基于鐵死亡探討溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)機(jī)制

向軍軍，李麗琴，李建錚，莫雪妮，陳煒，胡躍強(qiáng)（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧 53003；. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530000）

缺血性腦卒中（Ischemic stroke，IS）是臨床中常見的腦卒中類型，是世界范圍內(nèi)致殘率和死亡率最高的疾病之一[1]。目前缺血性腦卒中的治療方法主要包括藥物溶栓或介入手術(shù)，可快速使血管恢復(fù)灌注[2]。然而缺血區(qū)域因恢復(fù)灌注所造成的腦缺血再灌注損傷（Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）可通過炎性反應(yīng)、鈣離子超載、自由基過度形成、興奮性氨基酸的毒性作用等誘發(fā)或加重對神經(jīng)元的損傷[3]。近年來發(fā)現(xiàn)鐵代謝介導(dǎo)的鐵穩(wěn)態(tài)失衡參與腦缺血再灌注損傷的病理生理學(xué)過程，并發(fā)現(xiàn)改善鐵代謝，維持細(xì)胞內(nèi)外鐵穩(wěn)態(tài)有望成為改善腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵干預(yù)途徑[4]。

鐵調(diào)節(jié)蛋白（iron regulatory proteins，IRP）/鐵反應(yīng)原件（iron responsive elements，IRE）是目前維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，IRE 是存在于目標(biāo)mRNA中的一個高度保守的核苷酸序列，與IRP結(jié)合形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；IRP包括IRP1 和IRP2 兩型，其中IRP1 是一種雙功能酶，已證實(shí)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體1（Transferrin receptor protein 1，TFR1）與膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Recombinant Ferroportin ，F(xiàn)PN）是IRE 的主要目標(biāo)基因[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵過載時，IRP1 終止與IRE 目標(biāo)基因（TFR1 及FPN）結(jié)合，增加細(xì)胞內(nèi)鐵的輸出而減少鐵攝取，維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)。

溫陽復(fù)元方是本課題組經(jīng)多年臨床實(shí)踐凝練而成的治療缺血性腦卒中的有效方劑，經(jīng)多中心臨床研究[7-8]發(fā)現(xiàn)該方可有效地促進(jìn)患者神經(jīng)肢體功能康復(fù)。動物實(shí)驗研究[9]發(fā)現(xiàn)該方改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損的機(jī)制可能與上調(diào)人類貓白血病C亞類病毒受體（Feline leukemia virus subgroup C receptor，F(xiàn)LVCR）和胸腺癌抵抗蛋白（Breast Cancer Resistance Protein，BCRP）的表達(dá)有關(guān)；而BCRP 與FLVCR 作為血紅素鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與鐵代謝關(guān)系密切[10]，因此，我們推測該方對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能與通過IRP1 調(diào)節(jié)腦鐵代謝，進(jìn)而抑制鐵死亡有關(guān)。

本研究擬從溫陽復(fù)元方改善腦鐵代謝角度，探索缺血性腦卒中的潛在治療靶點(diǎn)，以期為該方的臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物健康雄性SPF級SD大鼠72只，3月齡，體質(zhì)量（250±50）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號： 430727221102400862，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。動物飼養(yǎng)在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗中心，各組大鼠自由飲食、飲水，室溫、60%濕度的受控環(huán)境中，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號： DW20211204-196，實(shí)驗流程及動物處理遵循動物實(shí)驗管理條例。

