fresh and dried samples

2.4 不同干燥方式對(duì)PNL揮發(fā)性成分的影響

采用GC-IMS從PNL中一共檢測(cè)出85 種揮發(fā)性化合物，包括19 種醛類、22 種醇類、17 種酮類、5 種酯類、3 種呋喃類、2 種酸類以及17 種數(shù)據(jù)庫(kù)中未匹配到的物質(zhì)，其中在F、HAD、HPD、VD組中分別檢測(cè)到80、79、80、78 種揮發(fā)性成分，各組樣品的揮發(fā)性成分基本一致（附表1）。

整體來(lái)看，新鮮的PNL中揮發(fā)性成分主要以醛、醇和酮類化合物為主，其分別約占總揮發(fā)性化合物的18%、33%和30%。其中醛類化合物主要來(lái)源于氨基酸及脂肪酸的代謝[34-35]，包括青葉醛、己醛、反式-2-戊烯醛等，其中青葉醛呈現(xiàn)強(qiáng)烈的青草氣味，己醛則呈現(xiàn)葉香、水果香、木香[36]。醇類化合物主要來(lái)源于萜類化合物、苯丙氨酸和脂肪酸的代謝[34]，包括正己醇、正戊醇等，其中正己醇具有嫩枝葉氣味，而正戊醇則呈現(xiàn)出雜醇油的氣味，對(duì)風(fēng)味有不利影響[37]。酮類化合物中的短鏈酮類具有脂香和焦香香氣，長(zhǎng)鏈酮類則呈現(xiàn)出花香氣息[38]。PNL中的酮類化合物主要為乙偶姻、丙酮等，其中乙偶姻具有甜味及奶油香味。經(jīng)過(guò)干燥處理后，PNL中醛類化合物的相對(duì)含量明顯增加，而醇類和酮類化合物的相對(duì)含量明顯下降。同時(shí)，酯類化合物相對(duì)含量明顯下降，而酸類化合物相對(duì)含量明顯提高。不同處理組之間的差異圖譜（圖3A）和指紋圖譜（圖3C）清楚地展示了這些變化，圖3A中，相比于未經(jīng)處理的F組，3 個(gè)處理組部分揮發(fā)性成分相對(duì)含量升高，部分揮發(fā)性成分相對(duì)含量降低，且變化趨勢(shì)類似。對(duì)所測(cè)得的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析（圖3B）。將每組中所有揮發(fā)性成分的含量變化進(jìn)行可視化分析（圖3C），區(qū)域a中的物質(zhì)干燥后相對(duì)含量大幅降低；區(qū)域b中大部分揮發(fā)性成分相對(duì)含量降低，其中異戊醇、正丙醇、正戊醇等在干燥后相對(duì)含量明顯降低；區(qū)域c中揮發(fā)性成分在干燥后相對(duì)含量明顯升高，包括異丁酸、正庚醛、正戊醛、醋酸等。造成這些變化的主要原因是干燥過(guò)程中溫度、氧氣濃度、光照等因素導(dǎo)致PNL發(fā)生美拉德反應(yīng)、脂質(zhì)氧化反應(yīng)以及前體物質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化，使原料中的揮發(fā)性成分種類和含量發(fā)生變化[39]。馬琦等[40]發(fā)現(xiàn)杏鮑菇經(jīng)不同干燥處理后醛類化合物含量有所升高。此外，干燥過(guò)程中酶失活以及香氣前體物質(zhì)的損失也會(huì)導(dǎo)致醇類化合物含量的降低[41]。

圖3 不同干燥方式下PNL揮發(fā)性成分的定性分析及差異分析Fig. 3 Qualitative analysis and difference analysis of volatile components in PNL dried by different methods

