多花黃精種子萌發(fā)前后基因表達(dá)特征分析

劉保財(cái), 陳菁瑛*, 張武君, 劉劍超, 黃穎楨, 趙云青, 劉紅躍

( 1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福州 350003; 2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究中心, 福州 350003; 3. 福建省南平市邵武市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 福建 邵武 354000; 4. 福建省南平市邵武市林業(yè)局, 福建 邵武 354000 )

多花黃精(Polygonatumcyrtonema)屬于黃精屬多年生草本植物(Chen et al., 2000),為習(xí)用的藥食兩用物種(Li et al., 2022; Wu et al., 2022),具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎的功效,用于治療脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足、口干食少、肺虛燥咳等疾病(國(guó)家藥典委員會(huì), 2020)?，F(xiàn)代藥理研究表明,多花黃精含有多糖、生物堿、黃酮等生化成分,具有降血糖、抗疲勞、抗炎、抗菌和調(diào)節(jié)免疫等作用(Li et al., 2018, 2020; Gan et al., 2022)。隨著人們對(duì)多花黃精的認(rèn)知加深,其倍受青睞,栽培面積逐步擴(kuò)大(黃申等, 2020)。多花黃精等藥用植物的種子存在后熟的生理現(xiàn)象,收獲后需要沙藏貯存,常規(guī)曬干后迅速降低種子的發(fā)芽率(劉保財(cái)?shù)? 2015; 安瑞朋等, 2020),而多花黃精種子苗的繁育對(duì)多花黃精的生產(chǎn)及其產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義(劉保財(cái)?shù)? 2017)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已成為種子萌發(fā)( Chen et al., 2022)、生物合成( Liu et al., 2022; Song et al., 2022)等關(guān)鍵基因發(fā)現(xiàn)的有效手段。基于轉(zhuǎn)錄組方法,對(duì)重樓種子休眠解除過(guò)程中差異基因的表達(dá)情況及相關(guān)代謝通路進(jìn)行研究,明確重樓種子的休眠與脫落酸、赤霉素、生長(zhǎng)素、油菜甾醇、細(xì)胞分裂素、乙烯、茉莉酸和水楊酸相關(guān)(Song et al., 2022);粗莖秦艽種子萌發(fā)前、萌發(fā)中及萌發(fā)后3個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明,光照條件和激素水平為粗莖秦艽種子萌發(fā)過(guò)程的重要調(diào)控因子(楊曉等, 2021);雞骨草種子具有極低的發(fā)芽率,通過(guò)赤霉素處理,編碼CYP78A5、Bg7s、GA-20-ox、rd22、MYB4、LEA、CHS等蛋白的基因發(fā)生了上調(diào)(Shimizu et al., 2022);同屬黃精種子的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究揭示了變溫可打破種子上胚軸的休眠機(jī)制,明確植物激素、染色體修飾、DNA甲基化、mRNA降解、胚乳弱化和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因協(xié)同控制著黃精種子萌發(fā)、上胚軸休眠和幼苗形成(Liao et al., 2021)。在黃精種子發(fā)育與休眠解除過(guò)程中,與種胚形態(tài)建成、多糖分解及蛋白質(zhì)合成等相關(guān)的差異基因表達(dá)上調(diào)且涉及多個(gè)代謝途徑的相互作用,構(gòu)成復(fù)雜的休眠解除調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(羅麗娜和向增旭, 2021; Zhang et al., 2022)。然而,當(dāng)前關(guān)于多花黃精種子的萌發(fā)過(guò)程的基因研究報(bào)道較少,尤其是對(duì)種子萌發(fā)具有關(guān)鍵作用的特征性表達(dá)通路與基因尚不清楚,阻礙了多花黃精種子育苗、種子生理及其綜合開(kāi)發(fā)利用。本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,對(duì)多花黃精種子萌發(fā)過(guò)程中的4個(gè)階段開(kāi)展了測(cè)序,擬探討:(1)多花黃精種子萌發(fā)后,哪些通路為關(guān)鍵通路;(2)這些關(guān)鍵通路上哪些基因進(jìn)行了顯著變化。為打破多花黃精種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)及其生理生化等方面研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗(yàn)材料采集于福建省泰寧縣,經(jīng)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所陳菁瑛研究員鑒定為多花黃精(Polygonatumcyrtonema),種植于邵武市和平鎮(zhèn)和平村林下。2019年11月采集10株果皮發(fā)黑的成熟的果實(shí),經(jīng)8 d堆置發(fā)酵后,用手捏碎變軟的果實(shí),漂去果皮等雜質(zhì)并用水清洗,干凈的種子作為試驗(yàn)材料備用。

