重組人凝血因子Ⅶ的表達、激活與功能鑒定

李倩卉，劉旭，王志軍，路中樞，高雪寒，薛成峰，張子義，李齊

（莊亞（北京）生物科技有限公司，北京 100176）

活化的重組人凝血因子Ⅶ（Activated Recombinant Human Coagulation Factor Ⅶ，rhF Ⅶa）由于良好的安全性被廣泛應用于出血性疾病的治療，其適應癥包括含有凝血因子Ⅷ（Coagulation Factor Ⅷ，F(xiàn) Ⅷ）/凝血因子Ⅸ（Coagulation Factor Ⅸ，F(xiàn) Ⅸ）抑制物的A型與B 型血友?。℉emophilia，HA）、獲得型血友病、遺傳性凝血因子Ⅶ缺乏癥及血小板無力癥等疾病。rhF Ⅶa 還可以用于治療外科手術或嚴重創(chuàng)傷引發(fā)的大出血等其他出血性疾病[1]。目前，NovoSeven 與SevenFact 是全球僅有的兩個重組產品，NovoSeven 是諾和諾德利用幼年倉鼠腎細胞（Baby Hamster Kidney）表達純化而得，SevenFact 是法國LFB 公司利用轉基因兔乳腺生產制得[2-3]。國產rhF Ⅶa 藥品還未見批準上市。隨著國內血友病等出血性疾病治療市場的日益擴大，急需開發(fā)國產rhF Ⅶa。

楊劍鋒等[4]曾經嘗試利用CHO 表達rhF Ⅶ，但只獲得了酶原形式的rhF Ⅶ。項目組利用中國倉鼠卵巢（Chinese Hamsterovary Ovary，CHO）細胞表達系統(tǒng)及成熟的蛋白表達工藝成功開發(fā)出了活化的重組人凝血因子Ⅶ（產品名稱為NeoSeven）。國內目前尚未見國產rhF Ⅶa 與諾和諾德rhF Ⅶa 的對比報道?；诖?，本文闡述了利用CHO-K1 宿主細胞表達/純化rhF Ⅶ的方法，比較了NovoSeven 與NeoSeven 的生化及生物學活性，檢測內容與方法包括SDS-PAGE、Western Blot、與組織因子結合的親和力鑒定、對發(fā)色底物S-2288 的酶切活性、活化部分凝血活酶時間（Activated Partial Thromboplastin Time，APTT）/ 凝血酶原時間（Prothrombin Time，PT）及血栓彈力儀（Thrombelastography，TEG）等。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

UD-T5000 型血栓彈力圖儀，深圳優(yōu)迪生物技術有限公司；58230 型凝血儀，法國Stago 公司；10%SDS-PAGE 膠，實驗室自制。

sTF-his/sTF-Fc，實驗室構建表達；Novoseven，丹麥諾和諾德公司；Neoseven，實驗室表達/激活；CHO-K1，歐洲認證細胞培養(yǎng)物收藏中心（ECACC）；山羊抗凝血因子Ⅶ多克隆抗體、山羊抗凝血因子Ⅷ多抗，加拿大Haematologic Technologies 公司；Actipro 培養(yǎng)基、CD CHO AGT?培養(yǎng)基，美國Cytiva 公司；HT/GS，美國Thermo Fisher 公司；蛋氨酸磺酸鹽（MSX），美國Sigma 公司；Cell boost 7a/Cell boost 7b:，美國Cytiva 公司；維生素K1，北京索萊寶科技有限公司；Hind Ⅲ-HF，EcoR Ⅰ-HF、 PVU Ⅰ-HF，美國NEB公司；S-2288，北京阿斯雷爾有限公司；APTT 試劑（STA-PTT Automate 5）、乏凝血因子Ⅶ血漿、STANeoplastine Cl Plus5 Prothrombin Time（PT）、通用定標血漿，法國Stago 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組人凝血因子Ⅶ表達載體構建

