糧食中黃曲霉毒素的產生機制和檢測方法探究

鄒邵華

（長春市糧油衛(wèi)生檢驗監(jiān)測站，長春 130103）

根據(jù)聯(lián)合國糧農組織統(tǒng)計，黃曲霉是全球谷物最主要的污染真菌之一[1]。黃曲霉毒素（AFT）主要是由黃曲霉和寄生曲霉產生的一類真菌毒素，主要有B1、B2、G1、G2等羥基化代謝產物[2]。其中黃曲霉毒素是黃曲霉產生的最主要的毒素之一，同時具有高致癌性、高毒性，主要存在于玉米、花生等富含脂肪酸的糧食和油料作物中[3]。因此，黃曲霉毒素的防治一直是糧食安全的重要課題。闡述已知的黃曲霉毒素的種類、產生機制，總結了黃曲霉毒素合理的防治手段以及現(xiàn)有的檢測方法，為進一步優(yōu)化黃曲霉毒素的檢測方法，更好保障糧食安全，提供理論基礎。

1 黃曲霉毒素的種類

糧食中常見的目前已發(fā)現(xiàn)鑒定的黃曲霉毒素多達20 余種，包括黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、黃曲霉毒素M1（AFM1）、黃曲霉毒素B2a（AFB2a）、黃曲霉毒素M2（AFM2）、黃曲霉毒素P1（AFP1）、黃曲霉毒素H1、黃曲霉素GM、黃曲霉毒醇等[4]。黃曲霉毒素B1和G1的二氫呋喃環(huán)末端存在雙鍵，因此導致其毒性劇大，微少量便能引發(fā)生物罹患癌癥[5]。其中，黃曲霉毒素B1是最常見的一種，也是毒性最強的一種。

2 黃曲霉毒素的產生機制

黃曲霉毒素是一種由黃曲霉屬真菌產生的毒素，可存在于各種糧食中，包括玉米、小麥、大米、大豆等。黃曲霉毒素的產生是一個復雜的過程，受到多種因素的影響，其產生機制主要包括以下幾個方面。

黃曲霉菌的代謝：黃曲霉菌對高含油量的農作物，如花生、堅果、玉米和棉籽等危害較大。黃曲霉菌和寄生曲霉在代謝過程中會產生多種代謝產物，其中包括污染農產品和食品毒性最大、致癌力最強的一類真菌毒素即黃曲霉毒素[6]。這些代謝產物會隨著真菌的生長而積累，最終導致毒素含量的增加。

環(huán)境因素：黃曲霉毒素的產生與環(huán)境因素密切相關，如光照、溫度、水活度、碳氮源、pH 值及氧化脅迫等。一般來說，黃曲霉毒素的產生需要適宜的溫度和濕度，而特殊波長的光線、較高的pH 值、較低的活性氧水平則會抑制其產生[3]。

真菌感染：黃曲霉菌在糧食中生長時，會通過侵染糧食的表面或內部組織，引起糧食的腐爛和變質。這種真菌感染是黃曲霉毒素產生的前提條件。

糧食的品種和質量：不同品種的糧食對黃曲霉菌的感染和毒素產生的敏感程度不同，同時糧食的質量也會影響黃曲霉毒素的產生。例如，受到損傷或污染的糧食更容易受到黃曲霉菌感染和毒素污染。

3 黃曲霉毒素的危害

黃曲霉毒素對人和動物健康的危害與黃曲霉毒素抑制蛋白質的合成有關，其通過干擾DNA 和RNA 的合成，進而干擾蛋白質的合成，從而導致人和動物全身性的損害。具體表現(xiàn)危害包括：①致癌，黃曲霉毒素可以導致肝癌、結腸癌等多種癌癥，長期暴露于黃曲霉毒素可能會增加罹患癌癥風險；②肝臟損傷，黃曲霉毒素會對肝臟造成損傷，導致肝細胞壞死和肝功能障礙[7]；③神經毒性，黃曲霉毒素會對人體神經系統(tǒng)造成損害，導致頭痛、頭暈、惡心及嘔吐等癥狀；④損害免疫系統(tǒng)，黃曲霉毒素會削弱免疫系統(tǒng)，使人體對病毒和細菌抵抗力下降，更易感染。