DP441-RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit,購(gòu)自Illumina, Inc.; TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)(AT341),PerfectStart?Green qPCR SuperMix (DyeⅡ),購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;無(wú)水乙醇,購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

NanoPhotometer(德國(guó)Implen公司);Agilent 2100 Bioanalyzer (安捷倫科技有限公司);5424R高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司);2100凝膠成像儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司);水平電泳裝置(北京市六一儀器廠);海爾MI-2270M (N)微波爐(青島海爾微波制品有限公司);微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(NanoDrop One)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司];AE124/JY10002型電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);ABI QuantStudio 3熒光定量PCR儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]。

1.3 材料處理

將洗干凈的種子用無(wú)菌水沖洗10遍,立即取約3 g種子,放入液氮中凍存10 min,然后移入-80 ℃冰箱中保存,直到RNA提取(圖1: A)。剩下的種子用于沙藏,沙藏所需的河沙需經(jīng)過(guò)121 ℃滅菌30 min,并用少量的無(wú)菌水保持河沙濕潤(rùn),沙藏期間每周定期檢查并用無(wú)菌水補(bǔ)充水分。沙藏150 d后,挑選胚剛突破種皮的種子(圖1: B)和初步形成的第一個(gè)微根狀莖的種子(圖1: C),種植20 d后,挑選變綠的微根狀莖的種子(圖1: D),以上萌發(fā)階段各取樣約3 g,用清水沖洗干凈,吸干表面的水分,立即放入液氮中凍存10 min,再移入-80 ℃冰箱中保存,用于RNA提取。上述取樣均3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 建庫(kù)測(cè)序

取上述沙藏前(A)、萌發(fā)后(B)、微根狀莖(C)、綠色微根狀莖(D)4個(gè)萌發(fā)階段的種子各約0.5 g,采用DP441-RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]分別提取各萌發(fā)階段的總RNA,3次生物學(xué)重復(fù)。NanoPhotometer:檢測(cè)RNA純度(OD 260/280及OD 260/230比值)和Agilent 2100 Bioanalyzer:檢測(cè)RNA完整性。進(jìn)一步使用試劑盒Illumina 的 NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit,參照說(shuō)明書(shū)構(gòu)建文庫(kù)。構(gòu)建文庫(kù)后,先使用Qubit 2.0 Fluorometer初步定量,再使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)文庫(kù)的insert size,符合預(yù)期后,用qRT-PCR對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。庫(kù)檢合格后,由北京諾禾致源科技股份有限公司應(yīng)用Illumina HiSeq 2500完成序列的測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 數(shù)據(jù)組裝及注釋 將獲得的 Raw reads 去除帶接頭、含N和低質(zhì)量 reads,獲得Clean data,并進(jìn)行 Q20、Q30和GC含量計(jì)算。當(dāng)前多花黃精尚無(wú)參考基因組序列,因此本研究采用denovo組裝方法,使用Trinity軟件對(duì)Clean data進(jìn)行拼接、組裝,進(jìn)一步通過(guò)Corset(Davidson &Oshlack, 2014)軟件,對(duì)轉(zhuǎn)錄本聚類(lèi)去冗余,最終每個(gè)cluster被定義為“Unigene”,用BUSCO (Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs) 對(duì)拼接得到的Trinity. fasta,unigene. fasta和cluster. fasta 進(jìn)行拼接質(zhì)量評(píng)估,作為后續(xù)分析的參考序列。使用NCBI blast對(duì)Unigene進(jìn)行Nt注釋,Diamond對(duì)Unigene進(jìn)行Nr、KOG/COG、Swiss-Prot注釋, HMMER對(duì)Unigene進(jìn)行Pfam注釋,KAAS對(duì)Unigene進(jìn)行KEGG注釋,Blast2 GO進(jìn)行GO注釋。

