古佩嫻，劉聲鵬，黃 超，陳 云，胡 勇，吳小勇，胡 坤,*，伍芳芳,*

（1.廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510220；2.廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，廣東 中山 528458）

獼猴桃（Actinidiaspp.）又名奇異果，屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）。獼猴桃原產(chǎn)于中國(guó)，享有“水果之王”的美譽(yù)，是富含多種活性化合物的高營(yíng)養(yǎng)水果，VC含量尤為顯著。因其具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和醫(yī)療保健作用，而成為產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展的一種新興水果。但獼猴桃是典型的呼吸躍變型水果，通常情況下其貯藏期和貨架期短，不耐貯運(yùn)，從而嚴(yán)重制約著獼猴桃的經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1]。研究表明獼猴桃硬度的軟化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的改變與細(xì)胞壁修飾酶、細(xì)胞壁多糖的結(jié)構(gòu)變化緊密相關(guān)[2]。有學(xué)者指出，薄壁組織細(xì)胞壁的機(jī)械性能、相鄰細(xì)胞之間黏附區(qū)域的強(qiáng)度和延伸性以及細(xì)胞膨脹程度是肉質(zhì)果實(shí)硬度的主要決定因素[3]。

果膠是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的聚合物，自然存在于初生細(xì)胞壁和中片層，有助于增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附力和細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度，其復(fù)雜性、長(zhǎng)度等與果實(shí)硬度緊密相關(guān)[4-5]。后熟水果在軟化過程中會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞壁的修飾，其中涉及果膠和部分半纖維素的廣泛解聚、果膠的溶解和果膠側(cè)鏈中性糖的損失[6]。常見的細(xì)胞壁修飾酶包括果膠酶如多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）、果膠裂解酶（pectate lyases，PL）和糖苷水解酶如β-半乳糖苷酶（β-D-galaetosidase，β-Gal）等[7-10]。為了探索果實(shí)質(zhì)地變化的內(nèi)在原因，研究者們對(duì)不同種類水果細(xì)胞壁修飾酶的作用模式進(jìn)行了廣泛的研究，如冬棗[7]、杏[11]、番荔枝[12]、藍(lán)莓[13]等。然而目前對(duì)獼猴桃果實(shí)在貯藏過程中果膠理化特性與細(xì)胞壁修飾酶的綜合研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以‘亞特’獼猴桃果實(shí)為研究對(duì)象，探究其軟化過程的果膠結(jié)構(gòu)變化與細(xì)胞壁修飾關(guān)鍵酶包括PG、PME、PL和β-Gal等的活力變化，分析獼猴桃后熟軟化過程中的細(xì)胞壁變化機(jī)制。同時(shí)，對(duì)細(xì)胞壁果膠多糖組分進(jìn)行分離，得到水溶性多糖（water soluble polysaccharide，WSP）、反式-1,2-環(huán)己烷二胺四乙酸（trans-1,2-cyclohexanediaminetetraacetic acid，CDTA）溶性多糖（CDTA-soluble polysaccharide，CSP）和Na2CO3溶性多糖（Na2CO3-soluble polysaccharide，NSP），并對(duì)其理化特性進(jìn)行進(jìn)一步研究，為果實(shí)軟化的機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮‘亞特’獼猴桃（Actinidia deliciosa‘Yate’）采集自中國(guó)陜西省周至縣，選擇成熟度一致（可溶性固形物含量為（10.0±0.2）oBrix）、大小均一的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)樣品。

PL活性檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒 上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜、氯仿、甲醇、濃硫酸（均為分析純）廣東廣試試劑科技有限公司；果膠（半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于74.0%）、溴化鉀（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XT plus物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；UV-1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Synergy H1多功能微孔版檢測(cè)儀 美國(guó)Biotek儀器公司；Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Nano-ZS激光粒度分析儀 英國(guó)Malvern儀器有限公司；1525高效凝膠滲透色譜儀（配備2414示差檢測(cè)器） 美國(guó)Waters科技公司；SDT 650熱分析儀 美國(guó)TA儀器公司；EVO-18掃描電子顯微鏡德國(guó)ZEISS公司。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃樣品的處理

