張 濤,張耀剛,楊紫晗,沈銀紅,馬艷艷

泡型包蟲病(Alveolar echinococcosis,AE)是由多房棘球蚴幼蟲感染引起的容易被忽視的人獸共患寄生蟲病。青藏高原地區(qū)是泡型包蟲病的高發(fā)區(qū),青藏高原包蟲病平均檢出率是非青藏高原地區(qū)的10倍[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),多房棘球蚴能在具有免疫能力的宿主體內(nèi)長期存活并大量繁殖,從而使其實現(xiàn)免疫耐受[3-7],但其具體機(jī)制尚不明確。負(fù)性協(xié)同刺激分子程序性死亡分子1 (programmed death 1,PD-1)通過抑制或下調(diào)T細(xì)胞活化和IL10等細(xì)胞因子的產(chǎn)生增強(qiáng)機(jī)體對病原體的耐受,從而引起免疫抑制[8-9]。本研究通過多房棘球蚴原頭節(jié)(Protoscoleces,PSCs) 感染阻斷PD-1分析其對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響,明確PD-1在泡型包蟲病患者中免疫耐受的作用,為進(jìn)一步揭示多房棘球蚴致宿主免疫耐受的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床組織樣本收集 根據(jù)術(shù)后AE患者肝臟組織的病灶定位,選取小于病灶周圍0.5 cm處肝臟組織為病灶近旁肝臟組織 (close liver tissue from the lesion,CLT);同時采集超過病灶2 cm以上的肝臟組織為病灶遠(yuǎn)端肝臟組織(distant liver tissue from the lesion,DLT)。收集病灶近旁肝臟組織和病灶遠(yuǎn)端肝臟組織置于10%的中性甲醛中固定過夜,用于病理切片。該研究通過青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理批準(zhǔn)(P-SL-2019033),并在中國人類遺傳資源備案。所有AE患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞系 RAW264.7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,培養(yǎng)在含有10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中。

1.3 主要試劑及儀器 DMEM購自Gibco公司,胎牛血清購自上海達(dá)特希爾生物科技有限公司,信迪利單克隆抗體購自信達(dá)生物制藥有限公司,CD68抗體購自美國Novus biologicals公司,PD-1抗體和CD47抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞成像微孔板檢測為美國伯騰公司產(chǎn)品,全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)為奧地利公司產(chǎn)品。

1.4 多房棘球蚴原頭節(jié)的分離與培養(yǎng) 將成功感染多房棘球蚴的長爪沙鼠異氟烷麻醉后,固定于解剖臺上,腹部毛發(fā)碘伏消毒后,取正中切口,充分暴露腹腔內(nèi)的多房棘球蚴病灶,無菌剪刀和止血鉗鈍性分離病灶與腹腔之間的黏連,將病灶摘除放置無菌培養(yǎng)皿中,PBS反復(fù)沖洗直至無血液殘留。用無菌刀片將病灶剁碎后經(jīng)80目和300目的篩網(wǎng)過濾后,加入含有20%FBS,5‰青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中制成多房棘球蚴原頭節(jié)混懸液。抽取10 μL的混懸液置于顯微鏡下進(jìn)行觀察,存活的原頭節(jié)可活動,原頭節(jié)活力大于85%為制備成功。

1.5 細(xì)胞分組 巨噬細(xì)胞與PSCs按照1∶500的比例進(jìn)行共培養(yǎng),共培養(yǎng)時間分別為24 h、48 h和72 h。分組為:對照組、共培養(yǎng)24 h組、共培養(yǎng)48 h組、共培養(yǎng)72 h組。并給予1.5 mg/mL的信迪利單克隆抗體處理巨噬細(xì)胞后與PSCs共培養(yǎng)。

