微生物群落演替在死亡時間推斷中的研究進展

向青青，陳立方，2，蘇秦，杜宇坤，梁沛妍，康曉東，石河，徐曲毅，趙建，劉超，，陳曉暉

1.昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2.云南省公安廳刑事科學技術研究所，云南 昆明 650228；3.廣州市刑事科學技術研究所 法醫(yī)病理學公安部重點實驗室，廣東 廣州 510442；4.中山大學中山醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 510080；5.南方醫(yī)科大學法醫(yī)學院，廣東 廣州 510515

死亡時間（postmortem interval，PMI）指檢驗尸體時距死亡發(fā)生時的死后經(jīng)歷或間隔時間[1]，準確推斷PMI 在案件偵破中具有重要作用，國內(nèi)外法醫(yī)學者一直在研究準確的PMI 推斷方法。PMI 推斷的技術方法不僅包括形態(tài)學、昆蟲學、物理化學、生物化學等傳統(tǒng)手段，還包括微生物組學、代謝組學、脂質(zhì)組學、蛋白質(zhì)組學、基因組學以及轉(zhuǎn)錄組學等組學方法。這些方法雖均能為PMI 提供重要信息，但形態(tài)學、昆蟲學、生物化學和分子病理學等反映的死后時序性變化規(guī)律多局限于理想條件或模型中[2]，如法醫(yī)昆蟲學方法主要應用于中晚期PMI 推斷，但我國較多地區(qū)缺乏研究數(shù)據(jù)影響了其應用；生物化學方法可通過檢測死后骨髓細胞核DNA 含量來推斷晚期尸體PMI，但DNA含量隨取材部位而異且存在個體差異，還易受到疾病、損傷、死亡原因、細菌繁殖等因素的影響。因此，這些方法的適用性和準確性易受到影響。

有學者結(jié)合微生物學和法醫(yī)學兩門學科的專業(yè)知識，將微生物組學分析應用于法醫(yī)學研究[3]。哺乳動物的尸體和微生物是環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)的關鍵，而在不同宿主和環(huán)境中，驅(qū)動尸體腐敗分解的各種微生物在一定程度上是相似的，故哺乳動物尸體的腐敗分解過程可能包括一個可預測的微生物序列[4]。這為利用與尸體相關的微生物群落推斷PMI 提供了生態(tài)學依據(jù)，使利用微生物組學方法進行PMI 推斷成為可能。已有研究使用測序技術對死后尸體樣本（皮膚、腸道等器官組織[5-14]）以及尸體相關土壤[5，7-8，11，15]的微生物進行分析，將微生物組數(shù)據(jù)與PMI 相關聯(lián)并建立回歸模型來預測PMI?；谖⑸锝M數(shù)據(jù)建立的回歸模型在一定程度上提供了較準確的PMI[5，11，13-14]以及可量化的錯誤率[7-8，16]。因此，利用微生物群落數(shù)據(jù)進行PMI 推斷是一種有價值的法醫(yī)學PMI 調(diào)查手段。本文就微生物群落在PMI 推斷中的技術方法、實際應用及影響因素等方面進行綜述，旨在為利用微生物組數(shù)據(jù)進行法醫(yī)學調(diào)查提供新的見解和思路。

1 微生物群落在PMI推斷中的技術方法

1.1 微生物群落的檢測鑒定方法

細菌、真菌等微生物的生長繁殖規(guī)律可通過人工培養(yǎng)方法進行研究，但這種傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式不僅對環(huán)境條件和操作技術要求高，且無法培養(yǎng)大量未知的和某些已知的菌種，還不能全面、準確地解釋微生物物種多樣性及其分布與功能，但測序技術的發(fā)展打破了這一瓶頸。高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）不需要分離和培養(yǎng)目標微生物，可直接對與尸體相關的微生物群落進行測序，從而獲得測序樣本的全部物種分類和豐度信息[17]。雖然高通量測序技術存在讀取DNA 長度較短[18]、嚴重依賴數(shù)據(jù)儲存和分析能力[19]等局限性，但其在鑒定和表征微生物群落結(jié)構(gòu)特征方面的能力不斷增強，即使是豐度較低的目標微生物也可通過高通量測序及其相關的生物信息學技術被檢測出來，擴大了基于微生物的法醫(yī)學鑒定范圍。因此，高通量測序具有高通量、高精度和大規(guī)模自動化能力等優(yōu)勢，是微生物群落應用于法醫(yī)學研究的理想、合適的分析技術，其主要通過16S rRNA、18S rRNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）測序來識別或描述樣本的微生物群落組成[20]。