含有406 個氨基酸的完整rhF Ⅶ讀碼框（ORF）基因序列[5]，包括信號肽，由通用生物根據(jù)CHO 表達系統(tǒng)優(yōu)化合成。該DNA 片段經PCR 加入Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ酶切位點，插入經Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切的HX1（自有表達GS 載體）中。經轉化至DH5α 感受態(tài)細胞，然后挑取單菌落進行培養(yǎng)。細菌擴增后，抽提質粒DNA 進行酶切鑒定。

1.2.2 蛋白表達與純化

將酶切鑒定后的rhF Ⅶ表達質粒進行單酶切以制備線性化質粒，然后使用Lonza 電轉儀DT-133 程序將表達質粒轉入CHO-K1 宿主細胞。轉染后細胞置于含維生素K 與MSX 的CHO 培養(yǎng)基中培養(yǎng)加壓篩選。最終的rhF Ⅶ高產細胞株通過分批補料式培養(yǎng)（fed-batch）確認，所表達并純化激活的rhF Ⅶa命名為NeoSeven。NeoSeven 的純化與激活采用經典的親和與離子交換層析等蛋白純化方法[6-9]。

1.2.3 SDS-PAGE 與Western Blot

rhF Ⅶa 由輕重鏈組成蛋白復合物，在還原的條件下，輕重鏈斷開為20 kDa 與30 kDa 兩條單鏈。為驗證純化后的樣品為激活狀態(tài)，將樣品進行還原處理并與非還原樣品同時進行SDS-PAGE 與Western Blot鑒定。

SDS-PAGE：將相同質量（1.5 μg）rhFⅦa（Neoseven和Novoseven）與還原劑二硫蘇糖醇（DTT）上樣緩沖液混合。另取相同質量（1.5 μg）rhF Ⅶa（Neoseven和Novoseven）樣品上樣緩沖液混合孵育作為對照?；旌系臉悠贩謩e于沸水浴中孵育10 min，高溫變性后進行SDS-PAGE 電泳與考馬斯亮藍染色。

Western Blot：將相同質量（1.5 μg）rhF Ⅶa（Neoseven 和Novoseven）與DTT 上樣緩沖液混合。另取相同質量（1.5 μg）rhF Ⅶa（Neoseven 和Novoseven）樣品上樣緩沖液混合孵育作為對照?；旌系臉悠贩謩e于沸水浴中孵育10 min，高溫變性后進行SDS-PAGE 電泳，通過半干轉儀器將SDS-PAGE中的蛋白轉移至硝酸纖維膜上。用5%的脫脂奶粉封閉轉移蛋白后的硝酸纖維膜，再用辣根過氧化物酶（HRP）標記的小鼠抗hF Ⅶ輕鏈的單抗對硝酸纖維膜進行孵育，使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液進行顯色。

1.2.4 rhF Ⅶa 與sTF 結合的親和力驗證

rhF Ⅶa 與組織因子胞外區(qū)（soluble Tissue Factor，sTF）的結合親和力通過生物膜干涉技術（Bio-Layer Interferometry，BLI）進行驗證。按照儀器的操作方法[10]，將組織因子胞外區(qū)-組氨酸融合蛋白（sTF-his）與組織因子胞外區(qū)-Fc融合蛋白（sTF-Fc）分別包被在氨基或蛋白A（protein A）探針上。阻斷非特異性結合位點后，在含5 mmol/L CaCl2的緩沖液中準備不同濃度的（100 nmol/L、50 nmol/L、25 nmol/L）NovoSeven 與NeoSeven，然后與包被在探針上的sTF-his 或sTF-Fc 進行結合實驗。rhF Ⅶa 與sTFhis 或sTF-Fc 的結合速率常數(shù)（Association）與解離速率常數(shù)（Dissociation）數(shù)據(jù)的采集時間分別為180 s與200 s。