1.5.2 基因表達(dá)水平分析 采用RSEM軟件(Li &Dewey, 2011),調(diào)用Bowtie2對(duì)比并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),以Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列(Ref),將每個(gè)樣品的clean reads往Ref上做匹配,獲得單個(gè)樣品的匹配率,統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品中某基因比對(duì)到的reads數(shù)目,然后進(jìn)行FPKM (expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Mil-lions base pairs sequenced) 轉(zhuǎn)換,進(jìn)而得到單個(gè)樣品中基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。

1.5.3 差異基因表達(dá)分析 使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的模型確定數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)的DESeq R包(1.10.1)進(jìn)行兩個(gè)條件/組的差異表達(dá)分析,使用Benjamini和Hochberg的方法校正得到P值以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率,Padj<0.05的基因認(rèn)定為差異表達(dá)。基于 GOseq( Young et al., 2010)所述方法對(duì)篩選到的DEGs進(jìn)行GO富集分析?；贙EGG注釋結(jié)果,使用 KOBAS,進(jìn)行 KEGG Pathway富集分析(Mao et al., 2005)。

1.5.4 qRT-PCR驗(yàn)證 經(jīng)過(guò)差異表達(dá)基因分析后,在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,隨機(jī)選取6個(gè)差異基因,設(shè)計(jì)引物(表1),以沙藏前后的RNA 為模板,按照 TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)(AT341)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照 PerfectStart?Green qPCR SuperMix(+DyeⅡ)試劑盒說(shuō)明書(shū),以cDNA為模板,在ABI QuantStudio 3儀上完成 qRT-PCR。用2-ΔΔCt方法計(jì)算每個(gè)基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量(Livak &Schmittgen, 2001)。Actin為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和 de novo組裝

測(cè)序后,獲得的具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2,各樣本獲得了42 589 470以上的Raw reads,過(guò)濾后得到6.03 Gb以上的測(cè)序量,Q30≥93.04%,GC含量為46.98%～49.47%。由于尚無(wú)多花黃精的全基因組作為參考,因此采用denovo方法對(duì)序列進(jìn)行組裝,分別獲得了388 231 Transcripts (361 956 157 bp)和178 319 Unigenes (146 022 913 bp),Transcripts和Unigenes的最大長(zhǎng)度、N50長(zhǎng)度分別為15 875、15 875、1 294、1 059 bp。獲得的178 319個(gè)Unigenes在Nt、Nr、KOG/COG、Swiss-Prot、Pfam、KEGG、GO全部100%注釋,各數(shù)據(jù)注釋個(gè)數(shù)及比例見(jiàn)表3,7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共注釋了178 319個(gè)Unigenes。

2.2 萌發(fā)前后基因表達(dá)水平

以組裝后的序列為模板,將沙藏前A1、A2、A3和萌發(fā)后B1、B2、B3各樣本的Clean reads與之比對(duì),各樣本的匹配reads數(shù)目和匹配率見(jiàn)表4,沙藏前的匹配率為75.19%～75.67%,萌發(fā)后的匹配率為71.63%～74.23%。對(duì)各樣品表達(dá)的Unigenes數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并轉(zhuǎn)換為FPKM,然后根據(jù)FPKM大小劃分區(qū)間,各區(qū)間的表達(dá)量及所占比例見(jiàn)表5,萌發(fā)后的B1、B2和B3 FPKM>15的Unigenes數(shù)量均高于沙藏前的A1、A2和A3,說(shuō)明經(jīng)沙藏萌發(fā)后,高表達(dá)的基因數(shù)目得到了增加。

