微生物預處理餐廚垃圾對黑水虻生長發(fā)育的影響

張 敏,孔祥平,葉 牧,韓曉坦,杜 靜,王 聰,奚永蘭,葉小梅,3

(1.南京農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境科學學院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧研究所,江蘇 南京 210014;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結合重點實驗室,江蘇 南京 210014)

據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織(FAO)公布的數(shù)據(jù),全球每年產(chǎn)生近13億t餐廚垃圾,占全球糧食的三分之一[1]。我國每年餐廚垃圾產(chǎn)生量超過1億t[2],占城市固體有機廢物總量的20%～45%[3]。由于餐廚垃圾富含蛋白質(zhì)、淀粉和油脂等成分[4],若處理不及時,易在環(huán)境中腐敗變質(zhì),危害環(huán)境衛(wèi)生,滋生病原微生物,對人體健康造成嚴重威脅[5],同時,高昂的處理費用也給城市財政帶來了沉重的負擔,因此餐廚垃圾的妥善處理也是社會面臨的一個重要問題。

堆肥是一種可靠的餐廚垃圾處理技術,堆肥過程不僅可減少30%～70%餐廚垃圾的體積[6],滅活大多數(shù)病原微生物,還可將其轉化為富含穩(wěn)定營養(yǎng)物質(zhì)的生物有機肥[7],但是堆肥過程會產(chǎn)生溫室氣體(CH4、CO2和N2O)和排放過量的NH3亦會降低堆肥產(chǎn)品的實際價值,并給環(huán)境造成二次污染[8]。厭氧發(fā)酵是厭氧微生物在缺氧條件下降解畜禽糞便中有機物產(chǎn)生CH4和CO2的生物處理技術,厭氧發(fā)酵產(chǎn)生清潔能源CH4和沼液[9],但此過程也易造成二次污染,且一次性投入成本高,設備管理操作復雜,難以廣泛應用[10]。黑水虻屬于雙翅目水虻科腐生性昆蟲,具有攝食能力強和生長周期短等特點[11],可將餐廚垃圾轉化成高價值的昆蟲蛋白和油脂[12],以此來處理餐廚垃圾是一種更加經(jīng)濟可行、環(huán)境友好型的處理方式。黑水虻能高效減少餐廚垃圾的體積,Lalander等[13]和Zheng等[14]利用黑水虻處理餐廚垃圾后發(fā)現(xiàn),餐廚垃圾的減少率分別達到55.30%和61.80%?？梢?利用黑水虻轉化餐廚垃圾不僅能降低餐廚垃圾危害環(huán)境的風險,還能實現(xiàn)餐廚垃圾的資源化和高值化。

近年來,黑水虻生物轉化技術已成為餐廚垃圾資源化處理的重要途徑。在黑水虻生物轉化系統(tǒng)中,微生物和黑水虻依靠互利共生機制高效地完成底物的轉化[15]。將微生物接種到物料中進行發(fā)酵后會顯著影響黑水虻的生長,因為發(fā)酵過程涉及微生物催化大部分有機物的分解,并在厭氧條件下將其轉化為有價值的次級代謝產(chǎn)物,不過發(fā)酵產(chǎn)物很大程度上受微生物菌株種類和發(fā)酵環(huán)境的控制[16]。昆蟲的多樣性很大程度上取決于它們與有益微生物的共生關系,微生物可能是參與宿主生活的關鍵媒介[17]。微生物隨物料進入黑水虻幼蟲體內(nèi),并在腸道內(nèi)形成獨特的蟲菌生態(tài)系統(tǒng)[18]。如,喻國輝等[19]在雞糞中接種納豆芽孢桿菌,使黑水虻幼蟲質(zhì)量提高了9.22%、化蛹率提高了4.68%、轉化周期縮短了2.33 d。Somroo等[20]在豆腐渣中接種乳酸桿菌,增加了黑水虻蟲產(chǎn)率和蟲體油脂含量。Wong等[16]在椰子胚乳殘渣中接種釀酒酵母菌,可增加黑水虻的產(chǎn)率。因此,向餐廚垃圾中接種外源微生物來提高黑水虻處理垃圾的性能值得深入研究。