1.2.5 rhF Ⅶa 活性鑒定

rhF Ⅶa 的活性鑒定通過其與sTF-his 結合后對發(fā)色底物S-2288 的酶切速率來驗證[11-12]。S-2288是一種絲氨酸蛋白酶光譜發(fā)色底物，與F Ⅶa 作用于凝血因子Ⅹ的酶切位點氨基酸相同。rhF Ⅶa 可以酶切S-2288，rhF Ⅶa 在與sTF-his 結合后會提高對S-2288的酶切速率。在含5 mmol/L CaCL2的緩沖液中加入100 nmol/L 的rhF Ⅶa、200 nmol/L 的sTF-his 及1 mmol/L的S-2288，間隔5 min 用酶標儀持續(xù)讀取405 nm 處的吸收值，直至吸收值達到平臺期。

1.2.6 活化部分凝血活酶時間與凝血酶原時間

活化部分凝血活酶時間（APTT）的檢測是將rhF Ⅶa 蛋白加入乏F Ⅷ因子血漿來檢測其促凝血活性的STart 4 數(shù)據(jù)。簡言之，將反應杯放在孵育孔中，并在每個孔中放入一個磁珠。應用反向移液法將50 μL 乏F Ⅷ因子血漿加入到每個反應杯的底部，靜置30 ～45 s 以溫熱血漿，在每個孔中分別加入5 μL檢測樣品（NovoSeven 或NeoSeven）。簡短孵育后在每個孔中加入50 μL APTT 試劑（試劑盒中自帶），37 ℃條件下孵育240 s，最后加入50 μL 的20 mmol/L 的CaCl2啟動凝血過程。血漿凝固時間與加入的hF Ⅶa濃度成正比[13]。

凝血酶原時間（PT）的檢測是將hF Ⅶa 蛋白加入乏F Ⅶ因子的血漿來檢測其促凝血活性。簡言之，將反應杯放在孵育孔中，并在每個孔中放入一個磁珠。應用反向移液法將50 μL 乏F Ⅶ因子血漿加入到每個反應杯的底部，靜置30 ～45 s 以溫熱血漿，在每個孔中分別加入5 μL 檢測樣品（NovoSeven 或NeoSeven）。簡短孵育后在每個孔中加入100 μL 含CaCl2的PT 試劑啟動凝血過程。血漿凝固時間與加入的hF Ⅶa 濃度成正比[13]。

1.2.7 血栓彈力圖

血栓彈力圖（Thrombelastography，TEG）能反映全血凝血過程中血小板與凝血因子的相互作用，展現(xiàn)凝血發(fā)生、發(fā)展的全過程。凝血反應時間（R）常用來檢測止血藥物的凝血活性。首先從健康人體中采集新鮮血液，將血液收集于抗凝管中。將9 mL 上述血液與終濃度0.1 mg/mL 的綿羊抗F Ⅷ多抗孵育（37 ℃，30 min）以制備A 型血友病樣血液（HA）。然后向裝有高嶺土的試管中加入1 mL 上述抗凝血，顛倒混勻5 次，室溫孵育≥1 min。再向血栓彈力儀樣品檢測杯中依次加入下列反應試劑：20 μL 待測樣品（NovoSeven 或NeoSeven）+20 μL CaCl2（0.2 mol/L）+340 μL 血液。檢測開始后，記錄每份樣品的凝血反應時間。

2 結果與分析

2.1 質粒酶切鑒定結果

將提取的質粒用Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ進行雙酶切鑒定（圖1），酶切片段大小為1 413 bp，泳道1 為原始質粒，泳道2 為雙酶切后的樣品，在1 000 ～2 500 bp的DNA Marker 之間的條帶即為目的條帶，大小正確。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳酶切鑒定結果圖

2.2 細胞篩選結果

使用電擊法將NeoSeven 線性化質粒轉入CHO-K1 宿主細胞，經過96 孔板、24/48 孔板、6 孔板、T25 最終篩選出5 pools 于E125 搖瓶中進行fedbatch 評估。以1.0×106cells/mL 密度接種，培養(yǎng)基為Actipro+2% GS+1% HT+25μmol/L MSX+1 mg/L VK1，于37 ℃、5% CO2、100 r/min 條件下培養(yǎng)，密度達到9×106cells/mL 或10×106cells/mL 后（達不到則統(tǒng)一培養(yǎng)6 d）降溫至31 ℃，降溫后流加培養(yǎng)基7a+7b，流加策略為第3 d、5 d、7 d、9 d 分別流加3%、3%、5%、5% 的7a 與0.3%、0.3%、0.5%、0.5% 的7b。補糖策略為葡萄糖含量小于5 g/L 時補至5 g/L。存活率低于90%或11 d 收獲上清。圖2 為最終篩選得到的5 pools 篩選結果，從中篩選得到pool 細胞6B2，細胞密度可以達到18.5×106cells/mL，且細胞生長可以維持到11 d，產量可達50 mg/mL。