16S rDNA 編碼細菌核糖體RNA 的小亞基（16S rRNA），其分子大小適中、功能高度保守、序列不同位置的變異速率不同，因此，一般選擇16S rDNA 作為分子標記進行細菌或古菌群落結(jié)構(gòu)和功能分析[21]。與原核生物相比，16S rRNA小亞基在真菌和其他真核生物中更保守，且提供的系統(tǒng)發(fā)育信息和物種劃分能力十分有限[22]，故一般不使用16S rRNA 小亞基作為真菌群落物種水平分析的目標。而真核藻類、真菌等真核生物群落多樣性研究常用的分子標記是18S rDNA和ITS。所有真核生物中均有18S rRNA，18S rDNA 的保守區(qū)允許設計高度通用的引物對真核生物進行廣泛的物種鑒定；ITS 位于18S rDNA、5.8S rDNA 與28S rDNA 之間，不編碼核糖體成分，種內(nèi)變異相對較低，能在進化過程中承受變異，其進化速率為18S rDNA的10 倍[23-24]。

1.2 利用微生物群落數(shù)據(jù)推斷PMI 的分析方法

有研究者利用高通量測序標記基因（16S rRNA[7-8，13-14]、18S rRNA[5，11]或ITS[23-24]）對每個微生物類群進行了分析，并將這些標記基因作為預測特征通過訓練、測試回歸模型來學習微生物組結(jié)構(gòu)與腐敗分解時間點之間的關系。機器學習方法在計算能力和大數(shù)據(jù)處理方面具有相當大的優(yōu)勢，能分析大量具有巨型DNA 序列的微生物組數(shù)據(jù)集[9]，建立一個基于微生物測序數(shù)據(jù)的PMI 推斷模型。

用于建立PMI 推斷模型的機器學習算法種類較多，且各有優(yōu)勢和局限性，實際應用時可根據(jù)數(shù)據(jù)類型和實際情況選擇合適的機器學習算法建立PMI推斷模型。有研究[7，13-14]表明，隨機森林回歸（random forest regression）可以基于不同物種尸體不同部位的皮膚樣本以及與尸體相關的土壤樣本的微生物組數(shù)據(jù)準確地推斷PMI。METCALF 等[7]根據(jù)微生物數(shù)據(jù)訓練的隨機森林回歸模型預測了PMI，在分解早期（前兩周）模型中的誤差為2～3 d。此外，他們還使用一種與土壤類型相關的細菌數(shù)據(jù)來訓練回歸模型，且當其預測其他類型樣本的PMI 時，對PMI 的估計仍然準確。隨機森林回歸模型推測PMI，其優(yōu)點在于性能優(yōu)異、易于并行化計算、回歸精度較高，但其局限性是具有系統(tǒng)偏差[9]。JOHNSON 等[8]通過開發(fā)支持向量回歸（support vector regression，SVR）、K-最近鄰（K-nearest neighbor，KNN）回歸、套索回歸、隨機森林回歸和貝葉斯回歸等模型，建立了人類腐敗尸體鼻腔和耳道中微生物群落估計PMI 的算法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精確至科和屬的完整數(shù)據(jù)集更適合訓練回歸量，且基于KNN 回歸推斷模型的平均誤差為±55 累積日度（accumulated degree days，ADD），能推斷較長的PMI，顯示出更高的準確性。KNN 簡單直觀、模式識別好，但對大數(shù)據(jù)集的可擴展性較低[5，8，25]。SVR 能較好地處理高維數(shù)據(jù)，但若相關性少則性能差[16]。LIU 等[13]通過隨機森林、支持向量機（support vector machine，SVM）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡（artificial neural network，ANN）模型分別預測小鼠死后模型的PMI，將支持向量機遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）模型、隨機森林回歸模型和ANN 模型應用于小鼠3種器官的死后微生物數(shù)據(jù)集，并使用PMI推斷的平均絕對誤差（mean absolute error，MAE）和擬合優(yōu)度檢驗（R2）來評估模型的性能和精度，其研究結(jié)果表明，ANN 模型結(jié)合盲腸的死后微生物數(shù)據(jù)集為最優(yōu)組合，24 h 和15 d 內(nèi)其MAE 分別為（1.5±0.8）h和（14.5±4.4）h。