在實際生產(chǎn)中,黑水虻轉化餐廚垃圾的周期一般為10 d左右。為提高黑水虻處理垃圾的效率,本研究先采用芽孢桿菌、戊糖片球菌、畢赤酵母、釀酒酵母、拜爾接合酵母和復合菌劑發(fā)酵預處理餐廚垃圾,再考察不同微生物預處理方式對黑水虻生長發(fā)育和物料轉化效率的影響,優(yōu)選出促進效果最佳的微生物菌劑,以期為黑水虻生物轉化餐廚垃圾的工廠化和高效化運行提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枯草芽孢桿菌BacillusstercorisXP、戊糖片球菌PediococcuspentosaccharidesM7、畢赤酵母菌PichiaoccidentalisH1、釀酒酵母菌SaccharomycescerevisiaeZ4、拜耳接合酵母菌ZygosaccharomycesJ7Y1、黑水虻蟲卵(屬武漢品系),江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所保藏。麥麩和玉米粉,南京響海生物科技有限公司;4日齡黑水虻幼蟲,自培養(yǎng)。

餐廚垃圾,江蘇省農(nóng)業(yè)科學院教職工食堂(從獲得的新鮮餐廚垃圾中分揀出雜物,直接用磨漿機粉碎成顆粒形態(tài)均勻的漿料,粒徑小于2 mm。餐廚垃圾的具體參數(shù)為pH 5.1、干物質(zhì)(DM)質(zhì)量分數(shù)20.65%、總氮(TN)質(zhì)量分數(shù)3.68%、總有機碳(TOC)質(zhì)量分數(shù)48.50%、碳氮比(C/N)是13.76、粗蛋白質(zhì)(CP)質(zhì)量分數(shù)23.00%、粗脂肪(CEE)質(zhì)量分數(shù)25.86%、溶解性化學需氧量(SCOD)112.68 g/L。

細菌基礎培養(yǎng)基(LB,1 L):蛋白胨10 g、酵母粉10 g、NaCl 5 g。用于芽孢桿菌的活化培養(yǎng)。

乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS,1 L):蛋白胨10 g、牛肉浸粉5 g、吐溫80 mL、K2HPO42 g、酵母浸粉4 g、MgSO40.2 g、檸檬酸三銨2 g、葡萄糖20 g、MnSO40.05 g、乙酸鈉5 g。用于活化培養(yǎng)戊糖片球菌。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD,1 L):酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g。用于畢赤酵母菌、釀酒酵母菌和拜耳接合酵母菌的活化培養(yǎng)。

當用于固體瓊脂培養(yǎng)基時,在以上液體培養(yǎng)基中均加入15 g/L的瓊脂粉滅菌待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

用無菌微量吸管從已溶解的低溫保存管中吸取少量的菌液,滴在培養(yǎng)基的邊緣,再用無菌接種環(huán)蘸取菌液以劃線法接種在對應的固體培養(yǎng)基上,并在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 菌株種子培養(yǎng)

將活化的菌種從相應的固體培養(yǎng)基中挑選單菌落接種到裝有50 mL對應液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,芽孢桿菌和戊糖片球菌在35 ℃培養(yǎng),畢赤酵母菌、釀酒酵母菌和拜爾接合酵母在30 ℃培養(yǎng),150 r/min培養(yǎng)24 h后,獲得的菌液(OD600為6.70左右)作為微生物預處理的菌種源。

1.2.3 4日齡黑水虻幼蟲的飼養(yǎng)

蟲卵在恒溫恒濕箱(30 ℃,濕度80%)中孵化3 d形成蟲苗,將麥麩和玉米粉(體積比為3∶7)混合后孵化物料,將含水率調(diào)成65%,取400 g配制的混合物料和0.2 g蟲苗放入長方體養(yǎng)殖盒(17 cm×11 cm×7 cm)中,取一層紗布覆蓋在養(yǎng)殖盒上并用破孔的盒蓋蓋緊。在恒溫恒濕箱中(30 ℃,濕度80%)飼養(yǎng)到4日齡(15 mg左右)。