對(duì)各組樣品揮發(fā)性成分的相對(duì)含量分布、差異物質(zhì)進(jìn)行分析，如圖4所示，不同干燥方式下PNL揮發(fā)性成分的相對(duì)含量不同。對(duì)3 種主要揮發(fā)性成分（醇類、醛類和酮類）進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)HPD組的醇類和醛類化合物相對(duì)含量最高，而酮類化合物最低，說(shuō)明經(jīng)HPD處理的PNL草木香味最濃、焦香味最淡，有利于加工成PNL食品。主坐標(biāo)分析顯示F組在PC1上與各干燥樣品組距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明干燥使PNL中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量發(fā)生明顯改變，其中HPD組與F組揮發(fā)性成分的相對(duì)含量較為接近。選擇PNL揮發(fā)性成分中相對(duì)含量具有顯著變化的物質(zhì)進(jìn)行熱圖分析，發(fā)現(xiàn)干燥后PNL中大部分揮發(fā)性成分相對(duì)含量顯著降低，主要包括醇類、酮類、酯類，而部分醛類、酸類、呋喃類成分相對(duì)含量顯著增加。

圖4 不同干燥方式下PNL揮發(fā)性成分組成及差異物質(zhì)分析Fig. 4 Analysis of volatile components and differential substances of PNL dried by different methods

2.5 代謝組學(xué)分析

基于2.2、2.3、2.4節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)HPD組對(duì)PNL的化學(xué)成分和功能活性保持最好，因此選擇HPD作為本研究中PNL的最佳干燥方式。為進(jìn)一步闡明PNL在干燥過(guò)程中的代謝物變化和代謝機(jī)制，采用基于超高效液相色譜-四極桿-軌道阱質(zhì)譜的非靶向代謝組學(xué)對(duì)干燥前后的PNL（F組和HPD組）進(jìn)行分析。一共從PNL中鑒定出659 種代謝物，其中正離子模式下檢測(cè)到409 種，負(fù)離子模式下250 種。這可能是因?yàn)樵谫|(zhì)譜檢測(cè)中，堿性化合物對(duì)正離子模式更敏感，而負(fù)離子模式更適合檢測(cè)酸性化合物[42]。為了更直觀地展示這些代謝物的組成和分類，繪制了相應(yīng)的餅狀圖。如圖5所示，餅狀圖中不同顏色代表不同分類，面積代表分類中代謝物所占比例。PNL中的代謝物在超類水平上主要包括脂質(zhì)和類脂分子、有機(jī)酸及其衍生物、有機(jī)雜環(huán)化合物；在類水平上主要包括羧酸及其衍生物、異戊烯醇脂；在亞類水平上以氨基酸、肽和肽類似物為主。

圖5 PNL代謝物分類Fig. 5 Metabolite classification of PNL

對(duì)這些代謝物進(jìn)行主坐標(biāo)分析（圖6A、B），F(xiàn)組和HPD組在正、負(fù)離子模式下均可明顯區(qū)分，說(shuō)明干燥后PNL的代謝物表達(dá)量發(fā)生了明顯變化。對(duì)PNL干燥前后的差異代謝物進(jìn)行進(jìn)一步分析，并根據(jù)P＜0.05和│log2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）│≥2構(gòu)建火山圖（圖6C、D）。結(jié)果表明，正離子模式下有113 種代謝物表達(dá)顯著上調(diào)，98 種表達(dá)顯著下調(diào)；負(fù)離子模式下有68 種代謝物表達(dá)顯著上調(diào)，31 種表達(dá)顯著下調(diào)，這些差異代謝物主要為脂質(zhì)和類脂分子、有機(jī)雜環(huán)化合物、有機(jī)酸及其衍生物等，正、負(fù)離子模式下干燥后表達(dá)上調(diào)的代謝物均明顯多于表達(dá)下調(diào)的代謝物，說(shuō)明HPD處理能夠轉(zhuǎn)化PNL中的非揮發(fā)性代謝物，這可能是因?yàn)樵诟稍镞^(guò)程中適度的熱處理會(huì)促進(jìn)PNL中這些非揮發(fā)性代謝物的水解、取代、異構(gòu)化、氧化還原以及其他熱物理和化學(xué)反應(yīng)[43]。根據(jù)正交偏最小二乘法判別分析獲得的投影中變量重要性（variable important in projection，VIP）值，選擇VIP值排在前50 位的代謝物繪制聚類熱圖（圖6E、F），發(fā)現(xiàn)干燥前后發(fā)生變化的代謝物主要集中在一些氨基酸、生物堿、碳水化合物、酶、脂類、黃酮類化合物以及萜類化合物等。在干燥過(guò)程中，PNL中的蛋白質(zhì)發(fā)生部分水解，促進(jìn)氨基酸形成。而氨基酸又與可溶性糖等產(chǎn)生反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)物；同時(shí)，PNL中的黃酮苷也可以被降解成黃酮苷元和葡萄糖配基，從而降低其苦澀味。這也進(jìn)一步解釋了干燥后PNL化學(xué)成分和風(fēng)味變化的原因。