將獼猴桃樣品隨機(jī)分成4 組，每組樣品個(gè)數(shù)相同，分別貯存在（5±1）℃、80%相對(duì)濕度的冰箱中，以便果實(shí)進(jìn)一步成熟軟化。在每個(gè)取樣日期（第0、5、10、15天）進(jìn)行果實(shí)硬度測(cè)定，并收集獼猴桃無籽果肉用于細(xì)胞壁修飾酶活力、果膠成分的提取和相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，將第0天的獼猴桃樣品設(shè)為對(duì)照。

1.3.2 果實(shí)硬度測(cè)定

使用物性分析儀測(cè)定果實(shí)的硬度。為了保證硬度測(cè)定的準(zhǔn)確性，在相同的環(huán)境條件下（溫度、濕度、空氣流速）將獼猴桃果實(shí)切半，在果實(shí)赤道部位90°垂直于地面方向測(cè)量2 次，取平均值。測(cè)試模式選擇質(zhì)構(gòu)剖面分析（texture profile analysis，TPA），參數(shù)設(shè)置：探頭P5；觸發(fā)力5.0 g；測(cè)試前速率1.0 mm/s；測(cè)試速率5.00 mm/s；測(cè)試后速率5.00 mm/s；時(shí)間5 s。硬度單位為N。

1.3.3 細(xì)胞壁修飾酶活力測(cè)定

所有細(xì)胞壁修飾酶的提取與活力測(cè)定均在冰浴條件下進(jìn)行。PL活力采用試劑盒測(cè)定。PG的活力參考Zhou Qian等[14]的方法測(cè)定，以1 mL酶液每小時(shí)催化果膠生成1 mg半乳糖醛酸表示一個(gè)單位酶活力（U），單位為U/mg。PME活力采用Saleem等[15]的方法測(cè)定，以每分鐘引起反應(yīng)體系在620 nm波長(zhǎng)處吸光度變化1表示一個(gè)單位酶活力（U），單位為U/mg。β-Gal活力參考Yi Junjie等[9]的方法測(cè)定，以1 mL酶液每小時(shí)產(chǎn)生1 μmol/L對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）表示一個(gè)酶活力單位（U）。以上酶活力單位均為U/mg。每次測(cè)定分別隨機(jī)取4～8 個(gè)果實(shí)的無籽果肉混勻并設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.4 獼猴桃果膠多糖的提取分離與理化特性研究

1.3.4.1 細(xì)胞壁成分的提取與分離

根據(jù)Cybulska[5]和Chen Yihui[16]等的方法，使用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液、氯仿/甲醇（1∶1，V/V）混合物及體積分?jǐn)?shù)80%丙酮溶液對(duì)果肉進(jìn)行除雜，體積分?jǐn)?shù)90%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）4 ℃浸提過夜，所得到的殘?jiān)稍锖蠓謩e用去離子水、20 mmol/L CDTA溶液（pH 6.5，含100 mmol/L NaAc）、50 mmol/L Na2CO3溶液浸泡振蕩，并用4 倍體積的無水乙醇進(jìn)行靜置沉淀，分別得到WSP、CSP和NSP。冷凍干燥后置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 果膠含量、蛋白質(zhì)含量、酯化度和甲氧基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

參考Gerschenson等[17]的方法，采用硫酸-咔唑法測(cè)定樣品中的果膠含量。以去離子水為空白對(duì)照，以半乳糖醛酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，WSP、CSP和NSP中果膠的含量以每克凍干樣品中含有的半乳糖醛酸質(zhì)量表示，單位為mg/g。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，以牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并按Bradford[18]所述方法計(jì)算蛋白質(zhì)含量。酯化度與甲氧基質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用化學(xué)滴定法測(cè)定[19]。

1.3.4.3 傅里葉變換紅外光譜、粒徑分布與Zeta電位測(cè)定

取少量?jī)龈傻亩嗵菢悠放c適量干燥的KBr混合充分研磨后壓成薄片，使用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行紅外掃描，光譜掃描范圍為400～4 000 cm－1。使用Nano-ZS激光粒度分析儀在25 ℃下測(cè)定多糖溶液（2 mg/mL）的Zeta電位和粒徑分布。