4 黃曲霉毒素的防治手段

人們應該避免食用發(fā)霉的糧食，特別是高風險的食品和飼料，如玉米、花生、大米及小麥等。同時，要注意食品和飼料的儲存和保鮮，避免潮濕、高溫和長時間存放。

第一，嚴格控制食品加工過程中的溫度、濕度和pH 值等因素，避免黃曲霉的生長和繁殖。

第二，加強食品衛(wèi)生管理，保持糧油食品加工和儲存環(huán)境的清潔衛(wèi)生，防止黃曲霉的污染。

第三，可采取物理（吸附劑、光、輻射等）或化學方法（氨氣熏蒸法、堿處理、臭氧降解、提取揮發(fā)油等）進行防控[8]。

第四，在食品生產和加工過程中，可添加一些抗菌劑或抗氧化劑等添加劑，以增強食品的抗菌和抗氧化能力，從而減少黃曲霉毒素的產生。

第五，加強食品質量檢測和監(jiān)管，及時發(fā)現(xiàn)和處理黃曲霉毒素污染的食品，保障公眾健康。

5 黃曲霉毒素的檢測方法

依據(jù)真菌毒素的限量標準GB 2761—2017 《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》，我國主要對毒性較強的黃曲霉毒素B1和M1進行了限量要求，其中黃曲霉毒素M1僅對乳和乳制品及嬰幼兒配方食品等特殊膳食食品進行了限量指標要求，均為0.5μg/kg，黃曲霉毒素B1對6 大類食品進行了限量指標要求，其中特殊膳食食品限值最低，為0.5 μg/kg，其它類別的限值在5～20 μg/kg[9]。目前，國內外對黃曲霉毒素的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、光學顯微鏡法、快速檢測卡法。

5.1 高效液相色譜法[10]

該方法利用高效液相色譜儀分離樣品中的黃曲霉毒素，并通過檢測其熒光光譜來定量。高效液相色譜法（HPLC）是國內外使用較多的檢測黃曲霉毒素的方法，具體步驟如下：

樣品制備：取適量待測樣品，加入適量的甲醇或乙醇進行提取，待提取液離心后取上清液，過濾后進行下一步操作。

樣品預處理：將上清液過免疫親和柱進行預處理，去除雜質和干擾物質，使樣品凈化、富集后便于檢測。

樣品分離：將樣品注入高效液相色譜儀中，通過高效液相色譜柱進行分離，分離出黃曲霉毒素和其他成分。

檢測和定量：通過熒光檢測器檢測黃曲霉毒素的濃度，根據(jù)標準曲線進行定量分析。

數(shù)據(jù)分析：將得到的數(shù)據(jù)進行處理和分析，得出樣品中黃曲霉毒素的含量，判斷是否符合相關標準。

在進行HPLC 檢測時，需要使用高純度的甲醇或乙醇，以及高質量的免疫親和柱和色譜柱，以確保檢測結果的準確性和可靠性。同時HPLC 雖然成本低、靈敏度高且應用范圍廣,但需要實驗人員進行復雜的樣品前處理,而且分析方法耗費時間,僅適用于實驗室,不適用于大量樣品現(xiàn)場分析[11]。

5.2 液相色譜串聯(lián)質譜法[12]

液質聯(lián)用技術（LC-MS）是液相色譜與質譜串聯(lián)，將樣品中的黃曲霉毒素提取和初步凈化后，再通過免疫親和柱凈化和富集，凈化液濃縮、定容和過濾后經液相色譜分離后，串聯(lián)質譜檢測，同位素內標法定量。液相色譜串聯(lián)質譜法檢測黃曲霉毒素的方法主要包括以下幾個步驟：

樣品制備：將需要檢測的樣品進行加工，并通過適當?shù)姆椒?，如超聲處理、萃取等，將其中的黃曲霉毒素提取出來，制成待檢測的樣品。

色譜分離：將樣品注入到液相色譜儀中，通過柱子進行分離，將待檢測的黃曲霉毒素與其它物質分離開來。

質譜檢測：將分離后的物質送入串聯(lián)質譜儀中進行檢測。在串聯(lián)質譜儀中，首先對待檢測的物質進行電離，然后通過斷裂、分離等過程對產生的離子進行分析和判定。

數(shù)據(jù)分析：得到質譜數(shù)據(jù)后，通過數(shù)據(jù)分析軟件對信號進行擬合和計算，可以得到黃曲霉毒素的相對分子質量和含量，從而判斷樣品中是否存在黃曲霉毒素，并確定其含量。

液相色譜串聯(lián)質譜法檢測黃曲霉毒素的方法具有檢測速度快、準確性高等優(yōu)點，是目前廣泛應用的一種檢測方法。但需要注意的是，樣品的制備、取樣、儀器操作等都需要高度仔細，以確保數(shù)據(jù)的可靠性。LC-MS 法無需對樣品進行衍生處理，具有分離能力強、靈敏度高、特異性好的特點，能較好滿足食品中AFT 檢測的要求，但要求測試人員必需掌握一定的專業(yè)知識，否則難以操作；高昂的儀器成本和復雜的分析測試決定了檢測通常只能在實驗室中進行，不能滿足現(xiàn)場檢測的要求等制約了其進一步推廣。因此，開發(fā)易操作、低成本、可用于現(xiàn)場檢測真菌毒素的LC-MS 技術已成為未來研究的熱點[13]。

