煙管頭草的化學(xué)成分及其體外抗白血病活性研究

馮樹慧, 晏 晨, 張衛(wèi)青, 梁 偉, 李艷梅, 韋學(xué)耐, 饒 青, 馬四補(bǔ)

( 1. 安順市人民醫(yī)院 藥劑科, 貴州 安順 561000; 2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué), 貴陽 550025; 3. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550014 )

煙管頭草(Carpesiumcernuum)又名杓兒菜、煙袋草,是天名精屬(Carpesium)植物的模式種,主要分布在我國四川、云南、貴州、湖南及陜西等地,生于路邊荒地及山坡、溝邊等處,在民間把其與金挖耳當(dāng)作同一種使用(中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會,1979)。全草入藥,性濕微苦,有小毒,治瘧疾,喉炎;鮮葉外用治瘡?fù)?根治痢疾、牙痛、子宮脫垂、脫肛(張志剛等,2005)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,其具有抗腫瘤(Kim et al., 2007;Liu et al., 2016;Dang et al., 2019)、抗炎(Liu et al., 2010)和抗寄生蟲(Chung &Moon, 2009;Kim et al., 2009)等藥理作用。相關(guān)研究表明,煙管頭草的化學(xué)成分包括倍半萜、單萜、二萜、三萜、香豆素、木脂素、揮發(fā)油、黃酮、甾醇、苯酚、糖苷類等,其中主要成分為倍半萜類化合物(Ma et al., 2008;Zhang et al., 2015;王坤等,2019;馮樹慧等,2022)。

天名精屬植物中含有豐富的倍半萜類成分,近兩年國內(nèi)外學(xué)者從中共分離得到51個(gè)倍半萜類化合物,包括5個(gè)新的吉瑪烷型倍半萜,并研究了其抗腫瘤、抗炎等活性(Wu et al., 2021;Yan et al., 2021;楊寶嘉等,2021;Zhong et al., 2022;Wang et al., 2022;Yang et al., 2022;Shen et al., 2022;陳潔等,2022)。課題組前期運(yùn)用多種色譜及波譜技術(shù)從煙管頭草中分離鑒定了5個(gè)新吉瑪烷型倍半萜類化合物,活性測試表明其具有一定的抗腫瘤活性,特別是對白血病細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用(Yan et al., 2018,2021)。然而,本文發(fā)現(xiàn)的新化合物與近兩年國內(nèi)外學(xué)者以及課題組前期分到的新吉瑪烷型倍半萜在結(jié)構(gòu)上有一定的差異,主要表現(xiàn)為該化合物在環(huán)外有一個(gè)氧橋。此外,活性測試發(fā)現(xiàn)該新化合物無明顯的抗腫瘤活性。

研發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物是醫(yī)療行業(yè)亟須解決的關(guān)鍵性問題?；诒菊n題組前期研究,為深入闡明煙管頭草的抗腫瘤活性物質(zhì)基礎(chǔ),本研究以煙管頭草為研究對象,依托貴州民族醫(yī)藥研發(fā)平臺和現(xiàn)代先進(jìn)的儀器設(shè)備,采用多種色譜分離技術(shù)、現(xiàn)代波譜學(xué)鑒定技術(shù)以及現(xiàn)代藥理學(xué)技術(shù),擬探討以下問題:(1)煙管頭草乙酸乙酯部位的化學(xué)成分;(2)分離得到的部分化合物對白血病細(xì)胞的體外抑制作用。

1 材料與儀器

1.1 材料

藥材:煙管頭草藥材于2016年10月在貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣采集,由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為天名精屬植物煙管頭草(Carpesiumcernuum),標(biāo)本存放于貴州省安順市人民醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室,標(biāo)本號為Assrmyy201608。

細(xì)胞株:人白血病細(xì)胞(K562和HEL)購買于ATCC細(xì)胞庫,存放于貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李艷梅教授課題組。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

儀器:INOVA-400 MHz和INOVA-500 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(美國Varian公司);Bruker HCT/Esquire和Waters Autospec Premier P776質(zhì)譜儀(德國Bruker公司,美國Waters公司);Bruker Tensor-27傅里葉紅外光譜儀(德國Bruker公司);Shimadzu UV-2401PC紫外可見分光光度儀(日本Shimadzu公司);JASCO P-1020旋光儀(日本JASCO公司);Waters 1525 EF高效液相色譜儀(美國Waters公司);0SB-2200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);倒置光學(xué)顯微鏡(Zeiss公司);臺式高速冷凍離心機(jī)(Backman公司);可調(diào)微量移液器(Eppendorf公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma公司);多功能酶標(biāo)儀(Gene公司)。