圖6 PNL干燥前后代謝物的變化Fig. 6 Changes in metabolite composition of PNL before and after drying

此外，在主要差異代謝物中發(fā)現(xiàn)了人參皂苷CK、人參皂苷Re等皂苷類化合物。由于皂苷被認(rèn)為是三七中最主要的活性成分，因此針對(duì)代謝物中的所有皂苷類化合物進(jìn)行檢索。一共鑒定到24 種皂苷類化合物（附表2），其中正離子模式下鑒定到13 種，負(fù)離子模式下鑒定到11 種，并發(fā)現(xiàn)其中8 種皂苷類化合物經(jīng)干燥后相對(duì)含量發(fā)生了顯著變化（圖7）。由圖7可知，只有人參皂苷CK相對(duì)含量顯著降低，而人參皂苷Re、人參皂苷F1、5,6-脫氫人參皂苷Rd等7 種皂苷相對(duì)含量均顯著降低，這與HPLC的分析結(jié)果相印證。人參皂苷CK屬二醇型皂苷，雖然在天然人參、三七等藥材中的含量極低，但其具有良好的水溶性，是其他含量較高的人參皂苷（如Rb1和Rb2等）在人體腸道內(nèi)的主要降解產(chǎn)物和最終吸收形式，具有很高的抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)免疫等生物活性[44]。已有研究報(bào)道熱處理可以將普通皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷，從而使其具有更好的藥理活性[45-46]。余瀟苓等[47]報(bào)道人參皂苷在受熱后會(huì)發(fā)生不同程度的降解，其中三醇類皂苷較二醇類皂苷對(duì)熱更為敏感。由表2可知，經(jīng)干燥后PNL中PNLS含量總體顯著提高，因此，在PNL的HPD過(guò)程中同樣存在著皂苷類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

圖7 PNL干燥前后的差異性皂苷類化合物Fig. 7 Differential saponin compounds in PNL before and after drying

進(jìn)一步對(duì)PNL的功能活性與代謝物進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析（圖8），由圖8C、D可知，沒(méi)有代謝物與DPPH自由基清除能力顯著相關(guān)，只有少量代謝物與ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力、FRAP和α-葡萄糖苷酶抑制能力顯著相關(guān)，且這些相關(guān)代謝物的種類多樣，這說(shuō)明PNL的功能活性是由不同化合物綜合決定的。

圖8 PNL功能活性與代謝物之間的相關(guān)性分析以及PNL中差異代謝物的富集途徑分析Fig. 8 Correlation analysis between functional activities and metabolites of PNL and pathway enrichment of differential metabolites in PNL

對(duì)差異代謝物參與的通路進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果如圖8E所示。由于本研究主要關(guān)注的是PNL在干燥過(guò)程中代謝物的變化，因此，針對(duì)代謝（M）類型進(jìn)行分析。由圖8E可知，氨基酸的生物合成、2-氧羧酸代謝、輔助因子的生物合成等是PNL在HPD過(guò)程中最可能的代謝通路，其富集到的代謝物數(shù)目分別為11、10、12 個(gè)。其中，氨基酸的生物合成涉及到氨基酸的合成；2-氧羧酸代謝通過(guò)氨基酸和糖類的代謝來(lái)完成；輔助因子是一類對(duì)細(xì)胞代謝和生理功能有重要影響的生物分子，對(duì)氨基酸代謝、脂類代謝、植物次生代謝等有重要作用。KEGG富集結(jié)果充分解釋了PNL在干燥后的代謝物變化情況，并揭示了其代謝途徑。