1.3 實驗設計

取300 g的餐廚垃圾于500 mL的錐形瓶中,按50 g/L的接種量接入不同微生物菌種并置于30 ℃、150 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中預處理4 d(表1)。用麥麩調(diào)節(jié)預處理后的餐廚垃圾含水率為70%,再取100只4日齡的黑水虻幼蟲加入130 g用麥麩調(diào)節(jié)的飼料于240 mL一次性塑料杯中,飼養(yǎng)周期為7 d,比較不同微生物預處理的餐廚垃圾對黑水虻生長發(fā)育和黑水虻營養(yǎng)組成的影響。

表1 餐廚垃圾的不同處理方式

1.4 參數(shù)測定

1.4.1 pH測定

稱取10 g物料,置于250 mL錐形瓶中,加入100 mL水,在搖床中搖30 min后用pH計測定。

1.4.2 含水率

精確稱取適量餐廚垃圾置于105 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量,并計算含水率。

1.4.3 總糖測定

總糖采用DNS法參照文獻[21]的方法測定。

1.4.4 溶解性化學需氧量(SCOD)測定

SCOD參照HJ 828—2017的測定方法測定。

1.4.5 揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)采用氣相色譜法測定

取1 mL一定稀釋倍數(shù)的樣品,加入50 μL 34%的磷酸于2 mL離心管中酸化,直至pH<2,以確保各種有機酸以酸式形態(tài)存在,搖勻后靜置幾分鐘,待泡沫不再產(chǎn)生為止后,12 000 r/min離心10 min。離心后的樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,再將樣品轉移到氣相色譜(GC)瓶中,待測。

1.4.6 粗蛋白質(zhì)測定

粗蛋白質(zhì)的含量參照GB/T 6432—2018,采用凱氏定氮法測定。取0.100 0 g烘干后的黑水虻蟲體,加入10 mL硫酸于Foss消解管,再加入消解催化劑在420 ℃消解1.5 h,待其冷卻后,用全自動凱氏定氮儀測定。

1.4.7 粗脂肪測定

粗脂肪的測定參照GB 5009.6—2016,采用索氏提取法測定。取1.500 0 g研磨的黑水虻蟲體用濾紙包好,放入鋁杯中,再用脂肪測定儀浸提,測定浸提前后鋁杯質(zhì)量差。按式(1)計算粗脂肪含量。

粗脂肪含量=

(1)

2 結果與討論

2.1 微生物預處理方式對餐廚垃圾物料理化性質(zhì)的影響

2.1.1 餐廚垃圾pH的變化

pH是反映餐廚垃圾發(fā)酵酸化階段相對直觀的參數(shù)。因此考察不同預處理方式對餐廚垃圾物料pH的影響,結果見圖1。由圖1可知:在餐廚垃圾的預處理過程中,經(jīng)不同預處理方式處理后物料的pH下降幅度和趨勢基本一致。在前20 h內(nèi),pH急劇下降至4.2左右,其中接種微生物菌劑處理組的pH降得最快,因為在這階段,糖由糖酵解途徑氧化為丙酮酸,丙酮酸進一步轉化為乙酰輔酶A,乙酰輔酶A再被轉化為乙酸和丁酸等有機酸[22],最終導致物料的pH降低;在20 h后,物料的pH緩慢降低,最終穩(wěn)定在3.5左右,說明在餐廚垃圾發(fā)酵的前期有機酸含量不斷積累,直到發(fā)酵體系的酸性環(huán)境不利于微生物生長,最終迫使pH穩(wěn)定在3.5左右,同時也表明過度酸化會抑制發(fā)酵進程[23]。