機器學習算法通過綜合考察、挖掘、分析基于高通量測序技術的微生物群落多維度大數(shù)據(jù)，可評估、識別基因組數(shù)據(jù)的多變模式，建立準確、高效的回歸模型，進一步提升基于微生物群落演替估計PMI 的精確性[26]。

2 微生物群落在PMI推斷中的研究應用

2.1 微生物時鐘

微生物時鐘是基于已知PMI 與相應尸體樣本微生物組數(shù)據(jù)建立的回歸模型，但其存在什么樣本類型或尸體部位有最準確的微生物序列、什么時間段的時鐘最準確、哪些環(huán)境變量會提高模型的準確性等問題[16]。為此，國內(nèi)外研究者做了大量工作，METCALF等[5]采集小鼠尸體腹腔內(nèi)樣本及頭部、腹部皮膚樣本進行測序，發(fā)現(xiàn)基于腹腔微生物組數(shù)據(jù)的PMI 推斷模型的MAE 最大，而基于頭部皮膚微生物組數(shù)據(jù)的PMI推斷模型的MAE 最小，相比腹腔內(nèi)樣本，皮膚樣本更能提供有用的信息來評估PMI。BELK 等[9]的研究也表明，基于微生物的PMI 推斷，與尸體相關的土壤和皮膚是較優(yōu)的樣本，比較不同位置的皮膚可以幫助確定微生物時鐘最準確的取樣部位。ZHANG 等[27]采用高通量測序技術研究了埋于土壤20 cm 深處的SD 大鼠腐敗尸體的直腸、皮膚以及尸體相關土壤的微生物群落，結(jié)果表明，直腸微生物群落的變化相對緩慢，而尸體相關土壤微生物群落的演替最快，與PMI 的線性回歸擬合度最高。該研究還發(fā)現(xiàn)，與早期分解階段相比，晚期分解階段的α 多樣性較低，并且在分解后期不同部位樣本的微生物群落趨于相似，這一結(jié)果與METCALF 等[7，15，28]的研究結(jié)果相似。METCALF 等[7，14]的研究表明，與分解晚期階段相比，分解早期階段的微生物群落演替快、多樣性高，可能是最準確的時間框架，并且在早期分解過程中更頻繁的采樣可以提高模型的精度。DAMANN 等[28]探究了尸體腐敗分解晚期的微生物群落變化，發(fā)現(xiàn)部分白骨化遺骸中存在與人類腸道相關的細菌，而完全白骨化遺骸的細菌組成與土壤群落特征相似。此外，ZHANG 等[27]還發(fā)現(xiàn)埋葬于土壤和暴露于空氣中的尸體，雖然氧氣、濕度和光照等環(huán)境條件不同，但在分解過程中存在相似的微生物群落演替。環(huán)境因素是微生物群落聚集的重要驅(qū)動因素，不同埋藏條件下的死后微生物時鐘以及其與暴露于空氣中的腐敗微生物時鐘是否相同，還需進一步研究。