試劑:Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(日本三菱化學(xué)公司);柱層析硅膠(300～400目,青島海洋化工廠);硅膠GF254薄層板(青島海洋化工廠);高效液相所用的乙腈、甲醇為色譜純(薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司);丙酮、氯仿等為分析純(重慶川東化工集團(tuán)有限公司);二甲基亞砜(DMSO,生工生物工程(上海)股份有限公司);噻唑藍(lán)(MTT,北京索萊寶科技有限公司);胎牛血清(FBS,HyClone公司);細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640(Gibco公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

稱取20.0 kg干燥的煙管頭草全草,粉碎后用95%乙醇在80 ℃下加熱回流提取3次(每3小時(shí)1次),將所有提取液合并后濃縮,回收乙醇,得到2.0 kg浸膏。取1.0 g浸膏留樣,其余浸膏加水?dāng)嚢枋怪尸F(xiàn)懸浮狀態(tài),再用乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯層和水層。將960.0 g乙酸乙酯萃取物用40～80目粗硅膠拌樣,待樣品干燥后,運(yùn)用300～400目的硅膠柱層析,以石油醚-丙酮(60∶1→1∶1)進(jìn)行洗脫,洗脫部分用TLC薄層板展開,在紫外分析儀下觀察TLC薄層板熒光情況,并用10%硫酸乙醇溶液顯色,合并熒光及顯色相似部分,用甲醇處理硅膠柱,得到7個(gè)餾分(Fr.1～Fr.7)。

將第一餾分Fr.1(64.0 g)用粗硅膠拌樣后上硅膠柱層析,采用石油醚-乙酸乙酯(60∶1→1∶1)作為洗脫劑進(jìn)行洗脫,得到4個(gè)餾分(Fr.1-1～Fr.1-4)。Fr.1-1經(jīng)硅膠柱層析,使用石油醚-丙酮(60∶1→10∶1)作為洗脫劑進(jìn)行分離,并用重結(jié)晶方法進(jìn)一步純化,得到化合物11(16.5 mg)。Fr.1-2用硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯(30∶1→1∶1)作為洗脫劑進(jìn)行分離,并用Sephadex LH-20柱層析,以甲醇作為洗脫劑進(jìn)一步純化,得到化合物6(12.4 mg)。

將第四餾分Fr.4(103.5 g)用大孔吸附樹脂柱層析,以甲醇-水(20%、40%、60%、80%、95%)作為洗脫劑進(jìn)行洗脫,得到5個(gè)餾分(Fr.4-1～Fr.4-5)。Fr.4-3經(jīng)硅膠柱層析,用石油醚-丙酮(15∶1→3∶1)進(jìn)行梯度洗脫,得到3個(gè)餾分(Fr.4-3-1～Fr.4-3-3)。Fr.4-3-2用硅膠柱層析,以石油醚-丙酮(10∶1→3∶1)作溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分離,得到化合物1(2.0 mg)。Fr.4-4經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-丙酮(8∶1→1∶1)作為洗脫劑進(jìn)行洗脫,得到5個(gè)餾分(Fr.4-4-1～Fr.4-4-5)。Fr.4-4-2經(jīng)Sephadex LH-20柱層析,以氯仿-甲醇(1∶1)作為洗脫劑進(jìn)行分離,得到6個(gè)餾分(Fr.4-4-2-1～Fr.4-4-2-6)。Fr.4-4-2-3經(jīng)硅膠(石油醚∶丙酮=10∶1→3∶1)和Sephadex LH-20(CHCl3∶MeOH=1∶1)反復(fù)柱層析,得到化合物5(5.0 mg)、7(6.0 mg)和10(4.5 mg)。Fr.4-4-2-4經(jīng)硅膠(石油醚∶丙酮=10∶1→3∶1)和Sephadex LH-20(MeOH)反復(fù)柱層析,并用制備高效液相色譜(CH3CN∶H2O=40%∶60%)純化,得到化合物2(10.6 mg)、3(6.5 mg)和4(4.0 mg)。Fr.4-5經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→1∶1)梯度洗脫,得到5個(gè)餾分(Fr.4-5-1～Fr.4-5-5)。Fr.4-5-1經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚-丙酮(10∶1→1∶1)進(jìn)行分離,得到化合物8(3.5 mg)和9(2.0 mg)。