1.3.4.4 分子質(zhì)量測(cè)定

參考Ren Yuanyuan等[12]的方法采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定樣品的分子質(zhì)量。將不同分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（5.2～668.0 kDa）和凍干的多糖樣品用0.02 mol/L KH2PO4溶液溶解，分別配制成2 mg/mL的溶液，過0.22 μm的濾膜后即可上機(jī)檢測(cè)。上樣量為20 μL，柱溫固定在35 ℃，流動(dòng)相為0.02 mol/L KH2PO4緩沖液，流速為0.6 μL/min。色譜柱為TSK G-5000 PWXL柱（300 mm×7.8 mm）和TSK-GEL-G-3000柱（300 mm×7.8 mm）串聯(lián)。

1.3.4.5 熱穩(wěn)定性分析

使用熱分析儀對(duì)多糖樣品進(jìn)行熱重（thermogravimetric，TG）分析。每個(gè)多糖樣品（3～7 mg）在流動(dòng)的氮?dú)猸h(huán)境中以25 ℃/min的速率從室溫加熱到500 ℃。將所得數(shù)據(jù)繪制成TG和微分熱重（derivative thermogravimetric，DTG）分析曲線。

1.3.4.6 掃描電子顯微鏡觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察獼猴桃多糖WSP、CSP和NSP的形貌特征。取適量冷凍干燥后的樣品用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上，在其表面噴涂3～6 nm厚金層，在加速電壓10 kV、放大500 倍的條件下觀察樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析，并使用Origin 2021軟件繪圖。設(shè)置差異顯著性的檢驗(yàn)水平為α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果實(shí)貯藏過程中的硬度變化

如圖1所示，在實(shí)驗(yàn)條件下，獼猴桃果實(shí)的硬度表現(xiàn)為先快速下降后緩慢下降的經(jīng)典兩段式軟化歷程，與大多數(shù)獼猴桃果實(shí)軟化模型[20]相同。在貯藏的前5 d內(nèi)硬度下降幅度最大（85.19%），從24.98 N迅速降至3.70 N。此后果實(shí)由快速軟化階段進(jìn)入緩慢軟化階段。15 d時(shí)果實(shí)的硬度小于1 N，獼猴桃達(dá)到完全軟化。

圖1 貯藏期間獼猴桃果實(shí)的硬度變化Fig. 1 Changes in the hardness of kiwifruits during storage

2.2 獼猴桃果實(shí)貯藏過程中的細(xì)胞壁修飾酶活力變化

如圖2A～C所示，PG、PME、PL活力均表現(xiàn)出先上升后降低的變化趨勢(shì)，15 d時(shí)PG和PME活力均顯著低于0 d時(shí)的酶活力，這與賈德翠等[21]的研究結(jié)果一致。PG活力在貯藏10 d內(nèi)持續(xù)上升，第10天達(dá)到最大值（670.76 U/mg），貯藏15 d時(shí)急劇下降，僅為127.09 U/mg。貯藏5 d時(shí)PME活力達(dá)到最大值（9.17 U/mg），此后下降至低于1 U/mg。PME活力變化特征與Yi Junjie[9]和Fan Xinguang[11]等的研究結(jié)果一致。貯藏的前5 d內(nèi)，PG和PME活力增長(zhǎng)幅度最大，與此時(shí)獼猴桃果實(shí)硬度的快速下降相對(duì)應(yīng)。有研究表明，在PG和PME兩種酶的共同作用下，β-Gal從鼠李半乳糖醛酸聚糖I（rhamnogalacturonan I，RG-I）的側(cè)鏈和果膠脫氧基團(tuán)中流失，與早期果實(shí)的快速成熟密切相關(guān)[22]，Cárdenas-Péreza等[23]的研究表明，在5 ℃、相對(duì)濕度26%條件下，芒果成熟的初始階段，PME的活性增強(qiáng)并產(chǎn)生大量果膠酸，從而為PG發(fā)揮作用提供底物，造成果實(shí)硬度的損失。PL活力高峰出現(xiàn)在貯藏的第5天，達(dá)3.41 U/mg。

圖2 貯藏期間獼猴桃果實(shí)的PG（A）、PME（B）、PL（C）和β-Gal（D）活力Fig. 2 PG (A), PME (B), PL (C) and β-Gal (D) activities in kiwifruits during storage

