一株鼠冠狀病毒的全基因組序列特征分析

趙 靜,馬曉華,南曉偉,柴薩薩,李利利,段招軍,

冠狀病毒(Coronavirus,CoV)是一類(lèi)單股正鏈RNA病毒,是RNA病毒中基因組最大的一類(lèi)病毒,長(zhǎng)度約為30 kb左右。冠狀病毒是人類(lèi)和脊椎動(dòng)物重要病原體,可引起呼吸道、腸道、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)等多種器官的疾病[1]。冠狀病毒目前分為4個(gè)屬:Alpha冠狀病毒、Beta冠狀病毒、Gamma冠狀病毒和Delta冠狀病毒,其中Alpha冠狀病毒屬和Beta冠狀病毒屬主要感染哺乳動(dòng)物,并引起呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的癥狀;Gamma冠狀病毒屬和Delta冠狀病毒屬主要在禽類(lèi)中發(fā)現(xiàn)[2]。Alpha冠狀病毒屬成員HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1已明確為可以感染人類(lèi)的冠狀病毒成員[3];Beta冠狀病毒屬由A、B、C和D亞群組成[4],多個(gè)成員可引起嚴(yán)重疾病,如嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)和新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)均曾經(jīng)或正在引起全球重大公共衛(wèi)生事件,尤其是SARS-CoV-2引起全球CoVID-19大流行對(duì)人類(lèi)的影響是空前的。

鼠類(lèi)(Rats)是一類(lèi)自然界廣泛存在并且數(shù)量眾多的哺乳動(dòng)物,屬于嚙齒目(Rodentia)鼠科(Muridae),是多種病原庫(kù)的天然儲(chǔ)存庫(kù)之一,也是人獸共患傳染病病原體來(lái)源之一[5],目前已基本明確嚙齒動(dòng)物是沙粒病毒、漢坦病毒、呼腸孤病毒、黃病毒等多種人獸共患病病原體的自然宿主,其中許多病毒可引起嚴(yán)重的疾病[6]。鼠類(lèi)攜帶病毒具有豐富的種類(lèi)和多樣性,而鼠類(lèi)與人類(lèi)或家畜等接觸密切,這就增加了鼠類(lèi)病原體跨種傳播感染人類(lèi)的風(fēng)險(xiǎn)。已有研究表明,Alpha屬冠狀病毒成員人類(lèi)冠狀病毒HKU-1和OC43可能是由鼠類(lèi)中冠狀病毒發(fā)生跨種傳播到人類(lèi)并引起傳播[6]。

冠狀病毒具有極高的基因多樣性,在世界各地的嚙齒動(dòng)物、蝙蝠及其他野生動(dòng)物中均廣泛分布[8-9]。已有研究表明SARS-CoV、MERS-CoV以及引起全球大流行的SARS-CoV-2均可能起源于野生動(dòng)物,這提示了冠狀病毒造成人獸共患風(fēng)險(xiǎn)較高[10]。近幾年在全球尤其在我國(guó)新發(fā)現(xiàn)的鼠類(lèi)冠狀病毒不斷增加[11-12]。在2021年有研究者系統(tǒng)評(píng)估了動(dòng)物源性病毒的人獸共患潛力以及傳播潛力,發(fā)現(xiàn)了幾種與嚙齒動(dòng)物有關(guān)的冠狀病毒被列在前50,其中就包括我國(guó)學(xué)者在我國(guó)浙江省鼠中發(fā)現(xiàn)的LAMV[13]。因此監(jiān)測(cè)和發(fā)現(xiàn)野生動(dòng)物中冠狀病毒對(duì)未來(lái)可能發(fā)生的冠狀病毒跨種傳播至關(guān)重要。本研究在我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)采樣的鼠類(lèi)樣本進(jìn)行病毒組研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一株新型Alpha冠狀病毒,并對(duì)全基因組的特點(diǎn)和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析,了解病毒的基因組特性和進(jìn)化地位,豐富了鼠類(lèi)中病毒組成的種類(lèi)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 于2016年在我國(guó)內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市莫力達(dá)瓦達(dá)斡爾族自治旗的鼠類(lèi)進(jìn)行樣本采集,依照不破壞種群的前提下,使用野外布鼠夾進(jìn)行鼠類(lèi)樣本收集,采集后送至當(dāng)?shù)厣锇踩?jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行解剖后收集組織樣本,最終獲得腸組織/糞便樣本61份,肝組織樣本61份以及肺組織樣本61份,干冰運(yùn)送至中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃中保存待用。