2.2 單體化合物對白血病細(xì)胞的體外抑制作用

采用MTT法測試化合物1-10對白血病細(xì)胞(K562和HEL)的體外抑制作用。取對數(shù)生長期的K562和HEL細(xì)胞,在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)后,按每孔8×104個(gè)鋪于96孔板中4～6 h,待細(xì)胞穩(wěn)定后,分別加入濃度為2.5、5、10、20 μmol·L-1的化合物,以DMSO為對照組,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后,加入10 μL的MTT(5 mg·mL-1)溶液,繼續(xù)孵育4 h后加入三聯(lián)液(三聯(lián)液500 mL含SDS 50 g、異丁醇25 mL和濃鹽酸0.5 mL)培養(yǎng)過夜,運(yùn)用多功能酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度,計(jì)算細(xì)胞活力和半數(shù)抑制濃度IC50。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1-11具體結(jié)構(gòu)見圖1。

圖 1 化合物1-11的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of compounds 1-11

化合物1白色粉末, [α]D20-50.7 (c0.1, MeOH);UV (MeOH)λmax:195 nm;IR (KBr)νmax3 423,1 753,1 717,1 643 cm-1。根據(jù)高分辨質(zhì)譜HRESIMS中準(zhǔn)分子離子峰m/z433.183 0 [M+Na]+(計(jì)算值:C21H30O8Na,計(jì)算分子量為433.183 3),提示化合物的分子式為C21H30O8,計(jì)算其不飽和度為7。從1H NMR譜可以觀察到化合物有4個(gè)甲基氫信號δH3.38 (3H, s, H-16),1.99 (3H, m, H-4′)、1.84 (3H, m, H-5′)、1.01 (3H, d,J= 6.0 Hz, H-14),其中有1個(gè)連氧甲基氫信號;2組烯烴質(zhì)子信號δH6.15 (1H, q,J= 7.5 Hz, H-3′)、5.39 (1H, s, H-15α)、5.30 (1H, s, H-15β)。在13C NMR譜中觀察到化合物有21個(gè)碳信號,結(jié)合DEPT譜可知包括4個(gè)甲基碳信號δC59.3 (C-16)、16.0 (C-4′)、18.9 (C-14)、20.5 (C-5′),其中有1個(gè)連氧甲基碳信號;2組雙鍵碳信號δC141.8 (C-4)、141.4 (C-3′)、126.1 (C-2′)、123.4 (C-15);2個(gè)羰基碳信號δC176.5 (C-12)、166.1 (C-1′)。