3 結(jié) 論

本研究以PNL為原料，分別采用HAD、HPD、VD對(duì)其進(jìn)行干燥處理，研究不同干燥方式對(duì)PNL化學(xué)成分、功能活性和揮發(fā)性成分的影響，確定適宜的PNL干燥方法，并采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)揭示干燥前后的代謝物變化情況，闡明代謝機(jī)制。結(jié)果表明：3 種干燥方式均可明顯提高PNLS和PNLP含量，降低TPC和TFC，其中HPD組的PNLS和PNLP含量最高，而HAD組的TPC和TFC較高；采用HPLC法從PNL中共檢測(cè)出4 種皂苷，分別為三七皂苷Fc和Fe以及人參皂苷Rb1和Rb3，其中HPD顯著降低了三七皂苷Fc、Fe的含量，而VD與之相反；3 種干燥方式對(duì)人參皂苷Rb1和Rb3含量均無(wú)顯著影響。抗氧化活性測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)干燥后，PNL的功能活性均發(fā)生了不同程度的下降。其中，HPD組清除DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的IC50分別為1 098.96 μg/mL和1 091.49 μg/mL，優(yōu)于HAD組，與VD組無(wú)顯著差異。HPD組的FRAP最強(qiáng)，為29.39 mg/g。HPD組還具有最強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制能力，其IC50為6 542.38 μg/mL，與新鮮PNL無(wú)顯著差異。因此，本研究中，HPD處理對(duì)于PNL的主要化學(xué)成分含量和功能活性具有最好的保持效果。采用GC-IMS在PNL中共檢測(cè)出85 種揮發(fā)性成分，3 種干燥方式均對(duì)PNL中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量有明顯影響，且不同處理組之間有明顯區(qū)別。其中，HPD組的醇類和醛類化合物相對(duì)含量最高，而酮類化合物最低，說(shuō)明其能較好地保留PNL的草木味，產(chǎn)生的焦香味最淡，有利于PNL的進(jìn)一步加工利用。非靶向代謝組學(xué)分析揭示了PNL在干燥過(guò)程中的代謝物變化，干燥后表達(dá)上調(diào)的代謝物數(shù)量明顯多于表達(dá)下調(diào)的代謝物，主要集中于氨基酸、生物堿、碳水化合物、酶、脂類、黃酮類化合物以及萜類化合物等，說(shuō)明HPD過(guò)程中PNL中產(chǎn)生了大量上述非揮發(fā)性代謝物，導(dǎo)致其化學(xué)成分和揮發(fā)性風(fēng)味成分發(fā)生變化。針對(duì)PNL中皂苷類化合物的相對(duì)含量進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果也證明了人參皂苷Re、人參皂苷F1、5,6-脫氫人參皂苷Rd等皂苷類化合物發(fā)生了轉(zhuǎn)化。KEGG富集分析表明，氨基酸的生物合成、2-氧羧酸代謝、輔助因子的生物合成是PNL在HPD過(guò)程中主要的代謝途徑。

綜上，HPD在本研究所選3 種干燥方式中對(duì)PNL的化學(xué)成分和功能活性具有最好的保持效果，可以作為PNL在加工應(yīng)用中的優(yōu)選干燥方式。在干燥過(guò)程中，其可通過(guò)多個(gè)作用途徑改變PNL的代謝物組成，并影響其揮發(fā)性成分含量。在今后的工作中，可以針對(duì)干燥過(guò)程中代謝物的變化，尤其是常見(jiàn)皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷進(jìn)行深入研究，并運(yùn)用細(xì)胞、動(dòng)物模型對(duì)其生理活性進(jìn)行更多地探討。本研究結(jié)果可為PNL的采后干燥加工提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)于PNL的開(kāi)發(fā)利用、促進(jìn)三七產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有一定意義。