中國與日本抹茶氨基酸指紋圖譜的構(gòu)建及差異性分析

武蓓琪，白志文，王 閃，汪 璐，田應(yīng)剛，王洪新,3*

1. 江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 貴州貴茶（集團）有限公司，貴州 銅仁 554400；3. 國家功能食品工程技術(shù)研究中心（江南大學），江蘇 無錫 214122

抹茶起源于中國魏晉時期，興于唐朝，于宋朝進入鼎盛期[1]。抹茶是選用經(jīng)過遮陰覆蓋技術(shù)栽培的茶樹鮮葉經(jīng)蒸汽殺青、干燥、研磨等工藝加工成碾茶，然后用天然石磨或合金球磨機研磨制成的粒徑在10 ～ 20 μm 的茶葉產(chǎn)品[2]。茶樹遮陰后有利于鮮葉中以茶氨酸為代表的有甘甜滋味的氨基酸成分的積累和保留，同時減少具有強苦澀味的兒茶素和咖啡因的生成[3]。碾茶作為制作抹茶的關(guān)鍵中間原料之一，直接關(guān)系到抹茶的品質(zhì)。選用不同產(chǎn)地或品種的碾茶制得的抹茶中氨基酸組成和含量的差異會直接影響抹茶的香氣和滋味[4]。因此，碾茶的挑選成為制作品質(zhì)優(yōu)良抹茶的關(guān)鍵?！６Υ蟀撞琛汀埦?3’是貴州茶區(qū)引種的用于抹茶生產(chǎn)的兩個綠茶品種，其鮮葉中氨基酸、葉綠素和蛋白質(zhì)含量高，咖啡因和兒茶素含量低，特別適合作為抹茶產(chǎn)品的原料[5]。抹茶屬于未經(jīng)發(fā)酵的超微綠茶粉，有利于作為健康型配料在各種食品中添加應(yīng)用，同時與普通綠茶相比更容易被人體吸收，具有較高的營養(yǎng)價值與藥用價值[6]。

化學成分的特征指紋圖譜技術(shù)已被應(yīng)用于茶葉和其他食品領(lǐng)域的品質(zhì)評價和鑒定中。凌彩金等[7]用SPSS 軟件建立了不同采摘季節(jié)‘英紅九號’紅茶的主要生化成分的指紋圖譜，為識別不同季節(jié)的紅茶提供了指導依據(jù)。王淑慧等[8]建立了信陽毛尖茶湯滋味的HPLC 特征指紋圖譜，對茶湯的滋味成分進行了直觀的分析，明確了不同等級茶葉的差異性，為綠茶的質(zhì)量監(jiān)控建立了一種科學量化的方法。王世博等[9]建立了白茶的兒茶素類和生物堿類成分的特征指紋圖譜，為白茶的質(zhì)量控制和深度開發(fā)提供參考依據(jù)。但到目前為止，未見有關(guān)抹茶氨基酸指紋圖譜的相關(guān)研究報道。

目前，用于茶葉氨基酸分析的方法主要有氨基酸自動分析儀[10]、氣相色譜-聯(lián)用質(zhì)譜法[11]、高效液相色譜儀[12]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等，其中高效液相色譜法是應(yīng)用最廣泛的檢測方法。由于大多數(shù)氨基酸無紫外吸收也無熒光發(fā)射的特性，需要采用氨基酸衍生化來提高分析檢測的靈敏度和分離選擇特性[14]。柱前衍生化方法與氨基酸自動分析儀采用的柱后衍生化相比具有分析時間短、靈敏度高和適用范圍廣等優(yōu)點被更廣泛采用[15]。

本試驗以我國貴州生產(chǎn)的16種抹茶為原料，通過檢測其酸水解氨基酸以及游離氨基酸的組分和含量，重點關(guān)注茶氨酸的含量區(qū)別，通過SPSS 和Origin 8.5 軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪制指紋圖譜并對呈味氨基酸成分進行分析，同時和日本6 個品牌的抹茶對比分析，重點分析貴州抹茶呈味的獨特性。本文具有較好的指導貴州抹茶的辨?zhèn)巫R別、選擇原料、優(yōu)化制作工藝以及促進市場開拓的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