5.3 酶聯(lián)免疫吸附測定法[14]

酶聯(lián)免疫吸附篩查法是以抗原與抗體的特異性反應、酶與底物的特異性反應為基礎，借助酶促反應的放大作用，提高反應的靈敏度來檢測某一特定物質，具有特異性強、靈敏度高等特點[15]。該方法利用特異性抗體與黃曲霉毒素結合，然后通過酶標記反應來檢測樣品中的黃曲霉毒素。

酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是一種常用的黃曲霉毒素檢測方法，其具體步驟如下：

樣品制備：將待測樣品（如食品、飼料等）加入適當?shù)奶崛∫褐校M行樣品制備，得到黃曲霉毒素樣品提取液。

酶標板涂覆：將黃曲霉毒素抗原涂覆在酶標板中，使其產生酶聯(lián)免疫反應。

樣品加入：將樣品提取液加入酶標板中，使黃曲霉毒素與抗體結合。

洗滌：用緩沖液洗滌酶標板，去除非特異性結合物質。

加入檢測抗體：加入與黃曲霉毒素結合的檢測抗體，使其與已結合的黃曲霉毒素形成復合物。

加入酶標記抗體：加入與檢測抗體結合的酶標記抗體，使其與已形成復合物結合。

加入底物：加入底物，使酶標記抗體與底物發(fā)生反應，產生顏色。

讀取結果：用酶標儀讀取吸光度值，根據(jù)標準曲線計算出樣品中黃曲霉毒素的含量。

ELISA 方法可以快速、準確地檢測黃曲霉毒素，但樣品制備、抗體選擇和操作技術等因素可能會影響檢測結果的準確性。因此，在進行檢測時應嚴格按照操作規(guī)程進行，確保檢測結果可靠。

5.4 膠體金快速定量法

該方法利用試樣提取液中黃曲霉毒素B1與檢測條中膠體金微粒發(fā)生成色反應，顏色深淺與試樣中黃曲霉毒素含量相關。用讀數(shù)儀測定檢測條上檢測線和質控線顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和度數(shù)儀內置曲線自動計算出試樣中黃曲霉毒素B1含量[16]。膠體金快速定量法檢測黃曲霉毒素的具體方法如下：

樣品制備：將待檢測樣品取出，如谷物、食品等，將其研磨成細粉末，取約10 g 樣品加入提取液中，震蕩后，靜置過濾。取混合液離心后取上清液加入稀釋緩沖液，充分混勻后待測。

樣品測定：將膠體金檢測條取出，放置至室溫，打開孵育器預熱后，將檢測條放入孵育器中，打開加樣孔。移取待測溶液到加樣孔中，關閉加樣孔和孵育器。孵育后，取出檢測條。觀察檢測條質控線和檢測線顯色情況，確保檢測有效。

需要注意的是，膠體金快速定量法檢測黃曲霉毒素的具體方法可能因不同品牌的檢測卡而有所不同，具體操作步驟以使用說明為準。

5.5 光學顯微鏡法

該方法通過觀察樣品中的黃曲霉菌絲或孢子來判斷樣品中是否存在黃曲霉毒素。

樣品制備：將待測樣品加入生理鹽水或PBS 緩沖液中，使其達到所需濃度。

制備準備：準備好顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸管、移液器等實驗工具。

處理樣品：將樣品加入載玻片上，用吸管將其均勻涂布在玻片上。

固定樣品：將蓋玻片輕輕壓在載玻片上，使樣品均勻分布在載玻片上。

焦距調整：將載玻片放入顯微鏡中，調整焦距，使樣品清晰可見。

觀察樣品：通過顯微鏡觀察樣品，查看是否有黃曲霉毒素的存在。黃曲霉毒素通常呈現(xiàn)為黃色或綠色的熒光。

記錄結果：記錄檢測結果，并根據(jù)樣品濃度和檢測方法進行分析和判斷。

需要注意的是，光學顯微鏡法只能檢測樣品中是否存在黃曲霉毒素，不能確定其具體濃度。因此，建議將其與其它檢測方法結合使用，以獲得更準確的結果。

6 結語

黃曲霉毒素具有強毒性和高致癌性，在保存不當?shù)募Z食作物中易普遍存在，對人體健康存在很大威脅，因此應提高對黃曲霉毒素的重視認識，豐富黃曲霉毒素的防治手段，同時提高糧食作物的存儲條件，增強黃曲霉毒素的檢測方法的研究，高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、膠體金快速定量法和光學顯微鏡法的應用場景和檢測適用條件各有不用，通過研究選用合適的檢測方法，更加全面、多角度維護糧食安全。