1.2 樣本前處理、核酸提取和高通量測(cè)序 在生物安全柜中取約0.3 g組織樣本置于1.5 mL離心管中,加入1 mL預(yù)冷的MEM培養(yǎng)基和4-6顆鋼珠(預(yù)先高壓),置于組織研磨儀中70 Hz研磨3 min。研磨液置于8 000 r/min離心10 min,將腸組織樣本分別混為4個(gè)樣本庫(kù),肝組織樣本混為4個(gè)樣本庫(kù),肺組織樣本混為1個(gè)樣本庫(kù),共9個(gè)樣本庫(kù)進(jìn)行下一步處理;取樣本庫(kù)上清用 0.22 μm的濾器過(guò)濾去除樣本中的細(xì)菌和組織碎片以減少樣本的背景;取過(guò)濾后的173 μL懸液中加入7 μL的DNase I和20 μL的10×DNase Buffer,37 ℃水浴1 h,使用核酸提取試劑盒根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取核酸,用Qubit2.0定量RNA濃度,將核酸送至深圳華大基因有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序。

1.3 鼠種類(lèi)鑒定 根據(jù)文獻(xiàn),鼠種類(lèi)鑒定通過(guò)擴(kuò)增鼠的細(xì)胞色素b基因部分片段進(jìn)行鑒定[14]。通過(guò)BLAST比對(duì)確認(rèn)鼠種類(lèi)。引物序列如下:上游引物L(fēng)7:5′-ACCAATGACATGAAAAATCATCG-TT-3′,下游引物H15915:5′-TCTCCATTTCTGGTTTACAAGAC-3′。

1.4 病毒逆轉(zhuǎn)錄及全基因組的擴(kuò)增 將提取的核酸用SuperScript Ⅱ試劑盒根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到cDNA置于-20 ℃儲(chǔ)存。為驗(yàn)證病毒序列,根據(jù)高通量測(cè)序拼接獲得的病毒序列,使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)覆蓋全部拼接序列的引物以驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性,全基因組擴(kuò)增引物以cDNA作為模板,使用Premix Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證,5′和3′末端采用RACE的方法進(jìn)行擴(kuò)增,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,送往北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 序列比對(duì)拼接與系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建 將測(cè)序結(jié)果用DNASTAR的SeqMan子程序進(jìn)行拼接;利用MEGA11軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),Bootstrap設(shè)置為1 000;采用RDP4.0和SimPlot軟件對(duì)序列進(jìn)行重組分析,SimPlot軟件Window Size設(shè)置為1 000,Step Size設(shè)置為100,參數(shù)模型設(shè)置為Kimura model。

2 結(jié) 果

2.1 基因組結(jié)構(gòu)特性 我們?cè)谘芯績(jī)?nèi)蒙古地區(qū)的鼠類(lèi)樣本病毒組成的過(guò)程中,在其中一個(gè)腸道組織樣本庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了冠狀病毒的reads,組裝拼接得到一株新的Alpha屬冠狀病毒,設(shè)計(jì)引物驗(yàn)證后該樣本庫(kù)的所有單個(gè)樣本進(jìn)行篩查,結(jié)果顯示一只鼠的一份腸道樣本(MCX-13)為陽(yáng)性,這只鼠類(lèi)在樣本采集時(shí)根據(jù)解剖形態(tài)學(xué)鑒定為小家鼠,通過(guò)擴(kuò)增鼠的細(xì)胞色素b基因部分片段進(jìn)行鑒定結(jié)果確定該病毒來(lái)自于為小家鼠(Musmusculus)。

該病毒組全基因組長(zhǎng)度為 27 674 bp,G+C含量為42.31%,暫命名為NMR-13其基因組長(zhǎng)度與其最為相近的病毒株FiCoV/UMN2020接近,但較其他鼠冠狀病毒的長(zhǎng)度較短。該病毒基因組與鼠類(lèi)Alpha冠狀病毒屬的基因組結(jié)構(gòu)類(lèi)似,包含8個(gè)常見(jiàn)的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)以及5′UTR和3′UTR區(qū),依次為5′UTR-ORF1ab-S-ORF3-E-M-ORF6-N-ORF8-3′UTR,其中ORF1ab基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,S、E、M、N基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白,ORF3、ORF6和ORF8編碼3個(gè)輔助蛋白;此外,5′端包含286 bp的非編碼區(qū)和3′端包含266 bp非編碼區(qū)及polyA結(jié)構(gòu)。NMR-13的基因組結(jié)構(gòu)與我國(guó)浙江省發(fā)現(xiàn)的LRNV及多個(gè)相似的變異株以及英國(guó)發(fā)現(xiàn)的病毒株UKRn3 等鼠冠狀病毒相比,在ORF1ab和S基因之間缺少一個(gè)編碼NS2蛋白的ORF2開(kāi)放閱讀框,該基因目前在多數(shù)的鼠類(lèi)Alpha冠狀病毒中存在,而本研究中發(fā)現(xiàn)的NMR-13和與之相近的FiCoV/UMN2020 、AcCoV-JC34和Lijiang-170病毒株中未發(fā)現(xiàn)ORF2。此外,本研究發(fā)現(xiàn)的NMR-13在N基因下游3′非編碼區(qū)存在一個(gè)編碼109個(gè)氨基酸的ORF8。序列已上傳至GenBank,序列號(hào)為OQ939561.1。