2.2 利用不同類型的微生物群落進行PMI 推斷

由于編碼細菌16S rRNA 的16S rDNA 具有良好的時鐘特性，故微生物群落研究主要集中于用細菌群落演替規(guī)律推斷PMI[6-10，12-15，29]。COBAUGH 等[15]分 析了人類腐敗尸體下土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，在自然土壤中豐度低而在腐爛過程中顯著增加的腐生細菌可成為PMI 推斷的生物標志物。DEBRUYN等[12]反復采集自然環(huán)境條件下腐爛尸體的盲腸菌群，通過16S rDNA 擴增子測序表征人類腸道細菌群落的死后變化，結(jié)果顯示，隨著時間的推移，腸道細菌豐度顯著增加，而多樣性則顯著降低。還有大量的研究[7-9，13-14]證明細菌群落變化可用于PMI 的估計，且建立的回歸模型效果較好，如HU 等[14]從死亡5～192 h 人類尸體的闌尾和橫結(jié)腸中分別采集菌群樣本，并運用闌尾菌群建立了一個R2為0.910、MAE 為（25.79±0.43）h 的隨機森林回歸模型，同時確定了每個樣本實際PMI 和預測PMI 之間的差異，表明可使用人類闌尾細菌群落演替估計PMI。

也有研究者探究了真核生物群落與尸體分解的關系，雖然關于真核生物群落影響尸體腐敗分解的研究較少，但其重要性不可忽視。METCALF 等[5]檢測了在實驗室環(huán)境中小鼠尸體的細菌群落和真核生物群落，發(fā)現(xiàn)僅基于真核生物群落建立的PMI 推斷模型效果不亞于細菌群落。FU 等[11]研究了室內(nèi)外豬尸體分解過程中的真菌組成及其演替模式，觀察到Candida xylopsoci、子囊菌（Ascomycota sp.）和嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）等在腐敗尸體真菌群落中占主導地位，該研究結(jié)果表明，可將這些特定的真菌分類群與PMI 相聯(lián)系作為推斷PMI 的指標，尤其是在尸體嚴重腐敗的情況下，真菌具有相當大的PMI 推斷潛力。FORGER 等[30]研究了死亡1 703 個ADD（或死亡60 d）豬尸體腐敗分解模型的真核生物群落特征，發(fā)現(xiàn)利用分類至科水平的真核生物群落數(shù)據(jù)所建立的隨機森林模型能解釋89.58%的ADD（或天）的變化，均方根誤差（root mean square error，RMSE）為177.55 個ADD（約為6 d），這一研究結(jié)果突出了真核生物群落在分解過程和PMI 推斷中的重要性。

2.3 利用微生物群落推斷水中尸體PMI

水中尸體死后淹沒時間（postmortem submersion interval，PMSI）可根據(jù)腐敗分期、尸體現(xiàn)象、昆蟲發(fā)育、理化方法、生物膜等方法進行推斷[17]。水中尸體腐敗分解受到自身（如死者自身穿著、是否負有重物）及其所處水環(huán)境（如水文環(huán)境、生物因素）的影響[31-33]，這些因素會影響PMSI 的準確推斷。而水中尸體體表形成的生物膜［由胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）包裹的有三維結(jié)構(gòu)的微生物群落］，能抵抗外界環(huán)境變化[30]，且生物膜形成過程中，微生物群落存在演替規(guī)律，生物膜結(jié)構(gòu)也由簡單逐漸變復雜。生物膜的這些特性均表明生物膜與PMSI密切相關[34]，展現(xiàn)出利用水中尸體上生物膜推斷PMSI 的潛能。

