桉樹(shù)組培苗生產(chǎn)污染菌的調(diào)查與分析

蔡華杰，黃向東，馬天馳，易潤(rùn)華，何普林*

桉樹(shù)組培苗生產(chǎn)污染菌的調(diào)查與分析

蔡華杰1，黃向東1，馬天馳1，易潤(rùn)華2，何普林1*

（1. 中林集團(tuán)雷州林業(yè)局有限公司，廣東 遂溪 524348；2. 廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)桉樹(shù)組培苗污染菌的種類(lèi)進(jìn)行了調(diào)查，為減少桉樹(shù)組培苗生產(chǎn)污染提供依據(jù)。結(jié)果表明：污染菌主要包括25個(gè)屬50個(gè)種，其中污染細(xì)菌6個(gè)屬7個(gè)種，污染真菌19個(gè)屬43個(gè)種，細(xì)菌、真菌分別占14.0%、86.0%。繼代苗的污染菌主要是麗水黃色桿菌（）和青霉屬（spp.）、曲霉屬（spp.）各5個(gè)種；外植體的污染菌為11屬21個(gè)種的真菌和1個(gè)屬1個(gè)種的細(xì)菌。

桉樹(shù)組培；污染菌；組培苗；形態(tài)學(xué)鑒定；擴(kuò)增子

桉樹(shù)（spp.）集生態(tài)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值于一體[1-4]，在我國(guó)廣東、廣西、福建、云南、海南等?。▍^(qū)）廣泛種植[5]。桉樹(shù)造林用苗主要來(lái)源于種子苗、扦插苗和組培苗，其中以組培苗最常用。

桉樹(shù)組培可在短時(shí)間內(nèi)快速獲得大量無(wú)病種苗，但在生產(chǎn)中常遇到外植體和繼代苗污染的問(wèn)題，嚴(yán)重影響組培苗的生產(chǎn)[6-7]。廣東省湛江市中林集團(tuán)雷州林業(yè)局有限公司在生產(chǎn)桉樹(shù)組培苗時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)污染，影響了種苗的生產(chǎn)效率。為此，文章采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)桉樹(shù)組培苗生產(chǎn)車(chē)間的污染菌進(jìn)行研究，以期為桉樹(shù)組培苗生產(chǎn)減少污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2021年9月—2022年9月，在廣東省湛江市中林集團(tuán)雷州林業(yè)局有限公司林業(yè)科學(xué)研究分公司的桉樹(shù)組培苗生產(chǎn)車(chē)間中收集被污染的組培瓶共107個(gè)。將收集的組培瓶帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行污染菌株的分離、鑒定等研究。

1.2 污染菌的分離

在無(wú)菌環(huán)境下，從桉樹(shù)組培苗生產(chǎn)中污染的組培瓶獲得污染菌，將其接種到PDA培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，并保存在PDA斜面培養(yǎng)基。

1.3 污染菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將保存的菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上，在25 ～ 28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，用LEICA DM750顯微鏡觀察污染菌的形態(tài)特征，鑒定污染菌的種屬。

1.4 污染菌的分子鑒定

將污染菌活化后，采用菌落PCR擴(kuò)增污染菌的基因序列。擴(kuò)增污染真菌的引物為ITS1（TCC GTA GGT GAA CCT GCG G）和ITS4（TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC）[8]。擴(kuò)增污染細(xì)菌的引物為27f（AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG）和1492r（TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T）。PCR反應(yīng)體系采用TaKaRa公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2試劑盒。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行BLAST在線比對(duì)和同源性分析確定污染菌的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 污染菌種的調(diào)查

共分離了107份樣品，其中有3個(gè)組培瓶中的污染菌未分離成功，獲得污染菌株111株，其中真菌99株，細(xì)菌12株。菌株測(cè)序后，在NCBI進(jìn)行BLAST，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定污染菌的種屬。結(jié)果顯示：這111株菌分別屬于15個(gè)目、20個(gè)科、25個(gè)屬、50個(gè)種，其中真菌有9個(gè)目、14個(gè)科、19個(gè)屬、43個(gè)種，細(xì)菌有6個(gè)目、6個(gè)科、6個(gè)屬、7個(gè)種。