圖2 細胞篩選結果圖

2.3 純化與激活樣品SDS-PAGE 與Western Blot

使用SDS-PAGE 比較NeoSeven 與NovoSeven 分子量與激活（圖3）。泳道1 與2 是非還原的NovoSeven與NeoSeven 樣品，泳道3 與4 是還原的NovoSeven 與NeoSeven 樣品。泳道1 與2 的樣品由于hF Ⅶa 的輕重鏈之間的二硫鍵保持完整，因此呈單鏈狀態(tài)，分子量一致（50 kDa）。泳道3 與4 的樣品的輕重鏈之間的二硫鍵被打斷，因此表現(xiàn)為一個重鏈（30 kDa）與一個輕鏈（20 kDa）。

圖3 rhF Ⅶa 的SDS-PAGE 結果

Western Blot 顯示（圖4）還原與非還原的NeoSeven 與NovoSeven 均可以被HRP 標記的鼠抗hF Ⅶ單抗識別。rhF Ⅶa 的分子量為50 kDa 左右。在還原的狀態(tài)下，rhF Ⅶa 被解離為30 kDa 與20 kDa兩條帶。由于實驗中的抗體為只識別rhF Ⅶa 輕鏈的單克隆抗體，因此rhF Ⅶa 在非還原狀態(tài)下，其Western Blot 結果顯示為50 kDa 單條帶。rhF Ⅶa 在還原狀態(tài)下，只顯示20 kDa 左右的rhF Ⅶa 輕鏈。上述分析顯示NeoSeven 在蛋白純度、分子量與激活等方面與NovoSeven 相似。

圖4 rhF Ⅶa 的Western Blot 結果

2.4 rhF Ⅶa 與sTF-his 或sTF-Fc 的親和力檢測

BLI 分析顯示（表1）NeoSeven 與組織因子胞外區(qū)（sTF-his 或sTF-Fc）的親和力與NovoSeven 相似。諸多文獻證實[14-15]，組織因子的空間構象直接影響其與F Ⅶ的結合。將sTF-his 直接包被于探針，由于空間構象的不均一性，導致與F Ⅶa 的親和力降低。然而，將sTF-Fc 包被于Protein A 探針，由于組織因子空間結構的一致性大大提高，從而與F Ⅶ的親和力顯著提高。

表1 組織因子（胞外區(qū)）與hF Ⅶa 親和力

2.5 rhF Ⅶa 活性鑒定

根據(jù)NovoSeven、NeoSeven 與sTF 結合后對底物S-2288 的酶切速率分析（圖5），在sTF 存在的情況下，NovoSeven 和NeoSeven 對底物S-2288 的酶切速率比無sTF 存在的情況下明顯增強。相同濃度的NovoSeven、NeoSeven 對底物的酶切速率相同，耗盡底物S-2288 的時間相同。從NovoSeven、NeoSeven與sTF 結合后對底物S-2288 前10 min 的酶切線性斜率可以看出，NovoSeven 和NeoSeven 對底物S-2288的酶切速率接近一致。經過對比分析，兩種rhF Ⅶ a的活性相似。

圖5 rhF Ⅶa 對底物S-2288 酶切速率結果圖

2.6 活化部分凝血活酶時間與凝血酶原時間

用活化部分凝血活酶時間（APTT）與凝血酶原時間（PT）實驗檢測NeoSeven 與NovoSeven 的凝血活性[13]。不同蛋白量的兩種rhF Ⅶa 樣品分別加入實驗體系中，NovoSeven 與NeoSeven 相對應的APTT凝血活性和PT 凝血活性相似（圖6）。