BENBOW 等[6]研究夏季和冬季河流中豬尸體皮膚的細菌群落變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個季節(jié)的屬豐富度均顯著增加，不同季節(jié)的細菌群落存在顯著差異，表明探尋不同季節(jié)水中尸體的細菌群落變化規(guī)律可用于估計PMSI。隨后，LANG 等[35]使用自動核糖體間隔基因分析技術對比兩條淡水河流中豬尸體上生物膜的細菌群落，發(fā)現(xiàn)死亡3～7 d 豬尸體皮膚固有的細菌群落轉(zhuǎn)變?yōu)橐原h(huán)境為基礎的生物膜細菌群落，且死亡14～17 d 豬尸體上生物膜的細菌群落存在演替，證實尸體上生物膜的細菌群落均顯示出與PMSI 相關的演替規(guī)律。KASZUBINSKI 等[36]通過高通量測序描述靜水環(huán)境中豬尸體的死后微生物群落組成變異性，確定了靜水環(huán)境中與尸體分解相關的關鍵微生物分類群，建立了R2為0.975、誤差為±3 d 的隨機森林回歸模型以估計PMSI，并確定了幾個重要分類群為未來估計PMSI 重要的指標分類群。WANG 等[37]利用第三代全長測序技術檢測溺水大鼠皮膚表面的細菌群落，發(fā)現(xiàn)尸體皮膚表面的細菌有規(guī)律的演替模式，綠彎菌門（Chloroflexi）和梭桿菌門（Fusobacteriota）僅出現(xiàn)在死亡后的前7 天，可用于確定PMSI 是否超過1 周。該研究利用細菌群落數(shù)據(jù)結(jié)合尸體腐敗分解征象，將PMSI鎖定在具體的時間段內(nèi)，為利用細菌生物膜估計水中尸體的PMI 提供了參考。

3 微生物群落在PMI推斷中的影響因素

尸體腐敗分解過程中，溫度、濕度、周圍植被和土壤酸堿度等環(huán)境因素以及組織類型和昆蟲等生物因素均會影響微生物群落的演替[22]，目前的研究主要集中于探究昆蟲活動及溫度對微生物群落演替推斷PMI 的影響。

有學者進行了微生物-昆蟲相互作用對PMI 推斷影響的研究。CROOKS 等[38]研究了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對絲光綠蠅（Lucilia sericata）、紅頭麗蠅（Calliphora vicina）及反吐麗蠅（Calliphora vomitoria）定殖和生長的影響，了解微生物-昆蟲相互作用以改進最小PMI 的估計。該研究還發(fā)現(xiàn)，不同種類蒼蠅幼蟲的生長速度受到不同種類飼糧（包含不同種類細菌）的影響，喂養(yǎng)含有大腸桿菌飼糧和含有混合細菌飼糧的反吐麗蠅的體質(zhì)量最大，而喂養(yǎng)含有金黃色葡萄球菌飼糧的紅頭麗蠅的體質(zhì)量最大，并指出細菌代謝活性增加對幼蟲發(fā)育的影響可能是積極的、消極的或中性的。而昆蟲活動對微生物群落的影響，可能是在尸體分解過程中通過嗜尸性昆蟲運輸?shù)绞w上的細菌，通過競爭、協(xié)同等過程影響尸體上的微生物物種豐度，并且隨著時間的推移，由于昆蟲的定殖和侵蝕導致物種豐度下降，隨后昆蟲定殖者的幼蟲發(fā)育可能會通過在尸體上直接或間接的相互競爭而破壞已建 立的 微生 物群 落[39]。WEATHERBEE 等[40]用16S 擴增子測序表征豬尸體表面相關的、環(huán)境中嗜尸性雙翅目幼蟲內(nèi)部的以及定殖于豬尸體上的雙翅目幼蟲群的微生物組，發(fā)現(xiàn)多種蒼蠅物種在群體中的相對豐度發(fā)生了變化，群體中某些麗蠅科（Calliphoridae）物種的存在可能與微生物群落的時間變化有關，表明環(huán)境、微生物和昆蟲幼蟲之間存在顯著的相互作用。因此，在利用微生物群落信息進行PMI 推斷時應考慮昆蟲的存在與否，且應將其作為未來相關研究的重要特征進行檢驗驗證。