β-Gal通過作用于細(xì)胞壁多糖側(cè)鏈中的非還原末端β-D-半乳糖殘基，促進(jìn)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的解體[24]。如圖2D所示，在整個(gè)后熟過程中，獼猴桃果實(shí)β-Gal的活力持續(xù)上升，至第15天時(shí)達(dá)到峰值（12.58 U/mg）。

2.3 貯藏期間獼猴桃果實(shí)細(xì)胞壁多糖理化特性分析

2.3.1 果膠含量、蛋白質(zhì)含量、酯化度和甲氧化程度分析

由表1可知，在整個(gè)貯藏期間獼猴桃無籽果肉中WSP的果膠含量呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢(shì)，與Wang Hui等[25]的研究結(jié)果一致。貯藏至15 d時(shí)WSP果膠含量達(dá)到9.42 mg/g，相比于貯藏0 d增長(zhǎng)了334.10%（P＜0.05）。在貯藏的10～15 d，WSP果膠含量的增長(zhǎng)幅度最大。結(jié)合圖2結(jié)果，10 d時(shí)是PG活力最高的時(shí)間，提示PG活力對(duì)細(xì)胞壁成分間的轉(zhuǎn)化起關(guān)鍵作用。與以往研究中CSP果膠含量持續(xù)降低[12,25]表現(xiàn)不同的是，本研究中貯藏10 d時(shí)的CSP果膠含量驟然增加，這可能與此時(shí)PME活力被抑制，CSP與Ca2＋交聯(lián)形成“蛋盒”結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系[26]。在果實(shí)成熟后期，CSP和NSP果膠含量的下降削弱了細(xì)胞壁的強(qiáng)度，從而加劇了細(xì)胞壁的變薄和致密結(jié)構(gòu)的松動(dòng)[27]。

表1 貯藏期間WSP、CSP和NSP的果膠含量、蛋白質(zhì)含量、酯化度和甲氧基質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Pectin contents, protein contents, esterification degrees and methoxy contents of WSP, CSP and NSP during storage

由表1可知，NSP的蛋白質(zhì)含量在4 個(gè)貯藏時(shí)間點(diǎn)均高于WSP和CSP，NSP中蛋白質(zhì)含量在貯藏10 d時(shí)最高，達(dá)到2.01 mg/g。酯化度和甲氧基質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果表明獼猴桃中提取得到的WSP、CSP和NSP均為高酯果膠（high-methoxy pectin，HMP），酯化度均大于50%，且甲氧基質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于7%。甲氧基質(zhì)量分?jǐn)?shù)也是反應(yīng)果膠酯化度的指標(biāo)[28]。CSP和NSP的酯化程度于貯藏10 d時(shí)降低，這可能與PME能夠催化果膠半乳糖醛酸殘基，使果膠部分脫去甲氧基，催化果膠酯酸轉(zhuǎn)化為果膠酸，生成適合PG作用的底物有關(guān)[29]。