綜合1D、2D NMR數(shù)據(jù)對化合物的碳?xì)湫盘栠M(jìn)行了全歸屬,其詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。從1H-1H COSY譜中,可以觀察到化合物結(jié)構(gòu)中存在4個(gè)結(jié)構(gòu)片段,分別為H-14 / H-10 / H-1 / H-2 / H-3、H-5 / H-6 / H-7 / H-8、H-7 / H-11 / H-13和H-3′ / H-4′,見圖2。在HMBC譜中,H-14 (δH1.01)與C-1 (δC45.6)、C-9 (δC106.9)、C-10 (δC34.7)的相關(guān)信號提示Me-14與C-10位相連;H-2 (δH4.20)與C-9 (δC106.9)有相關(guān),H-13α(δH3.81)與C-16 (δC59.3)有相關(guān),并結(jié)合HRESIMS數(shù)據(jù),提示C-2與C-9、C-13與C-16通過氧橋相連;H-3α(δH2.40)與C-4 (δC141.8)、C-5 (δC80.6)、C-15 (δC123.4)有相關(guān),H-5 (δH4.22)與C-4 (δC141.8)、C-15 (δC123.4)有相關(guān),提示環(huán)外雙鍵位于C-4位;H-6 (δH5.05)與C-7 (δC37.5)、C-12 (δC176.5)的相關(guān)信號提示五元γ-內(nèi)酯環(huán)與十元碳環(huán)相連;H-4′ (δH1.99)與C-2′ (δC126.1)、C-3′ (δC141.4)有相關(guān),H-5′ (δH1.84)與C-1′ (δC166.1)、C-2′ (δC126.1)、C-3′ (δC141.4)有相關(guān),H-8 (δH5.34)與C-1′ (δC166.1)有相關(guān),提示存在一個(gè)當(dāng)歸酰基并連接在C-8位。以上數(shù)據(jù)與化合物carpescernolide C的數(shù)據(jù)(Yan et al., 2021)相似,提示兩個(gè)化合物具有相似的骨架結(jié)構(gòu),進(jìn)一步證實(shí)該化合物為吉瑪烷型倍半萜內(nèi)酯。ROESY譜確定了化合物的相對構(gòu)型。從ROESY譜中,可以看到H-15α與H-5、H-5與H-7、H-3β與H-6、H-6與H-8、H-8與H-11、H-2與H-14有相關(guān),因此確定H-2、H-6、H-8、H-11、H-14為β構(gòu)型,H-5、H-7為α構(gòu)型。此外,該化合物的實(shí)驗(yàn)ECD與計(jì)算ECD圖譜經(jīng)過比對,確定了化合物的絕對構(gòu)型,見圖3。因此,確定化合物1為2, 9-epoxy-5, 9-dihydroxy-8-angeloyloxy-11-methoxymethyl-4(15)-germacraen-6, 12-olide。

表 1 化合物1的1H (500 MHz) 和13C (125 MHz) NMR數(shù)據(jù)Table 1 1H (500 MHz) and 13C (125 MHz) NMR data of Compound 1 (in CDCl3)

化合物2白色粉末,分子式C23H34O9。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.48 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-13β), 5.67 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-13α), 5.05 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-9), 4.72 (1H, s, H-6), 4.34 (1H, s, H-8), 3.79 (1H, m, H-2), 3.02 (1H, m, H-7), 2.70 (1H, m, H-2′), 2.70 (1H, s, H-2″), 2.26 (2H, m, H-1), 1.96 (1H, d,J= 6.4 Hz, H-4), 1.85 (2H, m, H-3), 1.32 (3H, s, H-14), 1.26 (3H, d,J= 5.8 Hz, H-3′), 1.26 (3H, d,J= 5.8 Hz, H-3″), 1.26 (3H, d,J= 5.8 Hz, H-4′), 1.26 (3H, d,J= 5.8 Hz, H-4″), 1.02 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-15);13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 214.7 (C-5), 178.1 (C-1′), 178.1 (C-1″), 168.2 (C-12), 132.6 (C-11), 124.6 (C-13), 81.2 (C-10), 79.0 (C-8), 78.6 (C-6), 78.5 (C-9), 71.8 (C-2), 42.1 (C-7), 34.3 (C-2′), 34.1 (C-2″), 33.9 (C-1), 29.6 (C-4), 25.6 (C-3), 25.3 (C-14), 20.8 (C-15), 19.3 (C-3″), 19.0 (C-3′), 18.9 (C-4′), 18.9 (C-4″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Kim et al., 1997)報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物2為cardivin D。

化合物3白色粉末,分子式C23H34O8。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.46 (1H, d,J= 1.2 Hz, H-13β), 5.89 (1H, d,J= 0.8 Hz, H-13α), 5.26 (1H, d,J= 1.2 Hz, H-8), 4.76 (1H, dd,J= 4.4, 1.2 Hz, H-6), 4.60 (1H, d,J= 4.4 Hz, H-5), 3.81 (1H, m, H-7), 2.83 (1H, m, H-10), 2.67 (1H, m, H-2″), 2.64 (1H, m, H-2′), 1.80 (1H, m, H-1β), 1.79 (1H, m, H-2β), 1.70 (1H, m, H-1α), 1.58 (1H, m, H-3α), 1.35 (1H, m, H-3β), 1.21 (3H, m, H-3′), 1.21 (3H, m, H-3″), 1.21 (3H, m, H-4′), 1.21 (3H, m, H- 4″), 1.18 (3H, d,J= 6.4 Hz, H-14), 1.15 (3H, s, H-15), 1.04 (1H, m, H-2α);13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 208.5 (C-9), 177.0 (C-1″), 175.9 (C-1′), 168.6 (C-12), 135.0 (C-11), 124.1 (C-13), 80.8 (C-8), 77.6 (C-5), 73.1 (C-4), 71.4 (C-6), 44.2 (C-7), 43.7 (C-10), 34.8 (C-3), 33.9 (C-2″), 33.7 (C-2′), 32.9 (C-1), 24.6 (C-15), 23.1 (C-2), 20.0 (C-14), 18.8 (C-3″), 18.8 (C-4″), 18.7 (C-4′), 18.6 (C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Dang et al., 2019)報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物3為cernuumolide I。