2.3 萌發(fā)前后基因表達(dá)差異分析

比較萌發(fā)前后的各樣品基因(圖2: A),共有顯著性差異的Unigenes 11 817個(gè),其中表達(dá)上調(diào)的有6 405個(gè),表達(dá)下調(diào)的有5 412個(gè)。進(jìn)一步將上調(diào)或下調(diào)差異基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中富集(圖2: B),無(wú)論是上調(diào)還是下調(diào)的差異基因,均主要富集在生物過(guò)程(biological process,BP)和分子功能(molecular function,MF)中,相對(duì)而言,細(xì)胞組成(cellular component,CC)富集的轉(zhuǎn)錄本較少。而在BP中差異表達(dá)基因主要參與代謝過(guò)程、單生物代謝過(guò)程等,如參與代謝過(guò)程的顯著差異表達(dá)基因中上調(diào)的有2 251個(gè),下調(diào)的有1 516個(gè),包括Cluster-40845.0、Cluster-11099.0等上調(diào)的基因和Cluster-68615.79372、Cluster-68615.87349等下調(diào)的基因。在MF中差異表達(dá)基因主要參與催化活性、氧化還原酶活性等, 如參與催化活性的顯著差異表達(dá)基因中上調(diào)的有1 815個(gè),下調(diào)的有1 327個(gè),包括Cluster-68615.88556、Cluster-68615.88402等上調(diào)的基因和Cluster-68615.29401、Cluster-68615.62361等下調(diào)的基因。在CC中差異表達(dá)基因主要參與核糖體、核糖核蛋白復(fù)合物生成等,如參與核糖體的顯著差異表達(dá)基因中上調(diào)的有222個(gè),下調(diào)的有95個(gè)。值得關(guān)注的是,在富集的這些GO Terms中,幾乎所有的上調(diào)差異基因數(shù)目都高于下調(diào)差異基因數(shù)目。

表 1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

表 2 測(cè)序reads質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 2 Quality statistics of sequencing reads

表 3 Unigenes注釋率Table 3 Unigenes annotation rate

表 4 各樣品reads 與組裝轉(zhuǎn)錄本比對(duì)Table 4 Mapped results of sample reads and assembly transcripts

為了明確差異表達(dá)基因相互協(xié)調(diào)及其生物學(xué)功能, 通過(guò)KEGG pathway顯著性富集確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,挑選富集最顯著的20個(gè)pathway進(jìn)行展示(圖3)。差異表達(dá)基因主要富集于核糖體、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷生物合成、脂肪酸生物合成和延伸、類(lèi)黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、花青素生物合成等通路中,顯著性差異表達(dá)的基因分別富集到核糖體通路中307個(gè)、淀粉和蔗糖代謝通路中124個(gè)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中104個(gè)、類(lèi)黃酮生物合成種37個(gè)、脂肪酸生物合成34個(gè)和延長(zhǎng)34個(gè),以及花青素生物合成中8個(gè)、黃酮和黃酮醇生物合成中5個(gè)。這些通路與種子萌發(fā)前后的生理變化和形態(tài)結(jié)構(gòu)的形成有著緊密的關(guān)系。

A1. 氧化還原過(guò)程; A2. 代謝過(guò)程; A3. 脂肪酸生物合成過(guò)程; A4. 碳水化合物代謝過(guò)程; A5. 脂肪酸代謝過(guò)程; A6. 脂質(zhì)代謝過(guò)程; A7. 細(xì)胞碳水化合物代謝過(guò)程; A8. 一元羧酸生物合成過(guò)程; A9. 脂質(zhì)生物合成過(guò)程; A10. 細(xì)胞多糖代謝過(guò)程; A11. 核糖體生成; A12. 單生物代謝過(guò)程; A13. 核糖核蛋白復(fù)合物生成; A14. 細(xì)胞葡聚糖代謝過(guò)程; A15. 葡聚糖代謝過(guò)程; A16. 細(xì)胞壁; A17. 外部封裝結(jié)構(gòu); A18. 核糖體; A19. 質(zhì)外體; A20. 脂肪酸合成酶復(fù)合物; A21. 核糖核蛋白復(fù)合物; A22. 脂質(zhì)顆粒; A23. 單層包圍的脂質(zhì)儲(chǔ)存體; A24. 催化活性; A25. 氧化還原酶活性; A26. 水解酶活性,作用于糖基鍵; A27. 水解酶活性,水解O-糖基化合物; A28. 四吡咯結(jié)合; A29. 血紅素結(jié)合; A30. 鐵離子結(jié)合; A31. 氧化還原酶活性,作用于配對(duì)供體,結(jié)合或減少分子氧; A32. 核糖體的結(jié)構(gòu)成分; A33. 轉(zhuǎn)移酶活性,轉(zhuǎn)移除氨基?；酝獾孽；?。A1. Oxidation-reduction process; A2. Metabolic process; A3. Fatty acid biosynthetic process; A4. Carbohydrate metabolic process; A5. Fatty acid metabolic process; A6. Lipid metabolic process; A7. Cellular carbohydrate metabolic process; A8. Monocarboxylic acid biosynthetic process; A9. Lipid biosynthetic process; A10. Cellular polysaccharide metabolic process; A11. Ribosome biogenesis; A12. Single-organism metabolic process; A13. Ribonucleoprotein complex biogenesis; A14. Cellular glucan metabolic process; A15. Glucan metabolic process; A16. Cell wall; A17. External encapsulating structure; A18. Ribosome; A19. Apoplast; A20. Fatty acid synthase complex; A21. Ribonucleoprotein complex; A22. Lipid particle; A23. Monolayer-surrounded lipid storage body; A24. Catalytic activity; A25. Oxidoreductase activity; A26. Hydrolase activity, acting on glycosyl bonds; A27. Hydrolase activity,hydrolyzing O-glycosyl compounds; A28. Tetrapyrrole binding; A29. Heme binding; A30. Iron ion binding; A31. Oxidoreductase activity, acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen; A32. Structuralconstituent of ribosome; A33. Transferase activity, transferring acyl groups other than amino-acyl groups.圖 2 萌發(fā)前(A)與萌發(fā)后(B)的基因表達(dá)差異Fig. 2 Different expression genes before (A) and after (B) germination