圖1 不同預處理方式對物料pH的影響

2.1.2 餐廚垃圾總糖濃度的變化

總糖包括還原糖和多糖,糖類是微生物生長的重要能源物質(zhì),在發(fā)酵過程中易被微生物轉化為還原糖[24]。因此,考察不同預處理方式對餐廚垃圾物料的總糖濃度的影響,結果見圖2。由圖2可知:與原餐廚垃圾相比,接種微生物菌劑均使物料中總糖濃度顯著降低(p<0.05),其中復合菌劑處理組(F)的總糖降得最多,比對照組(CK1)的降低了56.93%,而芽孢桿菌預處理組(A)、畢赤酵母菌預處理組(C)和拜爾接合酵母菌處理組(E)總糖降低幅度依次降低。一般來說,總糖濃度會隨著微生物發(fā)酵時間的延長先升高再降低,這是因為微生物先將大分子多糖轉化為小分子的單糖,然后利用單糖進行生長代謝[25],如果總糖濃度的降低幅度越大,說明微生物生長繁殖能力越強[26]。由此可見,接種芽孢桿菌、畢赤酵母菌、拜爾接合酵母菌和復合菌劑處理餐廚垃圾的能力較強。

圖2 不同預處理方式對餐廚垃圾總糖的影響

2.1.3 餐廚垃圾SCOD的變化

在餐廚垃圾發(fā)酵過程中,物料中的SCOD隨著時間的延長先升高后降低[27],主要是由于微生物先將大分子有機物轉化為可溶性的小分子有機物,這時微生物消耗可溶性有機物的速率小于其產(chǎn)生速率,但是隨著微生物的增殖,會消耗大量的可溶性有機物,同時微生物對有機物的水解作用受體系pH的影響,最終使SCOD降低[28]。因此,考察不同預處理方式對餐廚垃圾物料SCOD的影響,結果見圖3。由圖3可知:除戊糖片球菌處理組(B)、滅菌處理組(CK1)和餐廚垃圾預處理組(G)外,其余處理組的餐廚垃圾的SCOD都比對照組(CK0)的有所降低,其中復合菌劑處理組的SCOD降低幅度最大,達到12.39%,說明該處理組的微生物消耗可溶性小分子有機物來繁殖。但是,戊糖片球菌處理組(B)的SCOD卻比對照組(CK0)的高,主要是因為戊糖片球菌具有抗酸性能,在pH較低的條件下,仍能夠吸收利用餐廚垃圾中的有機物生長繁殖,并繼續(xù)將餐廚垃圾中的大分子有機物分解為小分子可溶性有機物,使SCOD升高[29]。

圖3 不同預處理方式對餐廚垃圾SCOD的影響

2.1.4 餐廚垃圾VFAs的變化

VFAs主要由乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸等[30]組成,它也是物料水解酸化的中間產(chǎn)物,發(fā)酵體系中的VFAs含量一定程度上可反映微生物水解和產(chǎn)酸的能力。因此,考察不同預處理方式對餐廚垃圾的VFAs的影響,結果見圖4。由圖4可知:各處理組的VFAs為3 085.16～10 627.14 mg/L,而且整個發(fā)酵體系中的VFAs以乙酸和丁酸為主,占總揮發(fā)性脂肪酸的87%～96%,所以乙酸和丁酸也被認為是餐廚垃圾發(fā)酵過程的穩(wěn)定指標[31];戊糖片球菌處理組(B)的VFAs顯著高于其他處理組的(p<0.05),其產(chǎn)生的總酸量是滅菌對照組(CK1)的3.44倍,這也與該處理組產(chǎn)生較多的SCOD結果有關,說明餐廚垃圾的可生化性能較好[32],同時也說明戊糖片球菌降解餐廚垃圾的能力較強;芽孢桿菌(A)處理組能夠產(chǎn)生丙酸,這是因為它利用餐廚垃圾進入發(fā)酵后期,通過β-氧化作用產(chǎn)生長鏈脂肪酸戊酸[33]。