1.2 藥物及試劑溫陽復(fù)元方由經(jīng)典方四逆湯化裁而來，方藥組成：白附片30 g（先煎1 h）、黃芪30 g、黨參30 g、石菖蒲20 g、淫羊藿15 g、田三七15 g、干姜10 g、炙甘草6 g。所有藥材均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購，由廣西仙茱中藥科技有限公司制備（批號：20190701），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳超副主任藥師鑒定為正品，符合2020 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)范。加入藥材總質(zhì)量7倍的蒸餾水浸泡藥材30 min，待藥材完全吸水后，白附片先煎1 h（大火煮開，文火煎1 h），后加入其他藥物武火煮開后，文火煮1 h，用無菌紗布濾過、收集藥液；繼續(xù)加約7 倍的水繼續(xù)煎煮40 min，濾過，將2次藥液混合，大火濃縮至含原生藥濃度1.0 g·mL-1的溶液，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩９辔竸┝坑嬎惴椒▍⒄账幚韺?shí)驗方法[11]，按人與大鼠體表面積換算系數(shù)，成人（70 kg）每日服用156 g 原生藥，則大鼠溫陽復(fù)元方的用藥劑量為18.0 g·kg-1。

MCAO 線栓，河南平頂山豫順生物科技有限公司，批號：2543；TRIzol ReagentRNA 試劑盒，美國Ambion 公司，批號：284909；Erastin 鐵死亡誘導(dǎo)劑，美國MedChemExpress 公司，批號：118342；Ferrostatin-1 鐵死亡抑制劑，美國Selleckchem 公司，批號：S7243；戊巴比妥鈉，美國Serve 公司，批號：201505；Western 一抗稀釋液、Western 二抗稀釋液、ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（特超敏），均購自中國Biosharp 公司，批號依次為：BL506A、BL536A、BL520A；2×S6Universal SYBR高效RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液、IRP1 抗體、TfR1 抗體、FPN 抗體、還原型谷胱甘肽（GSH）含量檢測試劑盒、鐵含量檢測試劑盒、anti-GAPDH Rabbit polyclone、二甲基亞砜（DMSO），均購自中國Solarbio 公司，批號依次為：F3525、K111307P、DF1356、AF5343、BC1175、B26465、BL006B、DB371。

1.3 儀器DP73 顯微鏡，日本Olympus 公司；LightCycler 96 Instrument PCR 儀，瑞士Roche 公司；ChemiScope 6000 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；MDF-382E型超低溫保存箱，日本三洋公司；BV-2 型電泳儀、BT-2 型轉(zhuǎn)膜儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；H-600型透射電鏡，日本日立公司；M200PRO型多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司。

1.4 分組、模型復(fù)制及給藥72 只SD 雄性大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、溫陽復(fù)元方組、鐵死亡誘導(dǎo)劑組、溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組、鐵死亡抑制劑組，每組12只。

術(shù)前禁食不禁水12 h，采用線栓法制備大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）大鼠模型[12]：以40 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿頸前正中線切口，逐層分離且充分暴露頸動脈，小心分離迷走神經(jīng)與頸總動脈以及頸外、頸內(nèi)動脈，并結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，線栓經(jīng)頸內(nèi)動脈插入至大腦中動脈（深度約17～18 mm），形成大鼠右側(cè)腦缺血。所有手術(shù)均為右側(cè)大腦中動脈栓塞。假手術(shù)組手術(shù)步驟同模型組，但線栓只插入頸內(nèi)動脈深度9 mm，不堵塞大腦中動脈。參照Longa 等[13]的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，評分1～3 分表明造模成功，不符合者進(jìn)行剔除。

鐵死亡誘導(dǎo)劑和鐵死亡抑制劑用10%二甲基亞砜（DMSO）按要求配置，于造模前24 h開始按分組分別以100、5 mg·kg-1腹腔注射；溫陽復(fù)元方組于清醒后2 h 開始灌胃18.0 g·kg-1；模型組、假手術(shù)組灌胃等體積蒸餾水，自由飲食飲水。各干預(yù)措施均為每天1次，連續(xù)7 d。