A. 芪類(lèi)、二芳基庚烷和姜醇生物合成; B. 淀粉與蔗糖的代謝; C. 鞘脂代謝; D. 核糖體; E. 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo); F. 苯丙烷類(lèi)生物合成; G. 苯丙氨酸代謝; H. 吞噬體; I. 戊糖和葡萄醛酸相互轉(zhuǎn)化; J. 亞油酸代謝; K. 檸檬烯和蒎烯降解; L. 谷胱甘肽代謝; M. 半乳糖代謝; N. 類(lèi)黃酮生物合成; O. 黃酮和黃酮醇的生物合成; P. 脂肪酸延長(zhǎng); Q. 脂肪酸合成; R. 氰基氨基酸代謝; S. 晝夜節(jié)律-植物; T. 花色素苷生物合成。A. Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis; B. Starch and sucrose metabolism; C. Sphingolipid metabolism; D. Ribosome; E. Plant hormone signal transduction; F. Phenylpropanoid biosynthesis; G. Phenylalanine metabolism; H. Phagosome; I. Pentose and glucuronate interconversions; J. Linoleic acid metabolism; K. Limonene and pinene degradation; L. Glutathione metabolism; M. Galactose metabolism; N. Flavonoid biosynthesis; O. Flavone and flavonol biosynthesis; P. Fatty acid elongation; Q. Fatty acid biosynthesis; R. Cyanoamino acid metabolism; S. Circadian rhythm-plant; T. Anthocyanin biosynthesis.圖 3 差異基因KEGG通路富集Fig. 3 KEGG pathway enrichment of differential genes

圖A: A. 芪類(lèi)、二芳基庚烷和姜醇生物合成; B. 甾體生物合成; C. 淀粉與蔗糖的代謝; D. 核糖體; E. 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo); F. 光合作用-天線蛋白; G. 光合作用; H. 苯丙烷類(lèi)生物合成; I. 吞噬體; J. 戊糖和葡萄醛酸相互轉(zhuǎn)化; K. 氧化磷酸化; L. 檸檬烯和蒎烯降解; M. 類(lèi)黃酮生物合成; N. 脂肪酸延長(zhǎng); O. DNA復(fù)制; P. 氰基氨基酸代謝; Q. 晝夜節(jié)律-植物; R. 光合生物中的碳固定; S. 生物素代謝; T. 花色素苷生物合成。圖B: A. 泛醌和其他萜類(lèi)-醌的生物合成; B. 酪氨酸代謝; C. 芪類(lèi)、二芳基庚烷和姜醇生物合成; D. 淀粉與蔗糖的代謝; E. 鞘脂代謝; F. 倍半萜和三萜生物合成; G. 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo); H. 苯丙烷類(lèi)生物合成; I. 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成; J. 苯丙氨酸代謝; K. 亞油酸代謝; L. 檸檬烯和蒎烯降解; M. 谷胱甘肽代謝; N. 半乳糖代謝; O. 類(lèi)黃酮生物合成; P. 黃酮和黃酮醇的生物合成; Q. 脂肪酸合成; R. 晝夜節(jié)律-植物; S. 類(lèi)胡蘿卜素合成; T. α-亞油酸代謝。Fig. A: A. Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis; B. Steroid biosynthesis; C. Starch and sucrose metabolism; D. Ribosome; E. Plant hormone signal transduction; F. Photosynthesis-antenna proteins; G. Photosynthesis; H. Phenylpropanoid biosynthesis; I. Phagosome; J. Pentose and glucuronate interconversions; K. Oxidative phosphorylation; L. Limonene and pinene degradation; M. Flavonoid biosynthesis; N. Fatty acid elongation; O. DNA replication; P. Cyanoamino acid metabolism; Q. Circadian rhythm plant; R. Carbon fixation in photosynthetic organisms; S. Biotin metabolism; T. Anthocyanin biosynthesis. Fig. B: A. Ubiquinone and other terpenoid quinone biosynthesis; B. Tyrosine metabolism; C. Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis; D. Starch and sucrose metabolism; E. Sphingolipid metabolism; F. Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis; G. Plant hormone signal transduction; H. Phenylpropanoid biosynthesis; I. Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis; J. Phenylalanine metabolism; K. Linoleic acid metabolism; L. Limonene and pinene degradation; M. Glutathione metabolism; N. Galactose metabolism; O. Flavonoid biosynthesis; P. Flavone and flavonol biosynthesis; Q. Fatty acid biosynthesis; R. Circadian rhythm plant; S. Carotenoid biosynthesis; T. Alpha Linolenic acid metabolism.圖 4 前20條差異基因KEGG通路富集Fig. 4 TOP 20 KEGG pathway enrichment of differential genes