16 個抹茶試樣均來自貴州貴茶集團（表1），6個日本抹茶樣通過國際物流購買于日本（表2）。測定前密封保存在4℃冰箱中待用。

表1 貴州抹茶試樣情況Table 1 Information of Guizhou Matcha samples

表2 商品抹茶試樣清單Table 2 Information of purchased Matcha samples

1.2 儀器與設(shè)備

AR224CN 分析型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；DFT-100 高速萬能粉碎機，上海皓莊儀器有限公司；HH-4 數(shù)顯攪拌水浴鍋，常州賽普實驗儀器廠；GZX-9140MBE 電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DL-5-B 離心機，上海安亭科學儀器廠；YQ 型超聲波清洗機，上海易凈超聲波儀器有限公司；Agilent Ag1100 高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 主要試劑

鹽酸、醋酸、3-巰基丙酸、氫氧化鈉、乙酸鈉、三乙胺、四氫呋喃均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；鄰苯二甲醛（OPA）衍生化試劑、氯甲酸芴甲酯（FMOC）衍生化試劑（美國Agilent 公司）；乙腈、甲醇均為色譜級（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.4 試驗方法

采用HPLC 法分析氨基酸的組成，含量通過外標法測定。由于氨基酸極性大，且無紫外吸收，故需要進行OPA-FMOC 柱前衍生化處理[15]。

1.4.1 游離氨基酸樣品前處理

精確稱量1.0 g 樣品至15 mL 試管中，加入10 mL 沸水超聲30 min，然后在15 000 r/min 條件下離心15 min，過0.22 μm 水膜，取400 μL上清液于液相進樣品中待測。

1.4.2 酸水解氨基酸樣品前處理

稱取100 mg 樣品于密封的水解管中，加入8 mL 的6 mol·L-1HCl，通入3 min 氮氣，使溶液呈微沸狀態(tài)，密封水解管，放入烘箱，在120℃下水解22 h。加入4.8 mL 的10 mol·L-1NaOH 中和至pH 為7.2，蒸餾水定容至25 mL，雙層濾紙過濾后在15 000 r/min 條件下離心30 min，過0.22 μm 水膜，取400 μL 上清液于液相進樣品中待測。

1.4.3 試劑配置及色譜條件

流動相A：稱取8 g 乙酸鈉，加1 000 mL蒸餾水溶解，再加入225 μL 三乙胺，用5%的醋酸調(diào)節(jié)pH 至7.2，加入5 mL 四氫呋喃，混合后備用。

流動相B：稱取8 g 乙酸鈉，加400 mL 蒸餾水溶解，用2%醋酸調(diào)節(jié)pH 至7.2，將此溶液加入800 mL乙腈和800 mL甲醇，混合后備用。

色譜條件：根據(jù)謝至茹等[16]的方法，略作修改。色譜柱：ODS Hypcrsil-C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；柱 溫：40 ℃；檢 測 波 長：338 nm、262 nm（脯氨酸）；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。梯度洗脫。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個樣品重復(fù)測定三次，數(shù)據(jù)通過SPSS Statistics 19 軟件（IBM，美國）進行分析。根據(jù)Tukey 檢驗，p＜ 0.05 表示差異顯著。通過Origin 8.5、SPSS Statistics 19 分別繪制碾茶、抹茶的游離氨基酸和酸水解氨基酸的指紋圖譜，根據(jù)SPSS 系統(tǒng)聚類方法進一步做聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸的指紋圖譜

由表3 可知，貴州16 種抹茶的游離氨基酸含量為0.60 ～ 2.58 g/100 g，大都低于日本抹茶的游離氨基酸含量（2.71 ～ 5.03 g/100 g），其中15 號貴州抹茶游離氨基酸含量與20 號日本抹茶接近。經(jīng)色度儀測定，結(jié)果顯示15 號抹茶的綠色度是最高的。