已有研究[7-9]表明，溫度是微生物分解回歸模型的重要環(huán)境特征，在同一環(huán)境中使用兩個季節(jié)的PMI模型時，預測精度優(yōu)于隨機水平。IANCU 等[41]研究寒冷季節(jié)戶外豬尸體直腸和口腔內(nèi)嗜尸性昆蟲物種和細菌群落的演替，發(fā)現(xiàn)嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和γ 變形桿菌（Gammaproteobacteria）棲息在溫度非常低的土壤中，甚至在10 ℃下也能繁殖，還發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)嗜冷桿菌屬持續(xù)生長的環(huán)境溫度與該研究調(diào)查過程中的最低溫度相對應。為探究不同季節(jié)不同溫度下尸體腐敗過程中的嗜尸性昆蟲物種及微生物群落變化，IANCU 等[42]又研究了溫暖季節(jié)豬尸體分解過程中嗜尸性昆蟲定殖過程中細菌物種的時間演替，以確定其是否有助于估計PMI。該研究采用主成分分析方法揭示了溫暖季節(jié)實驗中空氣溫度、土壤溫度和相對濕度對分解階段動態(tài)的影響，結(jié)果顯示：第一主成分軸與空氣溫度和土壤溫度呈高度的直接相關，與相對濕度呈高度的負相關；第二主成分軸與空氣溫度呈負相關，與土壤溫度和相對濕度高度相關。以上研究均表明，溫度是尸體腐敗分解過程中微生物群落研究不可忽視的因素。

法醫(yī)學實踐中現(xiàn)場實際情況復雜、影響因素不一，每種因素都可能單獨影響PMI 推斷模型的建立或多種因素產(chǎn)生聯(lián)合作用影響PMI的推斷。如METCALF[16]所指出的陸地、水生等不同環(huán)境類型，氧含量、濕度等環(huán)境變量，以及尸體衣著、死因等尸體本身相關變量，這些因素是否影響以及如何影響尸體腐敗分解過程中微生物群落的演替，都應作為未來研究的重要參數(shù)進行檢驗。是否可以開發(fā)一個單一的、可推廣的模型，或者建立多影響因素下的PMI 推斷模型，是未來利用微生物群落演替規(guī)律推斷PMI 的重點。

4 展 望

本文綜述了近年來利用微生物群落演替規(guī)律推斷PMI 的研究進展，通過高通量測序技術和生物信息學分析技術表征微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度變化，再結(jié)合機器學習算法關聯(lián)死后微生物群落與PMI，并建立PMI推斷模型以便更準確地推斷尸體PMI。微生物群落在法醫(yī)學中的應用因高通量測序數(shù)據(jù)的存儲與分析以及基因數(shù)據(jù)生成的進展而得到了重大突破，與死后尸體相關的微生物群落可應用于陸地、水中尸體的PMI 推斷，從而作為輔助證據(jù)在刑事案件的法醫(yī)學調(diào)查中扮演重要角色[43]，未來微生物組的研究可能在法醫(yī)學中應用更廣泛。

微生物群落變化受環(huán)境因素和生物因素的影響，因此，在后續(xù)利用微生物群落演替推斷PMI 的研究中應充分探究各因素對微生物組的動態(tài)影響，綜合探討各影響因素的變化規(guī)律對于準確關聯(lián)PMI 和微生物群落變化具有的重要意義。微生物測序過程中的不同階段均可能影響結(jié)果的準確性，因此，有必要為樣本的采集、處置和保存制定標準，還應進一步驗證所有方法的靈敏度、特異性、重復性和檢測限等性能，并創(chuàng)建可靠、全面、公開可用的基礎數(shù)據(jù)庫[44]。利用機器學習算法輔助推斷PMI 應擴大研究范圍，優(yōu)化和標準化用于微生物群落分析的機器學習算法，生成一個全面的數(shù)據(jù)集來訓練、測試和建立具有更大樣本量的健壯模型，保證模型的普適性、有效性和可靠性，進一步提升基于微生物群落的PMI 推斷的準確性。此外，微生物組學方法推斷PMI 在研究成本和技術上要求較高，解決關于微生物組現(xiàn)有的知識、技術和數(shù)據(jù)等問題，在高通量測序技術檢測微生物的基礎上，研發(fā)和篩選出低成本且操作便捷的微生物組學PMI 推斷方法勢在必行。