表 5 各樣品表達(dá)水平FPKM區(qū)間數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 5 FPKM interval quantity statistics of sample expression levels

為了進(jìn)一步解析差異基因參與的通路變化,將上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別進(jìn)行KEGG pathway富集,分別展示挑選富集的前20條通路(上調(diào)圖4: A;下調(diào)圖4: B)。在上調(diào)的顯著性差異表達(dá)基因中,主要富集于核糖體(ribosome,231個(gè))、吞噬體(phagosome,74個(gè))、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism,76個(gè))、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction,56個(gè))、脂肪酸延伸(fatty acid elongation,24個(gè))等通路中,其中富集到核糖體、淀粉和蔗糖代謝、脂肪酸伸長(zhǎng)等通路中的差異表達(dá)基因數(shù)顯著富集;而下調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集在苯丙烷類(lèi)生物合成(phenylpropanoid biosynthesis,48個(gè))、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction,48個(gè))、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism,48個(gè))、類(lèi)黃酮生物合成(flavonoid biosynthesis,22個(gè))等通路中,并且植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝等通路的差異表達(dá)基因顯著富集?？梢?jiàn),參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝等通路中的差異表達(dá)基因,無(wú)論是上調(diào)還是下調(diào),均有較多的差異表達(dá)基因富集,這些基因可能與植物休眠、萌發(fā)等有著緊密的關(guān)系。

2.4 萌發(fā)前后激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路差異表達(dá)基因

基于上述分析,參與植物激素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在種子休眠與萌發(fā)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,為此將萌發(fā)前后顯著的差異基因進(jìn)一步匹配到植物激素信號(hào)通路中,差異富集及表達(dá)量見(jiàn)圖5,結(jié)果表明富集于生長(zhǎng)素通路中關(guān)鍵酶的Unigenes共有40個(gè)(27個(gè)上調(diào),3個(gè)下調(diào)),主要編碼的酶:生長(zhǎng)素內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)載體(auxin influx carrier,AUX1)、運(yùn)輸抑制響應(yīng)蛋白1(transport inhibitor response 1,TIR1)、生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白/吲哚-3-乙酸(auxin-responsive protein /indole-3-acetic acid,AUX/IAA)、生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(auxin response factor,ARF)、生長(zhǎng)素響應(yīng)酰胺合成酶(gretchen hagen 3,GH3)基因家族(auxin responsive GH3 gene family)、SAUR(small auxin up RNA)家族蛋白(SAUR family protein), 并且除SAUR之外,與萌發(fā)前相比,萌發(fā)后多數(shù)為上調(diào),即萌發(fā)后表達(dá)量得到提高。而在油菜素內(nèi)酯生物合成過(guò)程中,參與編碼關(guān)鍵酶的Unigenes僅有6個(gè),除編碼油菜素內(nèi)酯信號(hào)激酶(brassinosteroids-signaling kinase,BSK)的Unigenes外,編碼其他關(guān)鍵基因油菜素內(nèi)酯激酶受體抑制因子1(BRI1 kinase inhibitor 1,BRI1)、抗油菜素內(nèi)酯1/2(brassinosteroid resistant 1/2, BZR1/2)、木葡聚糖[木葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性(Xyloglucan:xyloglucosyl transferase TCH4, TCH4)]、細(xì)胞周期素D3 (Cyclin D3, CYCD3) 的Unigenes均上調(diào),即萌發(fā)后表達(dá)量得到提高。