間座殼菌屬（spp.）、青霉屬（spp.）、曲霉屬（spp.）和炭疽菌屬（spp.）被鑒定出污染的種的數(shù)量比較多，分別為7、6、5、5個(gè)，鐮刀菌屬（spp.）有3個(gè)種，葉點(diǎn)霉屬（spp.）、枝孢霉屬（spp.）和籃狀菌屬（spp.）各有2個(gè)種，其他屬均出現(xiàn)1個(gè)種（圖1）。

圖1 各屬內(nèi)污染菌種數(shù)量的分布

2.2 污染菌的污染分析

在生產(chǎn)繼代苗的組培瓶中，共鑒定出18個(gè)屬31種污染菌，包括污染細(xì)菌4個(gè)屬、4個(gè)種，污染真菌14個(gè)屬、27個(gè)種，其中曲霉屬和青霉屬分別有5個(gè)種，鐮刀菌屬有3個(gè)種。分離到的真菌煙曲霉（）菌株數(shù)最多，為10株，其次為奧林豪森曲霉（）、橘青霉（）和灰黃青霉（），均分離到5株（表1）。在培養(yǎng)外植體的組培瓶中共鑒定出12個(gè)屬、24個(gè)種的污染菌，包括細(xì)菌2個(gè)屬、3個(gè)種，真菌10個(gè)屬、21個(gè)種，其中，間座殼菌屬有7個(gè)種，炭疽菌屬有5個(gè)種，其他11個(gè)屬各1個(gè)種（表2）。細(xì)菌的2個(gè)屬分別為為水纖細(xì)桿菌屬（spp.）和腸桿菌屬（spp.）。

青霉屬和曲霉屬的真菌僅生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上，在外植體上不生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有接種的空組培瓶中，分離到青霉屬的2個(gè)種和曲霉屬的1個(gè)種，分別為頂青霉（）、灰黃青霉（）和煙曲霉（）。

表1 接種繼代苗組培瓶中的污染菌

表2 接種外植體組培瓶中的污染菌

2.3 主要的污染菌

在生產(chǎn)繼代苗的組培組培瓶中，麗水黃色桿菌出現(xiàn)的污染頻次最高，主要出現(xiàn)在繼代苗的基部，在每次繼代培養(yǎng)時(shí)均有發(fā)現(xiàn)，而且比其他的菌污染更嚴(yán)重。出現(xiàn)污染頻次較高的污染真菌為曲霉屬和青霉屬的真菌，在生產(chǎn)過(guò)程中主要出現(xiàn)在培養(yǎng)基中，其中煙曲霉、橘青霉和灰黃青霉在污染菌中出現(xiàn)的頻率較高，分離率分別為11.7%、5.4%和5.4%。

在培養(yǎng)外植體的組培瓶中共分離到11個(gè)屬、21個(gè)種的真菌，每種真菌出現(xiàn)污染的概率相當(dāng)，除青霉屬和曲霉屬的真菌生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上污染外，其余均在外植體組織上生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致外植體污染。

2.4 主要污染菌的識(shí)別

2.4.1 麗水黃色桿菌

在不同的繼代培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)不同，顏色有橘黃色、乳白色和黑色三種（圖2）。該菌在繼代苗生產(chǎn)車(chē)間常年出現(xiàn)污染，主要出現(xiàn)在繼代苗切口部位或繼代苗與培養(yǎng)基的交界面，引起污染非常嚴(yán)重，有時(shí)繼代接種后，污染瓶中所有的繼代芽基部都長(zhǎng)菌。