1.6 巨噬細(xì)胞吞噬實驗 將巨噬細(xì)胞與PSCs共培養(yǎng)在6孔板中,按照每1×105個巨噬細(xì)胞與2 000個PSCs共培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后,每孔中加入1×106個帶EGFP標(biāo)記的大腸桿菌(MOI=10∶1),37 ℃孵育1 h。棄掉培養(yǎng)基,PBS洗滌3次去除胞外的大腸桿菌。每孔中加入500 μL的DAPI,室溫孵育15 min,PBS洗滌5次后,每孔中加入500 μL的PBS,Biotek Cytation5拍照。使用Gen5 Image Prime 3.05軟件進(jìn)行分析。

1.7 免疫組織化學(xué)染色法 肝臟切片依次經(jīng)過二甲苯、無水乙醇、95%酒精、80%酒精、蒸餾水的脫蠟和水化,3%雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶,檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù),5%BSA 孵育。配置CD68抗體(1∶200, Novus biologicals)稀釋液,滴加抗體稀釋液覆蓋切片組織,4 ℃過夜。滴加二抗稀釋液,室溫孵育1 h。依次滴加DAB顯色液和蘇木素染料,自來水沖洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.8 Western blot RIPA裂解液提取總蛋白,配置上樣體系 (樣本蛋白總量為10 mg,上樣體積為15 μL),沸水浴煮蛋白8 min。上樣體系加入至凝膠膠孔中,恒流60 mA,電泳約1.5 h,結(jié)束電泳。將“三明治”放入轉(zhuǎn)膜槽中,倒?jié)M轉(zhuǎn)膜緩沖液,將轉(zhuǎn)膜槽置于冰中,恒流 180 mA轉(zhuǎn)膜 2.5 h。10%脫脂奶粉室溫封閉。PBST洗膜后,加入PD-1 (1∶1 000, Proteintech) 和CD47 (1∶1 000, Proteintech) 抗體稀釋液4 ℃孵育過夜。PBST洗膜后,二抗孵育;滴加適量的ECL工作液在膜上,拍照保存。

2 結(jié) 果

2.1 巨噬細(xì)胞在AE患者肝臟組織中的分布 通過免疫組織化學(xué)使用CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞分析巨噬細(xì)胞在AE患者肝臟組織CLT和DLT中的分布,結(jié)果見圖1。AE患者術(shù)后肝臟組織中CLT中的巨噬細(xì)胞明顯高于DLT(t=188.0,P<0.001),提示巨噬細(xì)胞在AE患者病灶近旁肝臟組織帶大量聚集。

注:A.CD68標(biāo)記AE患者手術(shù)切除肝臟組織的巨噬細(xì)胞;B.TissueGnosticsStrataQuest V7.1軟件識別病灶近旁肝臟組織、遠(yuǎn)端病灶肝臟組織,并統(tǒng)計各部分中CD68陽性細(xì)胞數(shù)的分析結(jié)果; 兩獨立樣本比較采用t檢驗,雙側(cè),***P<0.001。

2.2 多房棘球蚴原頭節(jié)感染抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能 通過巨噬細(xì)胞吞噬EGFP大腸桿菌來分析其吞噬作用,結(jié)果下圖2。PSCs感染巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)24 h(q=7.765,P<0.001)、48 h(q=13.61,P<0.001)和72 h(q=16.03,P<0.001)大腸桿菌的熒光強(qiáng)度降低,且隨著共培養(yǎng)時間增加大腸桿菌強(qiáng)度逐漸降低,以上結(jié)果提示PSCs感染巨噬細(xì)胞后導(dǎo)致其吞噬大腸桿菌的能力減弱。

2.3 多房棘球蚴原頭節(jié)感染促進(jìn)CD47和PD-1的表達(dá) 采用Western blotting方法分析對照組、PSCs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組組不同時間點巨噬細(xì)胞CD47和PD-1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果見圖3。PSCs感染后巨噬細(xì)胞CD47和PD-1的表達(dá)增加,且隨著共培養(yǎng)時間增加其表達(dá)增加。