圖 5 萌發(fā)前后參與編碼植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵酶Unigenes表達(dá)水平Fig. 5 Expression levels of Unigenes encoding enzymes involved in plant hormone signal transduction before and after germination

圖 6 萌發(fā)前后參與編碼淀粉和糖代謝關(guān)鍵酶Unigenes表達(dá)水平Fig. 6 Expression levels of Unigenes encoding enzymes involved in starch and sucrose metabolism before and after germination

2.5 萌發(fā)前后淀粉和糖代謝通路差異表達(dá)基因

前述結(jié)果表明,淀粉和糖代謝在萌發(fā)前后發(fā)生急劇的變化,將萌發(fā)后較萌發(fā)前的所有顯著差異基因匹配到淀粉和糖代謝(ko00500)通路中,獲得差異基因編碼的關(guān)鍵蛋白。由圖6可知,蔗糖磷酸合酶(EC 2.4.1.14: sucrose-phosphate synthase)、海藻糖6-磷酸合酶(EC 2.4.1.15: trehalose 6-phosphate synthase)、1,4-α-葡聚糖分支酶(EC 2.4.1.18: 1,4-alpha-glucan branching enzyme)、海藻糖 6-磷酸酶(EC 3.1.3.12: trehalose 6-phosphate phosphatase)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2: beta-amylase)、果糖激酶(EC 2.7.1.4: fructokinase)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(EC: 5.3.1.9: glucose-6-phosphate isomerase)等關(guān)鍵酶的Unigenes均下調(diào),相反地,糖原磷酸化酶(EC 2.4.1.1: glycogen phosphorylase)、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.25: 4-alpha-glucanotransferase)、葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.7.7.27: glucose-1-phosphate adenylyltransferase)、內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4: endoglucanase)、胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員(EC 3.1.4.1: ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member)等關(guān)鍵酶的Unigenes均上調(diào),而麥芽糖酶-葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.20: maltase-glucoamylase)、β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21: beta-glucosidase)等酶的Unigenes既有上調(diào)也有下調(diào)。編碼這些關(guān)鍵酶的Unigenes中上調(diào)的Unigenes與淀粉降解和種子萌發(fā)有關(guān),而下調(diào)的Unigenes則與種子的休眠、物質(zhì)的貯藏有關(guān)。

2.6 差異基因qRT-PCR分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組獲得的數(shù)據(jù),于植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,隨機(jī)選擇具有顯著差異表達(dá)的6個(gè)基因,采用qRT-PCR進(jìn)行分析,由圖7可知,各樣本的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的趨勢(shì)基本一致。

3 討論與結(jié)論

植物的種子萌發(fā)受自身激素和生理(He et al., 2022),以及環(huán)境中水分(Alquraan et al., 2022)、溫度(Yang et al., 2022)等因素影響。黃精種子因果實(shí)的成熟度、著生部位不同,種子的含水率、可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉種類(lèi)、粗脂肪、超氧化物歧化酶等生理生化成分存在差異,從而導(dǎo)致種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)不同(常暉等, 2022)。沙藏是打破種子休眠的常用方法之一,多花黃精種子經(jīng)過(guò)約150 d沙藏后,種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)得到顯著提高(劉保財(cái)?shù)? 2015)。

本研究對(duì)多花黃精種子經(jīng)沙藏萌發(fā)前后差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著性差異基因主要參與代謝過(guò)程、催化活性、單生物代謝過(guò)程、氧化還原酶活性、核糖體等。Li等(2022)對(duì)多花黃精不同生長(zhǎng)年限根莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,差異基因的GO富集分析也主要參與催化活性、代謝過(guò)程等,這與本研究結(jié)果基本一致,也與羅麗娜和向增旭(2021)報(bào)道的黃精種子休眠解除的差異基因GO富集結(jié)果基本一致。