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析

圖3中，在3 420～3 439 cm－1處呈現(xiàn)的下降寬頻帶吸收峰提示存在廣泛的分子內(nèi)O—H鍵伸縮振動(dòng)；在2 923～2 833 cm－1處觀察到的較小吸收峰可能是糖鏈中甲基和甲酯中甲基的C—H鍵伸縮與彎曲振動(dòng)引起的；1 728～1 752 cm－1處的伸縮振動(dòng)由乙酰基或醛基的C＝O共振所引起；1 595～1 630 cm－1處和1 408～1 425 cm－1處的吸收峰分別歸屬于羧基（—COOH）的非對(duì)稱共振和對(duì)稱共振峰，其中1 728～1 752、1 595～1 630 cm－1與1 408～1 425 cm－1處的特征吸收峰共同構(gòu)成了果膠中糖醛酸的特征結(jié)構(gòu)[30]。在1 250～1 267 cm－1和1 105～1 109 cm－1區(qū)域的吸收峰分別是由C—O、C—H或C—C伸縮共振引起，WSP和CSP在1 100 cm－1附近的吸收峰通常與葡萄糖殘基中C—O—C和C＝O的伸縮振動(dòng)有關(guān)；在910 cm－1附近的特征吸收峰歸屬為β-D-吡喃葡萄糖峰。NSP于848～907 cm－1區(qū)間存在α-D-吡喃葡萄糖環(huán)的特征吸收峰。綜合來看，0～15 d的貯藏過程中，CSP和NSP的O—H鍵伸縮振動(dòng)峰發(fā)生藍(lán)移，分別從3 397.5 cm－1和3 395.6 cm－1移位至3 432.7 cm－1和3 465.0 cm－1，這可能與樣品中Ca2＋與果膠基質(zhì)之間的氫鍵變化有關(guān)[31]。與貯藏前期（0 d）相比，貯藏后期（15 d）WSP中離子羧基（—COO—）的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰發(fā)生了藍(lán)移（從1 596.3 cm－1移位至1 630.5 cm－1）。CSP的C＝O鍵振動(dòng)峰與烷基中C—H變形振動(dòng)吸收峰在貯藏過程中（0～15 d）發(fā)生紅移，分別從1 647.9 cm－1和1 456.5 cm－1移位至1 598.7 cm－1和1 412.1 cm－1。貯藏0 d時(shí)，CSP中存在865.9 cm－1處的伸縮共振吸收峰，提示此時(shí)的CSP含有α-糖苷鍵，貯藏5 d后CSP中α-糖苷鍵的振動(dòng)峰消失，這種變化可能與葡萄糖異構(gòu)化有關(guān)[32]。

2.3.3 Zeta電位與粒徑分析

多糖的Zeta電位反映了多糖溶液的穩(wěn)定性，一般而言， Zeta電位的絕對(duì)值越高多糖越穩(wěn)定[33]。如圖4A1～C1所示，WSP的Zeta電位絕對(duì)值小于15 mV，貯藏期間Zeta電位變化不顯著。與其他兩種多糖相比，CSP具有最大的負(fù)電荷量，貯藏至5 d時(shí)Zeta電位絕對(duì)值升高至大于30 mV，比貯藏0 d時(shí)的Zeta電位絕對(duì)值升高了63.31%，此后Zeta電位不再發(fā)生顯著變化，表明貯藏5 d后CSP具有更高的分子間斥力，相對(duì)穩(wěn)定。NSP的Zeta電位絕對(duì)值先增大后減小，貯藏15 d時(shí)NSP的Zeta電位絕對(duì)值為14.32 mV，與貯藏中期相比穩(wěn)定性下降。

圖4A2～C2所示，貯藏0 d時(shí)WSP的平均粒徑為923 nm，貯藏5 d后平均粒徑增大，在貯藏10 d 后平均粒徑穩(wěn)定在1 300 nm左右。CSP粒徑分布圖存在兩個(gè)信號(hào)峰，貯藏0 d兩個(gè)峰存在部分重疊，主峰位于1 473 nm處，次峰位于255 nm處。貯藏5 d后兩個(gè)信號(hào)峰逐漸分離，至貯藏15 d時(shí)出現(xiàn)粒徑約為59 nm的成分。NSP的粒徑分布變化與CSP相似，貯藏0 d時(shí)NSP的兩個(gè)主峰位于59～825 nm內(nèi)，存在部分重疊；另外，在5 560 nm附近出現(xiàn)了一組弱信號(hào)峰，可能是樣品中存在的較大原纖維或團(tuán)塊所引起。貯藏5 d后NSP信號(hào)峰逐漸分裂，15 d時(shí)出現(xiàn)38 nm左右的小粒徑成分。