表3 17 種游離氨基以及茶氨酸含量Table 3 Contents of 17 free amino acids and theanine g / 100 g

抹茶中的氨基酸含量一般高于普通的綠茶，主要是抹茶的栽培管理中遮陰技術(shù)影響茶樹氮代謝，增加抹茶中氨基酸的含量[17]。16 個貴州抹茶樣游離氨基酸含量有明顯差異，這可能主要是因為遮陰覆蓋措施的差異[2]。由于遮陰成本較高，國內(nèi)很多企業(yè)在茶樹栽培過程中沒有采用遮陰措施。茶樹品種的不同是另一個主要原因。另外，茶樹種植的不同地理環(huán)境有很大關(guān)系，高緯度和高海拔地區(qū)的茶樹品種氨基酸含量高于低緯度和低海拔地區(qū)[18]。一般認為，緯度36°地理帶附近種植的茶葉最適宜抹茶制作?！６Υ蟀撞琛琴F州引種的主要茶樹品種，雖然地處緯度較低，但較高海拔的貴州栽培出來的‘福鼎大白茶’鮮葉中氨基酸含量高，適合作為抹茶的原材料[19]。而日本抹茶大多數(shù)采用‘藪北種’茶鮮葉作為原料[6]，種植的地區(qū)緯度高于我國貴州，有利于茶鮮葉中蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮物質(zhì)的積累[20]。

由圖1 可知，茶氨酸（Theanine）和谷氨酸在貴州抹茶中所含比例較大，其次是天冬氨酸和精氨酸等。氨基酸的相對位置和相對含量大小可以對抹茶樣品進行分類和品種分析。具體來說，圖1 中16 個貴州抹茶的游離氨基酸的相對位置都一致，只是相對含量有差異，其中15號抹茶游離氨基酸含量明顯高于其他抹茶，可能原因是遮陰的條件及采收的時間不同。

圖1 貴州抹茶樣游離氨基酸指紋圖譜Figure 1 The fingerprint of free amino acids in Matcha from Guizhou

2.2 貴州抹茶聚類分析

為了進一步分析比較16 種貴州抹茶在游離氨基酸指標上的異同，在上述指紋圖譜基礎(chǔ)上，將18 種氨基酸含量為聚類變量，利用SPSS Statistics 19 軟件中的組間連接法對16 個抹茶樣品進行聚類分析（圖2）。結(jié)果表明，16 種貴州抹茶樣品被分成了三類。15 號為第一類；4、5、8、9、12、13 號 為 第 二 類；1、2、3、6、7、10、11、14、16 號為第三類。15 號樣品中茶氨酸（1.42 g/100 g）和游離氨基酸總量（2.58 g/100 g）遠高于其他樣品，所以被分為單獨的一類。剩下的15 個貴州抹茶樣品的氨基酸僅在含量上有差異，氨基酸組成一致，差異較小，第二類的6 個抹茶樣品游離氨基酸平均含量（0.86 g/100 g）小于第三類的9 個抹茶樣品（1.38 g/100 g）。

圖2 基于抹茶游離氨基酸含量的聚類分析Figure 2 Cluster analysis based on content of amino acids in Matcha

在聚類分析的基礎(chǔ)上，從三大類中各挑選一個游離氨基酸含量最高的樣品作為代表和日本抹茶對比，繪制對比指紋圖譜（圖3）。

圖3 貴州抹茶和日本抹茶游離氨基酸指紋圖譜Figure 3 The fingerprint of free amino acids in Matcha from Guizhou and Japan

由圖3 可知，日本抹茶的游離氨基酸含量普遍高于貴州抹茶，尤其是天冬氨酸、茶氨酸、谷氨酸和精氨酸的含量，但15 號貴州抹茶的茶氨酸含量接近20 號日本抹茶。同時，貴州抹茶的谷氨酸含量高于精氨酸，而日本抹茶則相反，說明日本抹茶和貴州抹茶在呈味方面表現(xiàn)不同。

2.3 茶氨酸含量差異

茶氨酸作為茶葉中的特殊氨基酸，約占茶葉中游離氨基酸的50%以上，是綠茶中含量最高的游離氨基酸，也是茶樹中具有重要生理活性的次生代謝產(chǎn)物，對于茶葉品質(zhì)與風味的形成至關(guān)重要[21]。22 個抹茶樣品的茶氨酸含量見圖4，不同小寫字母表示抹茶試樣之間差異顯著（p＜ 0.05）。