化合物4白色粉末,分子式C24H34O8。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.45 (1H, d,J= 1.2 Hz, H-13α), 6.14 (1H, m, H-3′), 5.89 (1H, d,J= 1.2 Hz, H-13β), 5.33 (1H, d,J= 1.2 Hz, H-8), 4.75 (1H, dd,J= 4.4, 1.2 Hz, H-6), 4.59 (1H, d,J= 4.4 Hz, H-5), 3.81 (1H, m, H-7), 2.84 (1H, m, H-10), 2.67 (1H, m, H-2″), 1.95 (3H, dd,J= 4.8, 1.2 Hz, H-4′), 1.87 (3H, m, H-14), 1.80 (1H, m, H-2β), 1.70 (2H, m, H-1), 1.57 (1H, m, H-3α), 1.36 (1H, m, H-3β), 1.25 (1H, s, H-2α), 1.23 (3H, d,J= 4.8 Hz, H-4″), 1.21 (3H, s, H-3″), 1.20 (3H, s, H-15), 1.14 (3H, s, H-5′);13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 208.5 (C-9), 177.0 (C-1″), 168.7 (C-12), 166.3 (C-1′), 140.7 (C-3′), 135.0 (C-11), 126.6 (C-2′), 124.2 (C-13), 81.2 (C-8), 77.7 (C-5), 73.1 (C-4), 71.5 (C-6), 44.2 (C-7), 43.8 (C-10), 34.8 (C-3), 33.9 (C-2″), 32.8 (C-1), 24.6 (C-15), 23.1 (C-2), 20.3 (C-14), 20.0 (C-5′), 18.9 (C-4″), 18.8 (C-3″), 15.8 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Dang et al., 2019)報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物4為cernuumolide J。

化合物5黃色油狀物,分子式C18H26O6。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.89 (1H, d,J= 5.6 Hz, H-5), 6.68 (1H, s, H-2), 6.63 (1H, d,J= 5.6 Hz, H-6), 4.47 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-9α), 4.47 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-10α), 4.27 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-9β), 4.27 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-10β), 2.55 (1H, m, H-2′), 2.55 (1H, m, H-2″), 2.25 (3H, s, H3-7), 1.12 (3H, s, H-3′), 1.12 (3H, s, H-3″), 1.10 (3H, s, H-4′), 1.10 (3H, s, H-4″);13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 177.4 (C-1′), 177.4 (C-1″), 156.4 (C-3), 140.0 (C-1), 126.5 (C-5), 120.4 (C-6), 119.0 (C-4), 118.4 (C-2), 78.4 (C-8), 67.1 (C-9), 67.1 (C-10), 33.9 (C-2′), 33.9 (C-2″), 20.9 (C-7), 18.8 (C-3′), 18.8 (C-4′), 18.8 (C-3″), 18.8 (C-4″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(劉金龍等,2020;陳晨等,2021)報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物5為8-hydroxy-9, 10-diisobutyryloxythymol。