冠狀病毒普遍包含保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(Transcriptional Regulatory Sequence,TRS),NMR-13包含冠狀病毒科成員保守的轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列,與鼠類(lèi)冠狀病毒LRNV 、AcCov-JC34及HKU3類(lèi)似,在NMR-13基因組中5′-AACUAA-3′為主要核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列,如表1所示。

表1 冠狀病毒基因組特點(diǎn)分析

2.2 同源性分析 同源性分析結(jié)果顯示,NMR-13與美國(guó)發(fā)現(xiàn)的FiCoV/UMN2020病毒株具有最高的相似性,為91.3%,各個(gè)ORF的核苷酸同源性為84.9%～92.8%,其中ORF8核苷酸和氨基酸同源性最低,僅為84.9% 和74.1%;FiCoV/UMN2020是一株實(shí)驗(yàn)室小鼠體內(nèi)的分離出的病毒。NMR-13其次與我國(guó)發(fā)現(xiàn)的多株鼠類(lèi)冠狀病毒Lucheng/Lijiang-170、Lucheng/Ruian-83和Lucheng/Lijiang-71等多個(gè)病毒株同源性較高,為79.5%～81.0%,但S基因同源性低,僅為50.2%～61.4%,詳細(xì)分析見(jiàn)表2。根據(jù)blast比對(duì)結(jié)果顯示,相近的鼠類(lèi)Alpha冠狀病毒除FiCoV/UMN2020和UKRn3病毒株,其余病毒株均來(lái)自于中國(guó),提示了病毒傳播的區(qū)域性特點(diǎn)。NMR-13編碼的ORF8僅與FiCoV/UMN2020以及我國(guó)發(fā)現(xiàn)的鼠類(lèi)冠狀病毒株和一株犬類(lèi)冠狀病毒具有同源性,其中與FiCoV/UMN2020毒株的氨基酸同源性為74.1%,而與其它我國(guó)相近毒株的氨基酸同源性?xún)H為46.4%～53.6%。

表2 NMR-13與參考株序列的相似度分析

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 為確定NMR-13與已知冠狀病毒的進(jìn)化關(guān)系,構(gòu)建全基因組、RdRp區(qū)和S基因的最大似然樹(shù)。全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示所有的來(lái)自嚙齒動(dòng)物Alpha冠狀病毒單獨(dú)聚為同一進(jìn)化分支,包括來(lái)自我國(guó)云南、浙江和山東等地區(qū)發(fā)現(xiàn)的毒株、英國(guó)(UKRn3)和美國(guó)(FiCoV/UMN2020)的毒株。NMR-13與來(lái)自美國(guó)的FiCoV/UMN2020親緣關(guān)系最近聚在一起?；赟基因和RdRp區(qū)的構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也顯示類(lèi)似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),詳見(jiàn)圖1、圖2和圖3。目前發(fā)現(xiàn)的鼠類(lèi)Alpha冠狀病毒多數(shù)發(fā)現(xiàn)自我國(guó),包括云南、浙江和山東等地區(qū)。

注:加粗字體代表本研究的毒株。

注:加粗字體代表本研究的毒株。

注:加粗字體代表本研究的毒株。

2.4 序列重組分析 冠狀病毒中重組情況較為常見(jiàn)[15],使用RDP4.0軟件和SimPlot軟件對(duì)NMR-13的全基因組和其他的冠狀病毒進(jìn)行序列相似性分析和重組分析,以NMR-13作為參考序列進(jìn)行重組分析,未發(fā)現(xiàn)該病毒株有重組現(xiàn)象。重組分析發(fā)現(xiàn),NMR-13與我國(guó)Lucheng/Lijiang-170、Lucheng/Ruian-83和Lucheng/Lijiang-71等病毒株除S區(qū)同源性較低外,ORF1a的部分區(qū)域同源性也較低,見(jiàn)圖4。

圖4 NMR-13與已知冠狀病毒序列的重組分析)

3 討 論

冠狀病毒是在鼠類(lèi)中常見(jiàn)的病毒之一,并且表現(xiàn)出較高的基因多樣性,具有廣泛的地理分布范圍。近年來(lái)發(fā)生多起冠狀病毒跨種傳播感染人類(lèi)的事件發(fā)生,因此冠狀病毒是一種對(duì)人類(lèi)具有重大威脅的人獸共患病原體。