1.5 標(biāo)本采集與處理造模后第7天，神經(jīng)功能缺損評分后，隨機(jī)取6 只大鼠采用戊巴比妥（30 mg·kg-1）腹腔麻醉后解剖開大鼠胸腔暴露心臟，剪開右心耳，將注射器針頭經(jīng)心尖插入至主動脈端并固定好，用100 mL 生理鹽水通過注射器快速注入，待心臟無血色液體流出，前爪、肺部顏色變成白色后，開顱取腦，切取右側(cè)缺血周邊組織進(jìn)行取材；隨機(jī)取其中3 只的組織置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色等其他指標(biāo)檢測；將另外3只缺血區(qū)域皮質(zhì)部位組織切成1 mm3的組織塊，投入預(yù)冷的電鏡固定液中，于4 ℃冰箱保存。剩余6只麻醉后，冰上操作快速取右側(cè)缺血區(qū)域組織并迅速投入液氮中冷凍，然后存放于-80 ℃冰箱保存，用于RT-qPCR 及Western Blot等分子檢測。

1.6 大鼠神經(jīng)功能缺失的Longa 評分法大鼠神經(jīng)功能缺損評分參照Longa 等[13]的評分標(biāo)準(zhǔn)：0 分為無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動正常者；1分為提尾時左側(cè)前肢不能完全伸展；2 分為行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈（追尾現(xiàn)象）；3分為行走時向左側(cè)傾斜；4分為不能自主行走，意識喪失。

1.7 腦組織蘇木素-伊紅染色取腦組織樣本，經(jīng)常規(guī)脫水透明、浸蠟、石蠟包埋后，進(jìn)行組織蠟塊切片，切片厚度約3～5 μm。脫蠟脫水處理后，進(jìn)行蘇木素及伊紅染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織神經(jīng)元分布、形態(tài)學(xué)等病理改變并拍照保存。

1.8 生化法檢測腦組織Fe2+和GSH 含量取腦組織樣本，各組分別稱取0.1 g 腦組織，加入0.9 mL 的勻漿介質(zhì)，冰水浴中剪碎、研磨，制成10%的勻漿液；以2 500 r·min-1離心15 min（離心半徑8 cm），吸取上清液。按照GSH 試劑盒及鐵含量檢測試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)操作，計算組織中Fe2+和GSH的含量。

1.9 RT-qPCR 法檢測缺血區(qū)域腦組織中TFR1、IRP1、FPN mRNA 的表達(dá)水平提取腦組織總mRNA 后，添加TRIzol 試劑以保持樣品中RNA 的完整性，測定總mRNA 的純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄制備互補(bǔ)DNA。將樣品加入96 孔板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。記錄在每個反應(yīng)管中達(dá)到設(shè)定閾值時熒光信號經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct 值）。通過2-ΔΔCt方法確定基因表達(dá)的差異，基因引物序列見表1，引物由北京擎科生物技術(shù)公司合成。

表1 qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences of qPCR

1.10 Western Blot 法檢測缺血區(qū)域腦組織中TFR1、IRP1 和FPN 蛋白的表達(dá)水平取腦組織樣本，經(jīng)常規(guī)蛋白提取、配膠與電泳、轉(zhuǎn)膜，再加入一抗4 ℃下孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次5 min；然后加入二抗在室溫下孵育1 h 后，將PVDF 膜用TBST在脫色振蕩器上于室溫下洗滌3次，每次5 min；取出后加入顯影液，將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀掃描并保存結(jié)果圖像。經(jīng)ImageJ 軟件分析目的蛋白條帶灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白，計算出目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.11 透射電鏡觀察缺血區(qū)域腦組織中線粒體超微結(jié)構(gòu)變化將樣品用戊二醛中固定，經(jīng)過磷酸漂洗液漂洗，鋨酸固定，乙醇梯度脫水，包埋；然后經(jīng)恒溫烘箱內(nèi)聚合，半薄定位及超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色；最后，在透射電鏡下觀察并攝片。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，參數(shù)數(shù)值以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用One-Way ANOVA檢驗比較各組間的差異，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有制圖均應(yīng)用Graphpad 9.0軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 溫陽復(fù)元方對CIRI 大鼠神經(jīng)功能缺損的影響如表2 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在術(shù)后1、3、7 d時神經(jīng)功能缺損評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，溫陽復(fù)元方組及鐵死亡抑制劑組大鼠在術(shù)后1、3、7 d時神經(jīng)功能缺損評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且鐵死亡抑制劑組與溫陽復(fù)元方組比較，在各個觀察時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與溫陽復(fù)元方組比較，鐵死亡誘導(dǎo)劑組及溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠在各時間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而與模型組比，則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠再灌注不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分的影響（±s，分；n=12）Table 2 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on neurological function deficit scores at different time points of rats with cerebral ischemia reperfusion injury（CIRI）（±s，scores；n=12）