2.4.2 曲霉屬

曲霉屬真菌最初生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上，菌落圓形，呈絨毛狀，與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密；菌落擴(kuò)展速度快，蔓延至繼代苗上生長(zhǎng)，后期覆蓋整個(gè)培養(yǎng)基，菌落表面有粉狀物。從污染組培瓶共鑒定出曲霉5種，分別為桉樹(shù)生曲霉（）、煙曲霉（）、黑曲霉（）、奧林豪森曲霉（）和爪甲曲霉（）（圖3），其中煙曲霉污染最嚴(yán)重，占曲霉污染的54.2%。

2.4.3 青霉屬

青霉屬真菌在組培瓶中初期形成小、灰綠色的菌落，菌落表面密氈狀或松絮狀，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，菌落擴(kuò)增速度慢，后期菌落表面布滿(mǎn)粉狀物。污染菌與繼代苗接觸后不在繼代苗上生長(zhǎng)，共鑒定出6種青霉屬真菌，分別為橘青霉（）、頂青霉（）、灰黃青霉（）、鮮紅青霉（）、草酸青霉（）和白色青霉菌（）（圖4），其中橘青霉和灰黃青霉污染的頻率最高，各占青霉污染菌的37.5%。

圖2 麗水黃色桿菌在不同繼代培養(yǎng)基的菌落形態(tài)

A：桉樹(shù)生曲霉；B：煙曲霉；C：爪甲曲霉；D：奧林豪森曲霉；E：黑曲霉。A: Aspergillus eucalypticola; B: A. fumigatus; C: A. unguis; D: A. oerlinghausenensis; E: A. niger.

A：橘青霉；B：頂青霉；C：灰黃青霉；D：草酸青霉；E：白色青霉菌。A: Penicillium citrinum; B: P. corylophilum; C: P. griseofulvum; D: P. oxalicum; E: P. albidum.

2.4.4 青霉與曲霉的形態(tài)

曲霉屬的污染菌分生孢子梗頂端膨大成頂囊，上生初生小梗和次生小梗，次生小梗上形成圓形分生孢子（圖5A）。青霉屬污染菌的分生孢子梗頂端不膨大，多次分枝后產(chǎn)生幾輪對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)的小梗，小梗上產(chǎn)生圓形分生孢子，形成帚狀分生孢子頭（圖5B）。

A：煙曲霉；B：灰黃青霉；標(biāo)尺=10 μm。A: A. fumigatus; B: P. griseofulvum; scale bars=10 μm.

2.4.5 間座殼菌屬和炭疽菌屬的形態(tài)

間座殼菌屬的有性階段在污染菌中未發(fā)現(xiàn)，該屬無(wú)性型的孢子主要有α，β和γ三種類(lèi)型的分生孢子，以穿透間座殼菌（）為例，其α型分生孢子線型，彎曲，β型分生孢子梭形（圖6 A），γ型未發(fā)現(xiàn)。炭疽菌屬的污染菌在PDA培養(yǎng)基上主要形成分生孢子，以暹羅炭疽菌（）為例，其分生孢子長(zhǎng)圓圓筒形，單胞，無(wú)色，有油滴（圖6 B）。

A：穿透間座殼菌的分生孢子；B：暹羅炭疽菌的分生孢子；標(biāo)尺=10 μm。A:Conidia of D. penetriteum; B: Conidia of C. siamense; scale bars=10 μm.

