局部應(yīng)用傅山風(fēng)濕外治方對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠炎性細(xì)胞因子和Notch2通路的影響＊

高玉亭，李 振，趙彩虹，趙雨薇，王 澤，郝慧琴

（山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 晉中 030619）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其特征是炎癥、腫脹和關(guān)節(jié)破壞，主要影響外周關(guān)節(jié)[1]。治療RA 的傳統(tǒng)藥物主要有非甾體抗炎藥和改善病情的抗風(fēng)濕藥物等。目前用于治療RA 的藥物價(jià)格昂貴，并且經(jīng)常對(duì)患者的健康造成不利影響，迫切需要通過更加安全、有效和廉價(jià)的治療方法應(yīng)用于RA 治療，而針對(duì)RA 炎癥的局部應(yīng)用藥物是潛在的治療方法[2]。中醫(yī)藥在RA 治療中具有巨大的潛力，局部使用中藥膏劑用于治療關(guān)節(jié)炎等肌肉骨骼損傷和疼痛有著悠久的歷史并廣泛應(yīng)用于臨床[3-4]。

傅山風(fēng)濕外治方來源于清代山西名醫(yī)傅山《大小諸證方論》，由牛皮膠、天南星、生姜、羌活、乳香和沒藥6 味藥組成，具有祛風(fēng)勝濕、散寒止痛、活血消腫等功效，局部應(yīng)用于治療“痹證”[5]。課題組前期研究結(jié)果顯示，傅山風(fēng)濕外治方對(duì)RA 的治療作用可能與抑制Notch1/Jagged1 通路激活，調(diào)節(jié)Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡有關(guān)[6]，但其對(duì)Notch2/DLL1 通路的影響尚不明確。Notch2 調(diào)控破骨細(xì)胞生成介導(dǎo)RA 骨破壞，而RA 以慢性炎癥和關(guān)節(jié)破壞為主要特征，因此，本研究探討局部應(yīng)用傅山風(fēng)濕外治方對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（Collagen-induced arthritis，CIA）大鼠炎性細(xì)胞因子和Notch2 表達(dá)的影響，以期為局部應(yīng)用傅山風(fēng)濕外治方治療RA提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.2 傅山風(fēng)濕外治方外治方的制備

黃明膠（Cat. No.1812001）購(gòu)自東阿阿膠股份有限公司，天南星（Cat. No.180101）和羌活（Cat. No.181101）購(gòu)自山西元和堂中藥有限公司，乳香（Cat.No.18180405402）購(gòu)自河北百合中藥飲片有限公司，沒藥（Cat. No.465180701）購(gòu)自安國(guó)市遠(yuǎn)元藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定質(zhì)量符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)。將以上藥物冷凍干燥后分別使用粉碎機(jī)粉碎30 s，過80目篩后按4∶1∶1∶1∶1比例混合。生姜購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)鑒定質(zhì)量符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)，清洗后在攪拌機(jī)中磨碎，3000 r·min-1離心20 min，取上清。將獲得的生姜汁加入前述混合物中，85℃下以300 r·min-1轉(zhuǎn)速攪拌20 min，常溫下繼續(xù)攪拌至冷卻得到膏劑，濃度為1 g·mL-1

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原（Cat. No. 20022）購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司；完全/不完全弗氏佐劑（Cat. No. F5881、F5506）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）和干擾素-γ（Interferon- γ，IFN- γ）ELISA 試劑盒（Cat. No.E02T0008, E02I0006, E02I0309, E02I0345）購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒（Cat. No.9108）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Cat. No. RR047A）和熒光定量試劑盒（Cat. No. 639676）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Notch2 抗體（Cat. No. bs-21664R）、核因子-κBp65（nuclear factor-κBp65，NF-κBp65）抗體（Cat.No. Bioss bs-0465R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，Delta-like 配體蛋白1（delta-like ligand protein-1，DLL1）抗體（Cat. No. A14277）購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司，GAPDH 抗體（Cat. No. ab181602）購(gòu)自Abcam 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（Cat. No. SE134）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Cat. No.PC0020）、ECL 顯色液（Cat. No. PE0010）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，ALT）、血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（Creatinine，Cr）測(cè)定試劑盒（Cat. No.C010-2-1、C009-2-1、C013-2-1、C011-2-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

正置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf股份公司，熒光定量PCR 儀購(gòu)自新加坡Life Technologie 公司；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 CIA大鼠模型構(gòu)建、分組和給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將36 只大鼠隨機(jī)分為正常組10 只和造模組26 只。CIA 大鼠模型構(gòu)建參考已有方法進(jìn)行[7]，簡(jiǎn)而言之，按1∶1 將牛Ⅱ型膠原溶液和完全弗氏佐劑混合并乳化，按每只5 mL在大鼠尾跟和背部進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射。第7 天，將弗氏完全佐劑替換成不完全弗氏佐劑，按每只0.3 mL 腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。第14天，對(duì)造模組大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分[8]，評(píng)分≥4分則判定為造模成功用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9]。將造模成功的20 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法平均分為模型組和傅山風(fēng)濕外治方組各10 只。第14 天，將0.4 mL（根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算）傅山風(fēng)濕外治方藥膏均勻涂抹于大鼠踝關(guān)節(jié)，覆蓋紗布并使用塑料薄膜固定以防止被大鼠舔食。正常組和模型組給予等體積生理鹽水局部涂抹。每天更新2次，連續(xù)使用42天。

1.5 標(biāo)本采集

第56天，大鼠禁食過夜，3%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3000 r·min-1離心10 min，收集血清。取左踝關(guān)節(jié)滑膜組織液氮凍存，右踝關(guān)節(jié)、肝和腎組織4%多聚甲醛固定，取脾臟凍存。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分