表2 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠再灌注不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分的影響（±s，分；n=12）Table 2 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on neurological function deficit scores at different time points of rats with cerebral ischemia reperfusion injury（CIRI）（±s，scores；n=12）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；與溫陽復(fù)元方組比較，#P＜0.05

術(shù)后7 d 0.00±0.00 1.87±0.50**0.62±0.54△1.82±0.83#1.69±0.71#0.56±0.52△組別假手術(shù)組模型組溫陽復(fù)元方組鐵死亡誘導(dǎo)劑組溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組鐵死亡抑制劑組術(shù)后1 d 0.00±0.00 2.08±0.62**1.02±0.54△2.16±0.75#2.09±0.78#1.00±0.50△術(shù)后3 d 0.00±0.00 2.00±0.18**1.00±0.50△2.09±0.78#1.78±0.67#0.89±0.33△

2.2 溫陽復(fù)元方對CIRI 大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響如圖1所示，假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列緊密整齊，細(xì)胞形態(tài)完整規(guī)則、胞核淡染大而圓；而模型組、鐵死亡誘導(dǎo)劑組以及溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞數(shù)目減少且水腫，細(xì)胞核淡染固縮，邊緣出現(xiàn)空泡，各組病理損傷程度相似。溫陽復(fù)元方組和鐵死亡抑制劑組神經(jīng)元細(xì)胞排列有序，細(xì)胞形態(tài)相對規(guī)則完整，核染色清晰，病理損傷明顯減輕。

圖1 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠缺血區(qū)域腦組織病理形態(tài)的影響（HE 染色，×400）Figure 1 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the pathological morphology ischemic brain tissue in rats with cerebral ischemia reperfusion injury（CIRI）（HE，×400）

2.3 溫陽復(fù)元方對CIRI 大鼠腦組織中Fe2+及GSH含量變化的影響如表3所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織Fe2+含量明顯升高、GSH 含量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，溫陽復(fù)元方組與鐵死亡抑制劑組大鼠腦組織Fe2+含量下降、GSH含量上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且鐵死亡抑制劑組與溫陽復(fù)元方組比較，F(xiàn)e2+及GSH含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與溫陽復(fù)元方組比較，鐵死亡誘導(dǎo)劑組及溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠腦組織Fe2+含量明顯升高、GSH 含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；而與模型組比，則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠腦組織中Fe2+及GSH 含量變化的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the contents of Fe2 +and GSH of brain tissue in rats with cerebral ischemia reperfusion injury（CIRI）（±s，n=6）

表3 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠腦組織中Fe2+及GSH 含量變化的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the contents of Fe2 +and GSH of brain tissue in rats with cerebral ischemia reperfusion injury（CIRI）（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；與溫陽復(fù)元方組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

GSH/（μg·g-1）104.50±11.66 52.83±13.17**92.00±15.20△52.83±7.15#57.54±10.79#83.83±13.21△組別假手術(shù)組模型組溫陽復(fù)元方組鐵死亡誘導(dǎo)劑組溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組鐵死亡抑制劑組Fe2+/（μg·g-1）10.33±1.70 18.23±3.02**11.82±2.57△17.79±3.58##17.25±2.70#11.15±2.15△