2.3.4 分子質(zhì)量分析

多糖的理化、功能和生物學(xué)特性與其分子質(zhì)量密切相關(guān)[33]。如表2所示，WSP的重均分子質(zhì)量（mw）均在貯藏過程中呈逐漸增大趨勢(shì)，0 d時(shí)主要分布于0.93 kDa，其次位于7.81×102kDa；貯藏5 d時(shí)mw分布在1.09～73.2 kDa范圍內(nèi)，多分散性系數(shù)（polydispersity index，PDI）接近1，提示此時(shí)WSP分子質(zhì)量分布均勻，樣品均一性較好[28]。貯藏10 d后WSP的mw分布范圍逐漸增加，至15 d時(shí)主要出現(xiàn)5.26×102kDa的成分，PDI比貯藏0 d時(shí)增大。CSP在貯藏0 d時(shí)分子質(zhì)量分布不均勻，其mw在0.73～1.09×103kDa范圍內(nèi)均有分布；貯藏5 d后分布范圍稍有變窄，15 d時(shí)主要分布在5.47×102kDa處。綜合來看，CSP在貯藏0 d時(shí)mw較大，貯藏5 d開始CSP的mw先減小后增加。NSP的mw在貯藏開始時(shí)主要分布于0.89 kDa處，貯藏15 d時(shí)NSP的分子質(zhì)量分布于0.17～84.60 kDa范圍內(nèi)，此時(shí)樣品的PDI接近1，分子質(zhì)量分布均勻。從NSP的分子質(zhì)量分布來看，貯藏5 d后NSP主要成分的mw有逐漸減小的趨勢(shì)，貯藏至15 d時(shí)長(zhǎng)鏈成分消失，分子質(zhì)量分布較均勻。結(jié)合β-Gal活力分析結(jié)果，NSP分子長(zhǎng)度的縮短可能與側(cè)鏈中糖苷鍵的斷裂有關(guān)[5]。

表2 貯藏期間WSP、CSP和NSP的分子質(zhì)量Table 2 Molecular masses of WSP, CSP and NSP during storage

2.3.5 熱穩(wěn)定性分析

熱穩(wěn)定性是多糖的重要化學(xué)性質(zhì)之一[34]。如表3所示，在室溫至500 ℃的升溫過程中，WSP和NSP主要經(jīng)歷了2 個(gè)分解階段，而CSP經(jīng)歷了3 個(gè)分解階段。WSP降解的階段I發(fā)生在25.00～162.34 ℃范圍內(nèi)，質(zhì)量損失成分包括填充在果膠鏈之間的結(jié)合水和揮發(fā)性化合物等。階段I引起的質(zhì)量損失隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，提示貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，鍵合在WSP糖鏈上的水越多。階段II發(fā)生在151.58～499.24 ℃范圍內(nèi)，此時(shí)果膠的半乳糖醛酸鏈發(fā)生熱降解釋放出二氧化碳、一氧化碳、水和脂肪族化合物[35]。貯藏10 d時(shí)WSP階段II的結(jié)束溫度最高，為499.24 ℃，可能與此時(shí)WSP的分子質(zhì)量最大有關(guān)。在階段II，WSP的質(zhì)量損失率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，降解結(jié)束后的殘余量呈增加趨勢(shì)，提示貯藏時(shí)間越久，獼猴桃WSP糖鏈的熱穩(wěn)定性越好。CSP的熱降解階段I發(fā)生在29.31～179.99 ℃，此階段質(zhì)量損失率隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，貯藏15 d時(shí)質(zhì)量損失率最大，是貯藏0 d時(shí)的近2 倍；階段II發(fā)生在168.43～363.19 ℃，質(zhì)量損失率隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低再升高，貯藏15 d時(shí)的質(zhì)量損失率最大，為30.29%。CSP獨(dú)有的階段III降解發(fā)生在344.63～498.30 ℃，此階段CSP的損失主要為糖鏈上的芳香碳?xì)埩粑颷36]，質(zhì)量損失率隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈減少趨勢(shì)。NSP的熱降解階段I發(fā)生在30.11～178.70 ℃；階段II發(fā)生在157.02～498.37 ℃，貯藏5 d時(shí)的NSP在整個(gè)貯藏過程中質(zhì)量損失率最少，降解結(jié)束溫度最高，殘余量最多，提示此時(shí)的NSP熱穩(wěn)定性最好。本研究中‘亞特’獼猴桃中WSP、CSP和NSP的熱分解過程與其他品種獼猴桃[37]相一致，其中，WSP在貯藏15 d時(shí)熱穩(wěn)定性最好，CSP和NSP在貯藏5 d時(shí)熱穩(wěn)定性相對(duì)于其他時(shí)期較好。

表3 貯藏期間WSP、CSP和NSP的熱重分析結(jié)果Table 3 Thermal gravimetric analysis of WSP, CSP and NSP during storage