圖6 凝血活性檢測結果

2.7 血栓彈力圖分析

應用血栓彈力儀比較NeoSeven 與NovoSeven 在全血中促凝血活性可以更加全面地對hF Ⅶ因子進行評估[16]。結果顯示（圖7），由抗F Ⅷ抗體制備的類A 型血友病全血樣品（HA）的凝血反應時間為35 min左右。當對同一血樣加入100 nmol/L 的NeoSeven（HA/NeoSeven）或NovoSeven（HA/NovoSeven）時，凝血反應時間均為10 min 左右，說明NeoSeven 的凝血活性等同于NovoSeven。對于中國人，凝血反應時間正常范圍在4 ～9 min，也就是說，100 nmol/L 的F Ⅶa 基本可使血友病患者的凝血功能恢復至正常水平。

圖7 產品在全血中的促凝血活性

3 討論

本研究闡述的由CHO/GS 系統(tǒng)生產的rhF Ⅶ以及其在生物化學/凝血功能方面與NovoSeven 的比較分析在國內尚屬首次。CHO 細胞表達的rhF Ⅶ由于其肝臟清除率低及AUC 高被認為是最適合于rhF Ⅶ表達的系統(tǒng)[1]，項目組成功獲得了rhF Ⅶ的高表達株（～50 mg/L）。

F Ⅶa 與TF 的高親和力結合是啟動外源性凝血系統(tǒng)的關鍵步驟。F Ⅶa 與TF 的親和力分析常被用來鑒定F Ⅶ的結構與功能。常用的方法是分析F Ⅶ與置于磷脂中的TF 的親和力[17]。直接包被沒有磷脂的TF，由于蛋白包被位點不一，從而導致TF 與F Ⅶ結合部位的不一致，直接影響了TF 與F Ⅶ的結合，導致親和力下降[18-20]。本實驗中采用的TF 包括TF 胞外區(qū)（sTF-his）及sTF與Fc組成的融合蛋白（sTF-Fc）。sTF-his 可以直接被偶聯(lián)至氨基探針上，而sTF-Fc 則可以利用其Fc 部分均一地偶聯(lián)至Protein A 探針上，從而保證了所有sTF-Fc 分子中的sTF 部分的方向一致且游離，能有效與系統(tǒng)溶液中的F Ⅶa 結合。其較高的親和力與較低的解離率與文獻中的同類數(shù)據(jù)相似[21]，因此認為本文描述的方法在維持TF 方向與空間構象方面較磷脂插入法更為優(yōu)越。

TEG 是臨床中使用的一種可反映全血功能全貌的監(jiān)測實驗[22-24]。F Ⅶ功能的發(fā)揮依賴于其Gla 結構域與全血中的血小板磷脂膜的結合。由于全血中含有血小板，因此TEG 實驗與其他實驗（APTT、PT、ELISA 等）相比更適合用來鑒定F Ⅶ的功能[25-27]。用抗F Ⅷ抗體人為制備了含有F Ⅷ抑制物的全血，其凝血時間與血友病人的血凝時間相似，表現(xiàn)為凝血時間的延長。在高嶺土激活劑的啟動下，分別加入的兩種F Ⅶa 因子展現(xiàn)了一致的促凝血能力。

4 結論

本研究成功利用CHO/GS 系統(tǒng)表達/純化了rhF Ⅶ，并通過離子交換層析與鈣離子制備了具有活性的rhF Ⅶa。 通過SDS-PAGE、Western Blot、rhF Ⅶa 與組織因子結合實驗、rhF Ⅶa 酶活實驗、APTT/PT 以及血栓彈力儀等實驗全面分析了制備產品（NeoSeven），并與NovoSeven 進行了比較。結果顯示，NeoSeven 在生物化學與凝血活性等方面展現(xiàn)了與NovoSeven 相似的特性，為將來近一步對NeoSeven進行翻譯后修飾的鑒定與臨床前實驗（PD、PK、毒理）奠定了基礎。