2.4 多房棘球蚴原頭節(jié)感染給予信迪利單抗處理后恢復(fù)巨噬細(xì)胞的吞噬功能 給予1.5 mg/mL信迪利單克隆抗體阻斷PD-1,評估PSCs巨噬細(xì)胞的吞噬功能的改變,結(jié)果見圖4。研究發(fā)現(xiàn)單獨給予信迪利單克隆抗體與對照組相比巨噬細(xì)胞中大腸桿菌的平均熒光強(qiáng)度無統(tǒng)計學(xué)差異(q=4.159,P=0.131),給予信迪利單克隆抗體處理后再給予PSCs共培養(yǎng)與單獨給予PSCs相比巨噬細(xì)胞中大腸桿菌的平均熒光強(qiáng)度強(qiáng)度增加(q=40.63,P<0.05),提示給予信迪利單克隆抗體可恢復(fù)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

注:A.阻斷PD-1后PSCs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌;B.大腸桿菌的平均熒光強(qiáng)度;采用單因素方差分析,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

3 討 論

泡型包蟲病是一種被忽視的人獸共患疾病,也是一種全球性公共衛(wèi)生問題。AE主要分布于北半球,尤其是中國、俄羅斯、北美,其中中國青藏高原地區(qū)泡型包蟲病的發(fā)病率占全球AE發(fā)病率的91%[10]。由于病灶組織在宿主體內(nèi)呈浸潤性生長,沒有及時治療的患者10年病死率可達(dá)94%,故又稱之為“蟲癌”[11-12]。目前,AE的致病機(jī)制尚不清楚,本研究通過探索PD-1在多房棘球蚴感染對巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響,從而為新的免疫治療提供依據(jù)。

當(dāng)病原體感染后,巨噬細(xì)胞攝取病原體,病原體被困在吞噬體中,然后與溶酶體融合,在酶和過氧化物的作用下消滅病原體。既往研究發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴和其囊液能抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在泡型包蟲病患者病灶近旁肝臟組織大量聚集,但PSCs感染后抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能。巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用受多種“吃我”(促吞噬)和“別吃我”(抗吞噬)信號的調(diào)節(jié)。“別吃我”信號通路(包括CD47-SIRPα、CD24-Siglec-10、MHC-1(B2M)-LILRB1和PD-L1-PD-1) 通過與吞噬細(xì)胞上的受體相互作用來保護(hù)腫瘤細(xì)胞不被吞噬[13]。CD47作為一種免疫檢查點,通過與SIRPα結(jié)合可以將磷酸酶SHP-1招募至巨噬細(xì)胞的吞噬突觸,抑制肌球蛋白IIa的聚集,從而抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用[14]。PD-1/PD-L1免疫檢查點作為腫瘤細(xì)胞免疫逃避的機(jī)制之一,PD1通過與其配體PD-L1和PD-L2結(jié)合,抑制T細(xì)胞的活化和效應(yīng)T細(xì)胞功能,從而抑制T細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[15]。血吸蟲感染的小鼠模型中發(fā)現(xiàn),Toll樣受體2 (Toll-like receptor2,TLR2)通過誘導(dǎo)PD-L2高表達(dá),PD-L2與PD-1結(jié)合后,可抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答[8]。杜氏利什曼原蟲感染過程中阻斷PDL-1可防止T細(xì)胞耗盡,抑制自噬,并促進(jìn)杜氏利什曼原蟲的清除[16]。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)PSCs感染后促進(jìn)巨噬細(xì)胞PD-1和CD47的表達(dá),信迪利單抗阻斷PD-1后可恢復(fù)PSCs感染的巨噬細(xì)胞的吞噬功能。因此,本研究發(fā)現(xiàn)PSCs感染后通過增加PD-1和CD47的表達(dá),抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能,引起免疫抑制,從而促進(jìn)疾病進(jìn)展。

綜上所述,PSCs感染通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞PD-1和CD47的表達(dá),抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能;阻斷PD-1后可恢復(fù)巨噬細(xì)胞的功能。然而有關(guān)PD-1在PSCs感染中免疫耐受中所發(fā)揮的作用還需通過體內(nèi)實驗進(jìn)一步加以驗證,從而為泡型包蟲病的治療提供依據(jù)。

利益沖突：無