本研究在鼠類(lèi)中發(fā)現(xiàn)一株Alpha冠狀病毒屬成員,并獲得完整基因組,命名為NMR-13。同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析表明NMR-13病毒株與發(fā)現(xiàn)自美國(guó)的FiCoV/UMN2020病毒株最為相近,全基因組及各ORF同源性在90%左右。NMR-13其次與我國(guó)發(fā)現(xiàn)的多株鼠Alpha冠狀病毒病毒株同源性?xún)H為80%左右,根據(jù)全基因組、保守的RdRp區(qū)以及非保守的S基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也支持NMR-13與FiCoV/UMN202最近的親緣關(guān)系而與其余我國(guó)鼠類(lèi)Alpha冠狀病毒病毒株進(jìn)化關(guān)系稍遠(yuǎn)。鑒于中國(guó)與美國(guó)遙遠(yuǎn)的地理距離,NMR-13與美國(guó)發(fā)現(xiàn)的毒株更近而與我國(guó)毒株更遠(yuǎn)的原因可能與病毒在物種間的病毒傳播的的關(guān)系相關(guān)性小,而更可能與病毒在進(jìn)化過(guò)程中的趨同效應(yīng)有關(guān)。鼠類(lèi)物種繁多,目前已在多種鼠類(lèi)中發(fā)現(xiàn)Alpha冠狀病毒[11-12,16],本研究發(fā)現(xiàn)的NMR-13與最為相近的FiCoV/UMN2020病毒株均來(lái)自于小家鼠,在已有的研究對(duì)Alpha冠狀病毒是否可能與宿主具有共進(jìn)化的關(guān)系研究中并未發(fā)現(xiàn)共進(jìn)化的相關(guān)性,而更可能在鼠類(lèi)不同物種間跨種傳播,形成鼠類(lèi)Alpha冠狀病毒的多樣性。

NMR-13的基因組結(jié)構(gòu)與我國(guó)浙江省發(fā)現(xiàn)的LRNV及多個(gè)相似的變異株以及英國(guó)發(fā)現(xiàn)的病毒株UKRn3 等鼠冠狀病毒相比,在ORF1ab和S基因之間缺少一個(gè)預(yù)測(cè)的編碼NS2蛋白的ORF2開(kāi)放閱讀框。在以往發(fā)現(xiàn)的多個(gè)鼠類(lèi)Alpha冠狀病毒,多數(shù)的病毒株在ORF1ab與S基因之間包含一個(gè)NS2基因,包括我國(guó)發(fā)現(xiàn)的Lijiang-71、Lucheng-19和Ruian-83以及英國(guó)發(fā)現(xiàn)的UKRn3,這些病毒株基因組的NS2蛋白均與Beta冠狀病毒的NS2基因具有最高同源性,約為40%左右,這可能提示該基因可能來(lái)自于未被發(fā)現(xiàn)的Beta冠狀病毒,且是在較為久遠(yuǎn)的歷史進(jìn)化中獲得。而在本研究中發(fā)現(xiàn)的NMR-13、FiCoV/UMN2020、Lijiang-170和AcCoV-JC34病毒株中未發(fā)現(xiàn)NS2的存在[11-12]。已發(fā)現(xiàn)的鼠類(lèi)Alpha冠狀病毒ORF1ab和S基因之間編碼的蛋白有兩種形式,即插入NS2或插入NS2和(NS)2b兩個(gè)假設(shè)的蛋白,目前該基因的功能尚不明確[11]。Alpha冠狀病毒一般具有相似的基因組結(jié)構(gòu),包括ORF1ab-S-ORF3-E-M-N,而在一些種或毒株種,存在一些額外的ORF,例如TGEV, BatCoV、HKU2和BatCoV-512等毒株在其近3′末端包含一個(gè)ORF7。本研究中的NMR-13在近3′非編碼區(qū)包含一個(gè)額外的編碼109個(gè)氨基酸的ORF8,該ORF也僅在部分鼠冠狀病毒和一株犬冠狀病毒中發(fā)現(xiàn),各毒株由于發(fā)現(xiàn)前后的區(qū)別,目前在GenBank中有些命名為ORF8而有些命名為ORF9,該ORF的功能目前尚不清楚。

本研究豐富了鼠類(lèi)中冠狀病毒多樣性,冠狀病毒多以引起重大公共衛(wèi)生事件的身份進(jìn)入人們視野,Alpha屬冠狀病毒可以感染許多嚙齒動(dòng)物,而嚙齒動(dòng)物是地球上最多樣化的哺乳動(dòng)物,他們與人類(lèi)接觸密切,是人獸共患傳染病重要的病原體來(lái)源之一,未來(lái)的研究應(yīng)集中于了解冠狀病毒的多樣性和宿主間跨越的可能性,因此我們需要對(duì)哺乳動(dòng)物種群的冠狀病毒感染進(jìn)行更廣泛的監(jiān)測(cè)。

利益沖突：無(wú)