2.4 溫陽復(fù)元方對CIRI 大鼠TFR1、IRP1 和FPN mRNA 表達(dá)的影響如表4 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠IRP1、FPN mRNA 表達(dá)水平降低，TFR1 mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，溫陽復(fù)元方組及鐵死亡抑制劑組大鼠IRP1、FPN mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），而TFR1 mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05）；且鐵死亡抑制劑組與溫陽復(fù)元方組比較，各基因表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與溫陽復(fù)元方組比較，鐵死亡誘導(dǎo)劑組和溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠IRP1、FPN mRNA 表達(dá)水平降低、TFR1 mRNA 表達(dá)水平上升（P＜0.05）；而與模型組比，則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠腦組織TFR1、IRP1 和FPN mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 4 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the mRNA expressions of TFR1，IRP1 and FPN in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury（CIRI）（±s，n=6）

表4 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠腦組織TFR1、IRP1 和FPN mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 4 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the mRNA expressions of TFR1，IRP1 and FPN in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury（CIRI）（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；與溫陽復(fù)元方組比較，#P＜0.05

FPN 0.998±0.076 0.622±0.124**0.846±0.133△0.514±0.115#0.509±0.166#0.891±0.025△組別假手術(shù)組模型組溫陽復(fù)元方組鐵死亡誘導(dǎo)劑組溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組鐵死亡抑制劑組IRP1 1.295±0.165 0.846±0.181**1.439±0.335△0.898±0.191#0.893±0.128#1.203±0.135△TFR1 0.424±0.147 0.854±0.117**0.457±0.183△0.786±0.135#0.796±0.232#0.465±0.215△

2.5 溫陽復(fù)元方對CIRI 大鼠TFR1、IRP1 和FPN蛋白表達(dá)的影響如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠FPN、IRP1 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01），TFR1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。與模型組比較，溫陽復(fù)元方組及鐵死亡抑制劑組大鼠FPN、IRP1 mRNA升高（P＜0.05，P＜0.01），而TFR1 mRNA表達(dá)量下降（P＜0.01）；且鐵死亡抑制劑組與溫陽復(fù)元方組比較，各基因表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與溫陽復(fù)元方組比較，鐵死亡誘導(dǎo)劑組及溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠FPN、IRP1蛋白表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01），TFR1 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.01）；而與模型組比，則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠腦組織TFR1、IRP1 和FPN 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）Figure 2 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the protein expressions of TFR1，IRP1 and FPN in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury（CIRI）（±s，n=6）

2.6 透射電子顯微鏡觀察各組大鼠神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)變化如圖3所示，假手術(shù)組大鼠線粒體結(jié)構(gòu)正常且清晰、線粒體包膜完整、線粒體嵴清晰可見；模型組缺血區(qū)域神經(jīng)元線粒體數(shù)目減少且萎縮、線粒體嵴斷裂甚至溶解消失、膜密度增加；與模型組比較，溫陽復(fù)元方組和鐵死亡抑制劑組神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)相對清晰，線粒體包膜、線粒體嵴相對完整，線粒體嵴清晰；而與溫陽復(fù)元方組比較，鐵死亡誘導(dǎo)劑組和溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠神經(jīng)元線粒體形態(tài)學(xué)相似，表現(xiàn)為線粒體數(shù)目減少，線粒體膜密度增加甚至破裂，線粒體嵴斷裂溶解。

圖3 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠腦組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響（×6 000）Figure 3 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the ultrastructural changes of neurons in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury（CIRI）（×6 000）