2.3.6 果膠的微觀形態(tài)觀察

如圖5所示，在放大500 倍的視野下，WSP表現(xiàn)為不規(guī)則的片狀結(jié)構(gòu)，表面相對(duì)光滑平整、層次清晰，表明多糖鏈發(fā)生聚集。貯藏0 d時(shí)WSP的微觀結(jié)構(gòu)較纖薄，貯藏5 d時(shí)片層增厚，面積較大，貯藏15 d時(shí)樣品呈較小薄片狀層疊排列，面積變小。貯藏0 d的CSP有大的空腔、扁平的膜狀結(jié)構(gòu)，為團(tuán)簇狀結(jié)構(gòu)的混合，有較多交聯(lián)纏繞形成，貯藏5 d時(shí)CSP變得松散，呈褶皺薄紗狀，孔洞變小，邊緣出現(xiàn)分支；此后CSP表現(xiàn)為更加光滑柔軟，孔洞消失。貯藏期間NSP的微觀形態(tài)呈表面毛糙的團(tuán)簇狀結(jié)構(gòu)，貯藏5 d時(shí)NSP的不規(guī)則粗糙團(tuán)塊結(jié)構(gòu)排列更加緊湊，貯藏10 d時(shí)有邊緣粗糙的片狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，排列較松散，15 d時(shí)塊狀結(jié)構(gòu)崩塌，呈現(xiàn)出分散的顆粒團(tuán)簇形態(tài)，碎屑增多，證實(shí)了部分NSP糖鏈在貯藏15 d時(shí)發(fā)生斷裂和解離。

圖5 貯藏期間 WSP、CSP和NSP的掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 SEM images of WSP, CSP and NSP during storage

2.4 相關(guān)性分析

如表4所示，獼猴桃果實(shí)硬度與貯藏時(shí)間之間呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.829）。PL活力與PG活力（r＝0.811）、PME活力（r＝0.903）均呈極顯著正相關(guān)，提示這3 種果膠降解酶之間關(guān)系密切，共同導(dǎo)致了果實(shí)質(zhì)地的軟化。β-Gal活力與果實(shí)硬度之間呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.888），這與李圓圓等[38]的研究結(jié)果一致；同時(shí)，β-Gal活力與WSP果膠含量之間呈極顯著正相關(guān)（r＝0.967），提示果膠側(cè)鏈中的半乳糖損失導(dǎo)致了WSP的積累[24]。貯藏時(shí)間與WSP的重均分子質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)（r＝0.921）。CSP的重均分子質(zhì)量與貯藏時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.626），與PG、PL和PME活力均呈顯著或極顯著相關(guān)（r分別為0.735、－0.818、－0.581），提示貯藏期間果膠酶對(duì)CSP的鏈長(zhǎng)影響較大。

表4 獼猴桃貯藏期間各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis among physicochemical indicators of kiwifruits during storage

3 結(jié) 論

在（5±1）℃、80%相對(duì)濕度的條件下獼猴桃果實(shí)硬度表現(xiàn)為兩段式下降模式，果實(shí)發(fā)生軟化。結(jié)合細(xì)胞壁修飾關(guān)鍵酶活力測(cè)定與多糖理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-Gal活力與WSP果膠含量之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；PG、PL和PME活力與CSP分子質(zhì)量均呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；另外，在貯藏5 d時(shí)，PME和PL活力均達(dá)到最大值，此時(shí)NSP的果膠含量最小，CSP的α-糖苷鍵振動(dòng)峰消失且重均分子質(zhì)量減小，掃描電子顯微鏡下觀察其結(jié)構(gòu)變得松散并出現(xiàn)邊緣分支，宏觀上表現(xiàn)為果肉硬度的下降幅度達(dá)到最大，獼猴桃經(jīng)歷快速軟化。上述相關(guān)變化均提示，獼猴桃果肉中細(xì)胞壁修飾關(guān)鍵酶對(duì)于果肉中的細(xì)胞壁多糖組分及結(jié)構(gòu)改變具有重要作用，最終導(dǎo)致了獼猴桃果實(shí)在貯藏過程中的質(zhì)地軟化。