3 討論與結(jié)論

通常引起植物組培污染的微生物有病毒、細(xì)菌、酵母和真菌等，此次調(diào)查在桉樹(shù)組培苗生產(chǎn)中出現(xiàn)的污染物主要是真菌和細(xì)菌，未發(fā)現(xiàn)病毒、酵母和螨蟲(chóng)等污染。本研究共鑒定出25個(gè)屬50個(gè)種的微生物，包括6個(gè)屬7個(gè)種的細(xì)菌和19個(gè)屬43個(gè)種的真菌。LEIFERT等[9]報(bào)道植物組織快繁的污染細(xì)菌主要有不動(dòng)桿菌屬（spp.）、農(nóng)桿菌屬（spp.）、芽孢桿菌屬（spp.）、棒狀桿菌屬（spp.）、桿菌屬（spp.）、歐文氏桿菌屬（spp.）、黃桿菌屬（spp.）、微球菌屬（spp.）、假單胞桿菌屬（spp.）、葡萄球菌屬（spp.）和黃單胞桿菌屬（spp.）；污染真菌有紅酵母屬（spp.）、假絲酵母屬（spp.）、鐮刀菌屬、脈孢菌屬（spp.）、曲霉屬、微孢菌屬（spp.）、枝孢霉菌屬（spp.）和瓶霉屬（spp.），其中腸桿菌屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、枝孢霉菌屬的微生物在調(diào)查中也出現(xiàn)，但在桉樹(shù)組培苗生產(chǎn)中的污染菌更為復(fù)雜，種類(lèi)更多。

桉樹(shù)組培繼代苗污染的細(xì)菌主要來(lái)自環(huán)境而非植物內(nèi)生菌，污染真菌主要來(lái)自外界環(huán)境。由于外在的細(xì)菌污染出現(xiàn)比較早，一般外植體或繼代苗培養(yǎng)2 ～ 3 d后即出現(xiàn)濕潤(rùn)的菌落，植物內(nèi)生性污染細(xì)菌在外植體培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間后出現(xiàn)的濕潤(rùn)菌落。組培桉樹(shù)會(huì)隨著環(huán)境溫度和濕度、操作人員的不同而出現(xiàn)不同程度的污染[10]。本研究發(fā)現(xiàn)馬氏水纖細(xì)桿菌和陰溝腸桿菌兩種細(xì)菌在培養(yǎng)1 ～ 2 d后外植體和繼代苗組培瓶中出現(xiàn)，多數(shù)生長(zhǎng)與培養(yǎng)基接觸的部位。馬氏水纖細(xì)桿菌和陰溝腸桿在自然界和水體中廣泛分布[11-12]，繼代苗或外植體被污染可能發(fā)生在剪取繼代苗或外植體消毒的過(guò)程中。

污染桉樹(shù)外植體的主要是真菌。在接種桉樹(shù)外植體的污染瓶中共鑒定出13屬23個(gè)種的真菌，占鑒定出污染菌種類(lèi)的84.6%。污染桉樹(shù)組培苗的曲霉屬、曲霉屬和枝孢霉菌屬真菌主要來(lái)自空氣，是常見(jiàn)的空氣污染菌[13]。污染桉樹(shù)外植體的真菌分別屬于間座殼菌屬（spp.）、炭疽菌屬（spp.）、假斜孔口菌屬（spp.）、葉點(diǎn)霉屬（spp.）、新殼梭孢屬（spp.）、毛色二孢屬（spp.）和葡萄座腔菌屬（spp.），它們都是一些植物的病原菌或內(nèi)生真菌[14]，這些真菌污染主要是外植體選取不合適或外植體消毒不徹底而造成。

影響植物組培污染的因素有季節(jié)變化、培養(yǎng)室溫、濕度及衛(wèi)生狀況、操作人員技術(shù)、器械的滅菌和外植體等。本研究發(fā)現(xiàn)污染桉樹(shù)組培苗生產(chǎn)的外在因素有培養(yǎng)室的環(huán)境、組培操作車(chē)間的衛(wèi)生狀況、器具的消毒和操作人員的熟練程度；內(nèi)在因素有采集外植體帶菌較多。因此，需注意選擇帶菌少的外植體、做好接種器械滅菌和培養(yǎng)環(huán)境消毒，接種時(shí)嚴(yán)格按無(wú)菌操作規(guī)程，減少桉樹(shù)組培中的污染。

[1] 梁學(xué)明,楊永忠,杜鹍鵬,等.湛江市雷林桉樹(shù)人工林生態(tài)價(jià)值估算量化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2021,49(14): 101-105,109.