3 討論

缺血性腦卒中屬于中醫(yī)學(xué)“腦卒中”“中風(fēng)”范疇，今人論中風(fēng)病機(jī)本質(zhì)均認(rèn)為其病機(jī)以“臟腑虛衰、正氣虧虛”為本，“痰、瘀、風(fēng)、火、痰、濕”為標(biāo)[14]。受《黃帝內(nèi)經(jīng)》及《傷寒論》重陽思想的影響，課題組經(jīng)多年理論與實(shí)踐凝練[15]認(rèn)為，中風(fēng)的本質(zhì)是腎虛無力潛陽，傷其本則腎陽虧損、溫煦無力，導(dǎo)致痰濁叢生、堵塞腦絡(luò)，進(jìn)一步提出“陽虛”是中風(fēng)病的發(fā)病之本，并貫穿于中風(fēng)病的始終；因此，提出治療需以溫陽培本為大法，治則為溫陽益氣、化痰通絡(luò)（即溫陽復(fù)元法），創(chuàng)立了溫陽復(fù)元方治療的方法。方中白附子能起少陰之真陽，恢復(fù)元陽之虛；黃芪、黨參與白附子合用溫陽益氣，三者共為君藥；桂枝能化太陽之氣，淫羊藿有引陽入陰、啟陰交陽之能，二者為臣；桂枝與白附片相合，則氣機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)，生化之機(jī)乃能暢通，得淫羊藿則一出一入，一開一合，使內(nèi)外宣通，陰陽協(xié)和；再佐以石菖蒲化痰開竅，三七活血散瘀。諸藥合用，共奏溫陽益氣、化痰通絡(luò)之功。課題組前期[7-8]已證明溫陽復(fù)元方在改善腦卒中患者神經(jīng)功能缺損方面療效顯著。在基礎(chǔ)實(shí)驗[9]中也證實(shí)可通過改善腦缺血再灌注損傷大鼠鐵代謝和抗氧化水平對神經(jīng)損傷起到保護(hù)作用。本研究通過神經(jīng)功能缺損評分檢測，顯示模型組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分較假手術(shù)組明顯升高，而溫陽復(fù)元方和鐵死亡抑制劑干預(yù)后，可明顯降低大鼠神經(jīng)功能評分，改善大鼠的神經(jīng)缺損癥狀。同時還發(fā)現(xiàn)溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑聯(lián)合干預(yù)與單純鐵死亡誘導(dǎo)劑干預(yù)后，兩組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯高于溫陽復(fù)元方組且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而與模型組比較則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，這說明溫陽復(fù)元方改善大鼠的神經(jīng)功能作用機(jī)制可能與抑制鐵死亡有關(guān)。

目前研究鐵死亡的主要特征包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩方面。細(xì)胞形態(tài)方面，主要表現(xiàn)為細(xì)胞線粒體變小，膜密度增高，嵴減少；細(xì)胞分子方面，主要表現(xiàn)為鐵依賴的脂質(zhì)過氧化增高，包括Fe2+和GSH的耗竭[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中Fe2+含量上調(diào)、GSH 含量顯著下降，HE 染色顯示神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少且排列稀疏、細(xì)胞周圍空泡大量形成；電鏡下可見線粒體膜破裂或密度增多，線粒嵴溶解斷裂。而溫陽復(fù)元方和鐵死亡抑制劑干預(yù)后，可降低Fe2+含量，上調(diào)GSH 含量，HE 及電鏡觀察顯示可顯著改善大鼠神經(jīng)細(xì)胞病理性損傷。這提示溫陽復(fù)元方可能具有通過抑制鐵死亡而發(fā)揮神經(jīng)損傷的保護(hù)作用，這與曾勁松等[17]的研究結(jié)果相似。但該方抑制鐵死亡的具體機(jī)制尚不明確。