化合物6黃色油狀物,分子式C22H36O4。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 5.42 (1H, t,J= 8.0 Hz, H-2), 5.40 (1H, t,J= 8.0 Hz, H-6), 5.38 (1H, t,J= 8.0 Hz, H-10), 5.08 (1H, t,J= 8.0 Hz, H-14), 4.59 (2H, s, H-19), 4.14 (2H, d,J= 8.0 Hz, H-1), 3.97 (1H, t,J= 8.0 Hz, H-12), 2.22 (2H, s, H-5), 2.20 (2H, s, H-13), 2.13 (2H, s, H-9), 2.09 (2H, s, H-4), 2.08 (3H, s, H-AcO), 2.07 (2H, s, H-8), 1.72 (3H, s, H-16), 1.64 (3H, s, H-17), 1.63 (3H, s, H-20), 1.62 (3H, s, H-18);13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 171.2 (COO-AcO), 137.3 (C-11), 137.2 (C-3), 134.7 (C-15), 133.6 (C-7), 130.4 (C-6), 125.3 (C-10), 124.0 (C-2), 120.1 (C-14), 77.0 (C-12), 61.9 (C-19), 59.3 (C-1), 39.3 (C-4), 34.7 (C-13), 34.5 (C-8), 26.1 (C-5), 25.9 (C-9), 25.8 (C-16), 20.0 (CH3-AcO), 18.0 (C-17), 16.2 (C-20), 11.8 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Gao et al., 2008)報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物6為(2E, 6Z, 10E, 12R)-7- [(acetyloxy)methyl]-3, 11, 15-trimethylhexadeca-2, 6, 10, 14-tetraene-1, 12-diol。

圖 2 化合物1中的主要HMBC、1H-1H COSY和ROESY相關(guān)信號Fig. 2 Key HMBC, 1H-1H COSY and ROESY correlation signals of Compound 1

圖 3 化合物1實(shí)驗(yàn)ECD與計(jì)算ECD圖譜的比較Fig. 3 Comparison of the experimental ECD and calculated ECD spectra of Compound 1

化合物7白色粉末,分子式C19H38O4。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 3.67 (3H, s, OCH3), 3.40 (1H, m, OH), 2.30 (2H, t,J= 5.2 Hz, H-2), 1.62 (2H, s, H-3), 0.88 (3H, t,J= 4.4 Hz, H-18);13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 174.3 (C-1), 74.5 (C-9), 74.4 (C-10), 51.4 (OCH3), 34.1 (C-11), 33.7 (C-8), 33.6 (C-2), 31.8 (C-16), 29.6 (C-15), 29.5 (C-14), 29.4 (C-13), 29.3 (C-6), 29.1 (C-5), 29.0 (C-4), 25.7 (C-12), 25.5 (C-7), 24.9 (C-3), 22.6 (C-17), 14.1 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Dailey et al., 2009; Wu et al., 2019)報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物7為9, 10-dihydroxyoctadecanoate。

化合物8橙黃色粉末,分子式C15H10O5。1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 7.96 (1H, s, H-7), 7.87 (1H, m, H-2), 7.87 (1H, m, H-4) 7.82 (1H, m, H-5), 7.40 (1H, m, H-3), 4.78 (2H, s, HOCH2);13C NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 194.1 (C-9), 183.1 (C-10), 164.0 (C-1), 163.4 (C-6), 152.8 (C-8a), 138.3 (C-5a), 135.1 (C-3), 134.9 (C-4a), 125.5 (C-2), 122.2 (C-7), 120.7 (C-8), 118.6 (C-4), 117.2 (C-1a), 113.2 (C-5), 64.1 (HOCH2-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Cui et al., 2008)報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物8為1, 6-dihydroxy-8-hydroxymethyl-anthraquinone。

化合物9白色粉末,分子式C15H10O5。1H NMR (500 MHz, DMSO)δ: 12.08 (1H, s, OH-1), 12.01 (1H, s, OH-8), 7.48 (1H, s, H-5), 7.16 (1H, s, H-7), 7.11 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-4), 6.59 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-2), 2.41(3H, s, -CH3);13C NMR (125 MHz,DMSO)δ: 190.7 (C-9), 182.3 (C-10), 166.5 (C-3), 165.4 (C-1), 162.3 (C-8), 149.2 (C-6), 136.0 (C-14), 133.8 (C-11), 125.1 (C-7), 121.4 (C-5), 114.3 (C-12), 110.0 (C-13), 109.7 (C-4), 108.9 (C-2), 22.4 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Knut et al., 1992)報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物9為emodin。