圖4 抹茶中茶氨酸含量Figure 4 Contents of theanine in Matcha

從表3 可知，貴州抹茶茶樣茶氨酸含量占游離氨基酸總量的50%以上，與相關(guān)研究報道的結(jié)論一致[7]。但日本抹茶的茶氨酸含量沒有達到總游離氨基酸的50%，其中17 號樣的茶氨酸僅占總游離氨基酸的36%。從圖4 可看出，貴州抹茶的茶氨酸含量差異較大，其中15 號抹茶的茶氨酸含量最高，為1.419 3 g/100 g，是4號抹茶（0.275 8 g/100 g）的5.15 倍，可能原因是茶葉的產(chǎn)地差異。4 號抹茶原料來自貴州黔南和銅仁的‘福鼎大白茶’，而15 號抹茶是采用來自貴州遵義的‘福鼎大白茶’。此外，不同的遮陰時間和方式可能也是造成茶氨酸含量差異的主要原因之一[22]。

2.4 水解氨基酸指紋圖譜

所有樣品都檢出17 種水解氨基酸（表4），色氨酸未被檢出，這是因為色氨酸在酸水解過程中被分解[23]。

表4 抹茶樣品中17 種水解氨基酸含量Table 4 Contents of 17 free amino acids and theanine in Matcha samples g / 100 g

由表4 可知，谷氨酸的含量最高，約占水解氨基酸總量的20%；其次是天冬氨酸，占水解氨基酸總量的10%以上。該結(jié)果略高于趙明明等[24]的研究，證明遮陰可以提高綠茶中水解氨基酸的含量。同時，日本抹茶的平均水解氨基酸含量（27.07 g/100 g）高于貴州抹茶（22.14 g/100 g）。說明茶葉中蛋白質(zhì)含量與產(chǎn)地、茶樹品種等有一定的聯(lián)系[25]。

繪制水解氨基酸指紋圖譜（圖5）可知，谷氨酸在抹茶中所占比例最大，其次是天冬氨酸、亮氨酸和賴氨酸等。貴州抹茶原料都來源于‘福鼎大白茶’，所以氨基酸排列順序基本一致，沒有太大變化，僅是含量差異。

圖5 貴州抹茶樣品的水解氨基酸指紋圖譜Figure 5 The fingerprint of hydrolyzed amino acids in Matcha from Guizhou

2.5 呈味氨基酸指紋圖譜

氨基酸組成和含量直接影響抹茶的味覺特征，如鮮味、甜味和苦味。氨基酸的鮮爽味能夠有效降低茶湯的苦澀味，而茶氨酸、谷氨酸和天冬氨酸是構(gòu)成茶葉鮮爽滋味的重要成分[26]。根據(jù)水解氨基酸的呈味特質(zhì)，可以分為三類：一是鮮味氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、茶氨酸；二是苦味氨基酸：異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和纈氨酸；三是甜味氨基酸：絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸和蘇氨酸[27]。

由圖6 可知，貴州抹茶的呈味氨基酸組成一致，含量因為茶葉個體差異而出現(xiàn)顯著性差異；其中鮮味氨基酸的占比最大，直接證明了氨基酸是導致抹茶鮮爽滋味的關(guān)鍵物質(zhì)。同時，谷氨酸的含量最高并且標準偏差較大（0.47%），所以谷氨酸可能是區(qū)分貴州抹茶和其他抹茶的重要指標[24]。6 號抹茶樣和15 號抹茶樣的谷氨酸含量明顯高于其他試樣，由此可推斷這兩個試樣的鮮味更加明顯。此外，日本抹茶的呈味氨基酸的排列順序和貴州抹茶沒有差異但含量明顯高于貴州抹茶，表明日本抹茶更具鮮爽滋味，可能是茶樹品種、遮陰技術(shù)以及生長環(huán)境等存在顯著差異[22]。

圖6 不同抹茶呈味氨基酸指紋圖譜Figure 6 The flavor amino acids fingerprint of different Matcha

3 結(jié)論

測定并制作的抹茶氨基酸指紋圖譜表明茶氨酸和呈味氨基酸可以作為貴州抹茶特征識別的依據(jù)。15 號抹茶總游離氨基酸含量明顯高于其他抹茶，十分接近日本抹茶，適合作為高檔抹茶的原料。貴州抹茶的茶氨酸含量占比高于日本抹茶，揭示其保健性功能可能會更好，在呈味方面也表現(xiàn)出更鮮的特點。后續(xù)需要繼續(xù)擴大樣本量并深入研究抹茶原料品種、遮陰方式、采摘季節(jié)、加工工藝以及存放時間等對氨基酸指紋圖譜的影響，建立互相影響的關(guān)系模型，以便更好地指導高品質(zhì)抹茶的生產(chǎn)。