圖4 不同預處理方式對廚余垃圾VFAs的影響

VFAs的組成與產(chǎn)生量不僅與pH、溫度、碳氮比(C/N)等發(fā)酵條件有關,同時也受微生物群落的影響。pH為4～5時,為乙酸型發(fā)酵;pH為5～6時,為丙酸型發(fā)酵;溫度為35和45 ℃時,乙酸和丙酸含量較高;溫度為55 ℃時,丁酸含量高[34];C/N為12時,為乙酸發(fā)酵型發(fā)酵;C/N為56時,為丙酸型發(fā)酵[35]。同時也發(fā)現(xiàn)變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門亦是餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)酸的特征微生物[36]。

2.2 發(fā)酵預處理后的餐廚垃圾對黑水虻生長發(fā)育的影響

2.2.1 黑水虻蟲平均質(zhì)量和總蟲質(zhì)量的變化

考察不同預處理方式處理后的餐廚垃圾對黑水虻蟲平均質(zhì)量和幼蟲總質(zhì)量的影響,結果見圖5。由圖5可知:以不同處理組的餐廚垃圾培養(yǎng)的幼蟲質(zhì)量在3～4 d內(nèi)增長速度較快,直至第7天時增長速度趨于平緩,與徐齊云等[37]研究的結果一致;接種微生物預處理組的蟲平均質(zhì)量顯著大于與對照組的(CK1和CK0)(p<0.05),與對照組(CK1)相比,接種微生物預處理組的蟲平均質(zhì)量依次提高了13.85%、14.87%、15.90%、17.95%、17.95%和17.44%。可見,餐廚垃圾經(jīng)發(fā)酵預處理后對黑水虻幼蟲質(zhì)量的增加均有促進作用,因為微生物能夠分解糞便中大分子有機物和黑水虻幼蟲難以直接利用的營養(yǎng)物質(zhì),同時微生物產(chǎn)生的酶、小分子和營養(yǎng)物質(zhì)是黑水虻所必需的[38-40]。因此幼蟲能夠吸收轉化更多的營養(yǎng)物質(zhì)供其生長發(fā)育。原始處理組(CK0)的黑水虻蟲平均質(zhì)量和幼蟲總質(zhì)量顯著好于滅菌處理組(CK1)的(p<0.05),說明餐廚垃圾中存在的微生物有利于黑水虻的生長,而餐廚垃圾經(jīng)過微生物預處理,有機物降解徹底,更利于黑水虻的吸收轉化。F處理組的幼蟲在2～5 d內(nèi)生長發(fā)育最快,顯著大于其他處理組,主要是由于豐富的微生物種群可以充分分解餐廚垃圾中的有機物,但是由于受到物料營養(yǎng)物質(zhì)總量的限制,培養(yǎng)后期的黑水虻的生長趨于緩慢。所以,如果以幼蟲總質(zhì)量和蟲平均質(zhì)量為指標,拜爾接合酵母菌處理組(E)的廚余垃圾對黑水虻的生長發(fā)育最佳。