化合物10黃色油狀物,分子式C13H20O2。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 5.85 (1H, s, H-4), 2.54 (1H, m, H-8α), 2.53 (1H, m, H-8β), 2.37 (1H, d,J= 11.6 Hz, H-2α), 2.16 (3H, s, H-10), 2.04 (1H, d,J= 11.6 Hz, H-2β), 1.99 (3H, s, H-13), 1.98 (1H, m, H-7α), 1.89 (1H, t,J= 3.6 Hz, H-6), 1.71 (1H, m, H-7β), 1.06 (3H, s, H-12), 1.02 (3H, s, H-11);13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 207.2 (C-9), 198.8 (C-3), 164.5 (C-5), 125.6 (C-4), 50.1 (C-6), 47.0 (C-2), 42.6 (C-1), 36.3 (C-8), 30.1 (C-10), 28.8 (C-11), 27.3 (C-12), 24.6 (C-7), 23.5 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Xiao et al., 2016)報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物10為4-megastigmen-3, 9-dione。

化合物11白色片狀結(jié)晶(甲醇),mp. 135～137 ℃,分子式C29H50O。在石油醚-丙酮、石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇三種溶劑系統(tǒng)中分別進(jìn)行TLC薄層色譜檢測,經(jīng)紫外分析儀254 nm下觀察TLC薄層板無熒光現(xiàn)象,10%硫酸乙醇溶液顯紫紅色,同時(shí)該化合物的Rf值與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品一致,故鑒定化合物11為β-谷甾醇。

3.2 活性測試結(jié)果

由圖4可知,K562和HEL細(xì)胞經(jīng)不同濃度的化合物處理72 h后,其細(xì)胞活力被顯著抑制(P<0.05)。隨著化合物濃度的增加,細(xì)胞受抑制的程度越明顯。與DMSO組相比,化合物1-10在20 μmol·L-1時(shí)對K562和HEL細(xì)胞均有一定的抑制作用,其中化合物2-4對兩種細(xì)胞的抑制作用最為顯著(P<0.01)。

與DMSO組相比,*表示有顯著性(P<0.05),**表示有極顯著性(P<0.01)。Compared with DMSO group, *means significant differences (P<0.05), ** means extremely significant differences (P<0.01).圖 4 化合物1-10對白血病細(xì)胞活力的影響Fig. 4 Effects of compounds 1-10 on viabilities of leukemia cells

由表2可知,化合物cardivin D(2)、cernuumolide I(3)和cernuumolide J(4)對K562和HEL細(xì)胞具有較好的抑制作用,其中相對較強(qiáng)的為化合物2,IC50分別為(2.27±0.46) μmol·L-1和(1.84±0.14) μmol·L-1。

表 2 化合物1-10的IC50值Table 2 IC50 values of compounds 1-10

4 討論與結(jié)論

本研究通過植物化學(xué)手段對煙管頭草全草進(jìn)行化學(xué)成分研究,得到了11個(gè)化合物,包括5個(gè)倍半萜類、1個(gè)二萜類、2個(gè)蒽醌類、1個(gè)甾醇、1個(gè)芳香族類和1個(gè)烷烴類。其中,化合物1為新的吉瑪烷型倍半萜類化合物。部分化合物抗白血病活性結(jié)果表明,化合物cardivin D(2)、cernuumolide I(3)和cernuumolide J(4)對K562和HEL細(xì)胞具有較好的抑制作用,IC50值在1.84～5.53 μmol·L-1之間,特別是對白血病HEL細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于陽性對照伊馬替尼,具有作為抗白血病前體藥物的潛力,這為研發(fā)新型高效的抗白血病藥物提供了思路和方向。如何高效、大量富集上述活性化合物是目前亟須解決的問題之一,有待深入研究。未來可進(jìn)一步對活性化合物2-4進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、體內(nèi)抗白血病活性及作用機(jī)制研究,探索其信號通路及作用靶點(diǎn),為煙管頭草應(yīng)用于抗白血病治療提供現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)。結(jié)合文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),化合物cernuumolide I(3)和cernuumolide J(4)對宮頸癌HeLa、肝癌Hep G2、肺癌A549、結(jié)腸癌HCT116等腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用,IC50值在0.87～42.73 μmol·L-1之間(Liu et al., 2016;Zhang et al., 2019),為煙管頭草中吉瑪烷型倍半萜類成分具有抗腫瘤的普適作用提供了科學(xué)依據(jù)。因此,深入探討貴州民族藥煙管頭草的化學(xué)成分,既豐富了其化學(xué)多樣性,又在一定程度上為抗腫瘤藥物的研究提供了化合物來源,也為煙管頭草的綜合開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。