KEGG pathway顯著性富集分析表明萌發(fā)后較萌發(fā)前的差異表達(dá)基因主要富集于核糖體、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝等通路中,上調(diào)的差異基因主要富集在核糖體(231個(gè))、吞噬體(74個(gè))、淀粉和蔗糖代謝(76個(gè))、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(56個(gè))等通路中;下調(diào)的差異基因主要富集在苯丙烷生物合成(48個(gè))、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(48個(gè))、淀粉和蔗糖代謝(48個(gè))等通路中,而富集到淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中的差異基因,無(wú)論是上調(diào)還是下調(diào),均有較多的差異表達(dá)基因參與,與前人報(bào)道結(jié)果基本一致(張紅瑞等, 2021)。因此,這兩條通路可作為種子萌發(fā)前后的特征性通路。KEGG pathway富集到植物激素通路的基因有354個(gè),萌發(fā)前后有顯著差異表達(dá)的基因有104個(gè),其中上調(diào)的有56個(gè)和下調(diào)的48個(gè),尤其是富集于生長(zhǎng)素通路中關(guān)鍵酶的基因有40個(gè)(27個(gè)上調(diào),3個(gè)下調(diào)),這與報(bào)道多花黃精種子萌發(fā)過(guò)程中IAA、ABA、GA3和TZR含量存在變化結(jié)果一致(陳怡等, 2020; 張武君等,2022),即種子沙藏過(guò)程中,許多基因參與了植物激素的代謝與轉(zhuǎn)導(dǎo),特別是編碼生長(zhǎng)素類(lèi)通路上關(guān)鍵酶的基因。值得引起關(guān)注的是油菜素內(nèi)酯在種子萌發(fā)過(guò)程中作用,雖然參與編碼關(guān)鍵酶的Unigenes僅有6個(gè),但萌發(fā)后,基本上都是表達(dá)上調(diào)。富集到淀粉和蔗糖的代謝通路的基因有397個(gè),萌發(fā)前后有顯著差異表達(dá)的基因有124個(gè),其中上調(diào)的有76個(gè),下調(diào)的有48個(gè),編碼蔗糖磷酸合酶、海藻糖6-磷酸合酶等基因表達(dá)量下調(diào),而編碼磷酸化酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶等基因的表達(dá)量上調(diào),這與報(bào)道的多花黃精種子中含有淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、可溶性糖等結(jié)果一致(王晶晶等, 2022),即種子在沙藏過(guò)程中,淀粉的種類(lèi)、糖的形態(tài)逐步由萌發(fā)前的貯藏形式變?yōu)樗庑问?增加這些物質(zhì)的水溶性,以滿足種子萌發(fā)的生理需要?？梢?jiàn),編碼植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝植物激素通路上的基因,可作為種子萌發(fā)前后的主要特征性基因。此外,有部分差異基因參與了脂肪酸延伸、脂肪酸生物合成途徑,這與報(bào)道的多花黃精種子內(nèi)分布脂肪油一致(祝明珠等, 2020)。而本研究中與光合相關(guān)通路的差異基因均出現(xiàn)下調(diào),與報(bào)道的光照對(duì)多花黃精種子萌發(fā)未有顯著影響結(jié)果基本一致(周新華等, 2016)。有8個(gè)差異顯著表達(dá)的基因參與了花青素通路,是否與多花黃精植株莖稈顏色有綠色和紫色有關(guān)(姜武等, 2021),有待進(jìn)一步研究。

A. 萌發(fā)前; B. 萌發(fā)后。A. Before germination; B. After germination.圖 7 萌發(fā)前后6個(gè)差異基因的qRT-PCR驗(yàn)證Fig. 7 Verification of six selected differentially expressed genes by qRT-PCR before and after germination

綜上所述,多花黃精種子經(jīng)沙藏萌發(fā)后發(fā)生了系列的生理與形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,本研究初步分析了種子萌發(fā)前后關(guān)鍵基因的變化,明確了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與淀粉和蔗糖代謝在多花黃精種子萌發(fā)前后起著關(guān)鍵作用,進(jìn)一步闡明了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與淀粉和蔗糖代謝通路的關(guān)鍵基因,可作為多花黃精種子的萌發(fā)特征,為多花黃精種子的生理、育苗等深入研究提供參考。