圖5 不同方式預處理的餐廚垃圾對黑水虻蟲總平均質(zhì)量和蟲質(zhì)量的影響

2.2.2 黑水虻存活率和預蛹的變化

考察不同預處理方式處理后的餐廚垃圾對黑水虻存活率和預蛹率以及預蛹時間的影響,結果見圖6。由圖6可知:除F處理組外,其余處理組的黑水虻轉化餐廚垃圾7 d后的存活率均在90%以上,各組間黑水虻存活率沒有顯著差異(p>0.05);A組的存活率最高(98%),F處理組的存活率僅為84%;黑水虻幼蟲在第5天開始陸續(xù)出現(xiàn)預蛹,在試驗結束時,接種微生物處理組的預蛹率顯著大于對照組的(CK1)(p<0.05),并依次提高了64.24%、58.79%、64.24%、53.33%、55.15%和49.09%。由此可見,預處理的餐廚垃圾使黑水虻快速進入預蛹期,提高黑水虻的預蛹率,這主要是接種微生物菌劑后能夠使有機物分解更加徹底,有利于幼蟲攝食營養(yǎng)物質(zhì),幼蟲通過調(diào)節(jié)分泌腸道酶的數(shù)量來平衡營養(yǎng)物質(zhì)的分解和吸收[41],進而加快幼蟲生長,使幼蟲提前進入下一階段。本研究中,各微生物預處理組的幼蟲生長發(fā)育較快,特別是接種畢赤酵母菌處理組(C)的最好。Spranghers等[42]研究發(fā)現(xiàn),黑水虻預蛹首次出現(xiàn)的時間是從第一次喂食開始的第19天,Meneguz等[43]研究的結果則是20 d,而本研究中是第9天。可見,微生物預處理的廚余垃圾有助于提高黑水虻的存活率和預蛹率。

2.3 發(fā)酵預處理后的餐廚垃圾對黑水虻蟲體的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量的影響

黑水虻蟲體的粗蛋白和粗脂肪含量受多種因素的影響,如飼養(yǎng)密度[44]和飼養(yǎng)物料種類[45]的不同均會影響黑水虻幼蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的利用。因此,考察不同處理方式處理后的餐廚垃圾對黑水虻蟲體的粗蛋白和粗脂肪的影響,結果見圖7。由圖7可知:以各處理組得到的餐廚垃圾培養(yǎng)的黑水虻蟲體的粗蛋白質(zhì)含量為40.41%～44.53%,其中拜爾接合酵母菌處理組(E)蟲體的粗蛋白含量最高,比處理組(CK0)的提高了10.20%。接種外源微生物預處理組的黑水虻蟲體內(nèi)粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組CK0的(p<0.05),這因為微生物將餐廚垃圾中的蛋白質(zhì)分解成大量的小分子氨基酸,對蟲體粗蛋白質(zhì)的累積有促進作用。

圖7 不同方式預處理的餐廚垃圾對黑水虻蟲體粗蛋白和粗脂肪的影響

以各處理組得到的餐廚垃圾培養(yǎng)的黑水虻體內(nèi)的粗脂肪含量為24.73%～32.16%,其中釀酒酵母菌處理組(B)蟲體的粗脂肪含量最高,比滅菌對照組(CK1)的提高了18.76%,這可能是由于釀酒酵母菌處理組(B)預處理的餐廚垃圾中相關微生物被黑水虻攝食時隨食物一起進入腸道,逐步成為幼蟲腸道優(yōu)勢菌群,調(diào)節(jié)腸道生態(tài)平衡,對脂肪酸的氧化有促進作用[46]。本研究,黑水虻蟲體粗蛋白質(zhì)含量為40.41%～44.53%、粗脂肪含量為24.73%～32.16%,與Newton等[47]和竇永芳等[48]的研究結果相近。由此可見,外源微生物預處理的餐廚垃圾能夠提高黑水虻蟲體中的粗蛋白質(zhì),其中釀酒酵母菌預處理的餐廚垃圾能夠提高黑水虻蟲體中的粗脂肪。

3 結論

經(jīng)過微生物預處理后的餐廚垃圾,物料的pH快速降低,最后穩(wěn)定至3.5左右,總糖濃度和SCOD均有所降低,特別是戊糖片球菌對餐廚垃圾的分解能力和產(chǎn)酸能力強。經(jīng)預處理的餐廚垃圾不僅能顯著提高黑水虻平均質(zhì)量、收蟲時總蟲質(zhì)量和黑水虻蟲體的粗蛋白,還能使黑水虻幼蟲提前進入預蛹期,提高預蛹率,縮短黑水虻生長周期。戊糖片球菌和拜耳接合酵母菌組成的復合菌劑處理的餐廚垃圾更有利于黑水虻的生長發(fā)育?？梢?開發(fā)更高效的外源微生物發(fā)酵處理的餐廚垃圾可提升大規(guī)模飼養(yǎng)黑水虻的過程效率。