鐵死亡的機(jī)制包括鐵代謝、氨基酸代謝及脂質(zhì)代謝[18]。近年來研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，大腦的鐵代謝紊亂參與缺血性腦卒中后神經(jīng)損傷的病理過程。因此，探索改善鐵代謝抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡也成為神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域的焦點(diǎn)。研究[21]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，鐵代謝紊亂導(dǎo)致TFR1增加和FPN減少，從而促使細(xì)胞外三價鐵離子（Fe3+）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為游離的二價亞鐵離子Fe2+，在大腦中異常積聚，造成鐵穩(wěn)態(tài)失衡，并通過芬頓（Fenton）反應(yīng)產(chǎn)生的自由基，誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致線粒體鐵死亡，最終引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙。在腦內(nèi)，IRP/IRE 調(diào)節(jié)的異常，會導(dǎo)致腦內(nèi)的鐵水平發(fā)生明顯變化，引起多種鐵代謝失衡相關(guān)疾病，IRP 包括IRP1 和IRP2 兩型，其中IRP1是一種雙功能酶，已證實(shí)TFR1與FPN是IRE的主要目標(biāo)基因[5]。而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵缺乏時，IRP1 與FPNmRNA 5’UTR結(jié)合導(dǎo)致翻譯終止，減少細(xì)胞內(nèi)鐵輸出，同時與TFR1 mRNA 3’UTR結(jié)合，增加了細(xì)胞的鐵攝??；反之，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵過載時，IRP1 終止與IRE 目標(biāo)基因（TFR1 及FPN）結(jié)合，增加細(xì)胞內(nèi)鐵的輸出而減少鐵攝取，維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)[5，22]。因此，改善鐵代謝對維持細(xì)胞內(nèi)外鐵穩(wěn)態(tài)具有重要作用。腦缺血時導(dǎo)致FPN 下調(diào)，從而增強(qiáng)鐵的吸收能力，減弱鐵的釋放能力，加劇了鐵在細(xì)胞中的積累[23]。Erastin 鐵死亡誘導(dǎo)劑與Ferrostatin-1 鐵死亡抑制劑是目前公認(rèn)的具有誘導(dǎo)和抑制鐵死亡的化學(xué)制劑，前者能夠通過阻斷細(xì)胞內(nèi)GSH 的合成，削弱細(xì)胞的抗氧化能力，最終導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[24]；而后者通過抑制脂質(zhì)體中由鐵和微量脂質(zhì)氫過氧化物引發(fā)的過氧化反應(yīng)，清除多余鐵離子及活性氧自由基，進(jìn)而拮抗鐵死亡[25]。因此，本研究選用Erastin和Ferrostatin-1作為對照組，一定程度上可對溫陽復(fù)元方的藥效作用提供參考。本結(jié)果顯示，模型組大鼠IRP1、FPN蛋白及mRNA 表達(dá)水平明顯降低，TFR1 蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高，這說明腦缺血再灌注損傷后可能鐵代謝紊亂參與激活了鐵死亡途徑。而中藥溫陽復(fù)元方與鐵死亡抑制劑干預(yù)可明顯逆轉(zhuǎn)上述改變，且兩者之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，這一定程度證實(shí)了溫陽復(fù)元方發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制鐵死亡有關(guān)。同時研究還發(fā)現(xiàn)溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑與鐵死亡誘導(dǎo)劑干預(yù)后顯示，兩組大鼠腦梗死區(qū)域IRP1、FPN 蛋白及mRNA 表達(dá)水平明顯低于中藥溫陽復(fù)元方組，TFR1 蛋白及mRNA 表達(dá)水平明顯升高，這一定程度上證實(shí)了溫陽復(fù)元方的神經(jīng)保護(hù)作用可能與鐵依賴的脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的鐵死亡有關(guān)。這與部分學(xué)者的研究[17，26]有相似之處，一定程度上證實(shí)了中藥復(fù)方可通過改善腦鐵代謝抑制線粒體鐵死亡途徑對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能起到保護(hù)作用。

綜上，我們可以得出推論，溫陽復(fù)元方可改善大鼠神經(jīng)功能損傷及腦缺血再灌注損傷后大鼠腦缺血區(qū)域神經(jīng)病理損傷，其機(jī)制可能與該方可上調(diào)鐵調(diào)蛋白IRP1 表達(dá)，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)鐵代謝途徑發(fā)揮抑制鐵死亡有關(guān)，這為溫陽復(fù)元方治療缺血性腦卒中提供了實(shí)驗依據(jù)。但該方是否還存在其他的途徑同時作用于調(diào)節(jié)鐵死亡機(jī)制的靶點(diǎn)，這是今后需要繼續(xù)深入研究的部分。