[2] 任世奇,羅建中,彭彥,等.桉樹(shù)無(wú)性系的單板出材率與價(jià)值研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(6):46-54.

[3] 郭樂(lè)東,周毅,鐘錫均,等.西江流域桉樹(shù)生態(tài)系統(tǒng)碳貯量與碳匯功能經(jīng)濟(jì)價(jià)值評(píng)價(jià)[J].廣東林業(yè)科技,2009,25(6): 8-13.

[4] 謝耀堅(jiān).桉樹(shù)的園林觀賞價(jià)值[J].桉樹(shù)科技,2005(1):1-6.

[5] 王永忠,杜阿朋.廣東省桉樹(shù)人工林固碳釋氧價(jià)值核算[J].桉樹(shù)科技,2020,37(1):36-38.

[6] LE ROUX J J, VAN STADEN J. Micropropagation and tissue culture of—a review[J]. Tree Physiology, 1991, 9(4): 435-477.

[7] GUPTA N P, JAIN V, JOSEPH M, et al. A review on micropropagation culture method[J]. Asian Journal of Pharmaceutical Research and Development, 2020，8(1): 86-93.

[8] WHITE T J, BRUNS T, LEE S, et al. Amplification and irect sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//PCR Protocols: A guide to methods and applications. New York, America: Academic Press Inc, 1990: 315-322.

[9] LEIFERT C, RITCHIE J Y, WAITES W M. Contaminants of plant-tissue and cell cultures[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1991, 7(4): 452-469.

[10] 謝穎苑,廖飛揚(yáng),李天卓,等.桉樹(shù)組培廠季節(jié)性污染及防控[J].綠色科技,2015(1): 34-35.

[11] LAU H T, FARYNA J, TRIPLETT E W. Aquitalea magnusonii gen. nov., sp. nov., a novel Gram-negative bacterium isolated from a humic lake[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2006, 56(4): 867-871.

[12] MEZZATESTA M L, GONA F, STEFANI S. Enterobacter cloacae complex: clinical impact and emerging antibiotic resistance[J]. Future Microbiology, 2012, 7(7): 887-902.

[13] KUMAR P, KAUSAR M A, SINGH A B, et al. Biological contaminants in the indoor air environment and their impacts on human health[J]. Air Quality, Atmosphere and Health, 2021, 14(11): 1723-1736.

[14] LUCAS J A. Plant pathology and plant pathogens[M]. 4th edition.Wiley-Blackwell, 2020.

Investigation and Analysis of Contaminant Microorganisms in Eucalypt Tissue Culture Seedling Production

CAI Huajie1, HUANG Xiangdong1, MA Tianchi1, YI Runhua2, HE Pulin1*

(1. Leizhou Forestry Bureau Co., Ltd of China Forestry Group, Suixi 524348, Guangdong, China;2. College of Coastal Agriculture Sciences, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, Guangdong, China)

Species of contaminated bacteria found in eucalypt tissue cultures were investigated by morphological and molecular biology methods in order to potentially reduce the incidence of deleterious contamination of such cultures. In total 50 species representing 25 genera of microorganism were identified from tissue culture bottles, including 7 species from 6 genera of bacteria along with 43 species from 19 genera of fungi, equating to 14.0% of contaminants being bacteria and 86.0% being fungi. Eucalypt subculture seedlings were mainly contaminated byalong withspp. andspp. each with 5 species. Later after transplanting, it was found that eucalypt explants were contaminated by 21 species representing 11 genera of fungi and 1 species of bacteria.

eucalypt tissue culture; pollutant bacteria; tissue culture seedlings; morphological; amplicon

10.13987/j.cnki.askj.2023.04.005

Q93-331

A

蔡華杰（1972— ），男，政工師，從事森林資源培育。E-mail: 2259787650@qq.com

何普林（1974— ），男，大學(xué)本科，林業(yè)高級(jí)工程師，從事森林資源培育。E-mail: honglin923@sohu.com