2.4 王屋鎮(zhèn)各樹種的保護(hù)級(jí)別 王屋鎮(zhèn)古樹名木一級(jí)古樹21株，所占比例為22.3%；二級(jí)古樹48株，所占比例為51.1%；三級(jí)古樹25株，所占比例為26.6%(表4)。

第14天開始每周進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，評(píng)分于給藥前實(shí)施。由非實(shí)驗(yàn)參與人員通過視覺檢查大鼠四肢關(guān)節(jié)的腫脹程度評(píng)估關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]為：0分：無關(guān)節(jié)紅腫；1分：踝關(guān)節(jié)或足趾的輕度紅腫；2 分：踝關(guān)節(jié)的中度紅腫；3 分：包括趾關(guān)節(jié)在內(nèi)的全足明顯紅腫；4 分：全足明顯紅腫伴關(guān)節(jié)變形、功能障礙。評(píng)分最高為16分。

1.6.2 HE 染色檢測(cè)大鼠踝關(guān)節(jié)、肝和腎組織病理學(xué)變化

4%多聚甲醛固定大鼠踝關(guān)節(jié)（10% EDTA 脫鈣5 周）、肝和腎組織，脫水透明后石蠟包埋，切成4 μm薄片，將切片進(jìn)行HE 染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。采用盲法對(duì)踝關(guān)節(jié)H&E 染色進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]為：0 分：正常踝關(guān)節(jié)；1 分：正常滑膜，偶見單核細(xì)胞；2分：明確關(guān)節(jié)炎，滑膜襯里細(xì)胞幾層扁圓形，單個(gè)核細(xì)胞散在分布，單核細(xì)胞密集浸潤(rùn)；3分：滑膜明顯增生，3層以上內(nèi)襯細(xì)胞層排列松散，單核細(xì)胞密集浸潤(rùn)；4分：嚴(yán)重滑膜炎伴血管增生，關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨質(zhì)侵蝕。

1.6.3 ELISA 檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ水平變化

分別設(shè)置空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣本孔，分別加入100 μL樣品。在各孔中加入酶標(biāo)記溶液50 μL，密封后37℃孵育反應(yīng)1 h。各孔依次加入顯色劑A、B 50 μL，25℃避光反應(yīng)10 min，加入終止液50 μL，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6.4 qRT-PCR 檢測(cè)大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟組織Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平變化

使用Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)Notch2、DLL1、NF-κBp65和β-actin基因引物并合成（表1）。提取大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織和脾臟總RNA 并檢測(cè)其濃度和純度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件37℃ 15 min，85℃ 5 s。qRT-PCR 檢測(cè)Notch2、DLL1、NF-κBp65mRNA 水平，20 μL 反應(yīng)體系包括qPCR 預(yù)混液Mix 10 μL、正反向引物各0.5 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 7.0 μL，反應(yīng)程序：95℃ 10 s，95℃5 s，60℃ 25 s，45 個(gè)循環(huán)。將基因表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為肌動(dòng)蛋白基因，并使用2－△△Ct分析方法進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6.5 Western blot 檢測(cè)大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟組織Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白表達(dá)水平變化

提取大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織和脾臟組織總蛋白，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取20 μg 蛋白上樣，SDS-PAGE 電泳，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Notch2（1∶1000）、DLL1（1∶1000）、NF-κBp65（1∶1000）和GAPDH（1∶3000）一抗4℃孵育過夜。加入二抗（1∶3000）室溫孵育1 h，ECL 顯色液顯色并曝光拍照。使用Gelpro32軟件測(cè)定目標(biāo)條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟組織Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白陽(yáng)性表達(dá)變化

將固定的踝關(guān)節(jié)修剪、脫鈣、脫水處理，石蠟包埋，切成4 μm 薄片。切片烘干并脫蠟脫水處理后，在高溫高壓下使用枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)3 min。室溫下山羊血清封閉液封閉20 min 后，加入Notch2（1∶100）、DLL1（1∶100）、NF-κBp65（1:200）一抗，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。滴加二抗，37℃恒溫20 min。滴加DAB顯色液進(jìn)行顯色。使用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1 min，脫水透明，使用中性樹膠封片。使用顯微鏡觀察并拍照。Image J 軟件統(tǒng)計(jì)免疫組化陽(yáng)性區(qū)域比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6.7 大鼠肝腎功能水平變化檢測(cè)

按照試劑盒說明書，檢測(cè)各組大鼠血清肝功能ALT、AST水平變化情況及腎功能BUN、Cr水平變化情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，如果符合正態(tài)分布，采用雙因素方差分析統(tǒng)計(jì)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD 法進(jìn)行多重比較，方差不齊時(shí)則采用Tamhance’s T2 法進(jìn)行多重比較。如果不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分變化

大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分結(jié)果顯示（表2），第14天，模型組和傅山風(fēng)濕外治方大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分顯著高于正常組，評(píng)分均大于4 分，表明CIA 大鼠模型構(gòu)建成功。第14-42 天，傅山風(fēng)濕外治方組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分與模型組相比無顯著差異（P>0.05）。第49-56天，傅山風(fēng)濕外治方組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分顯著低于模型組（P<0.05，P<0.01）。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分變化（±s，n=10）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分變化（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風(fēng)濕外治方組第14天0.00±0.00 5.50±2.66##8.17±1.47第21天0.00±0.00 6.50±2.88##6.83±2.14第28天0.00±0.00 7.33±3.20##6.67±2.94第35天0.00±0.00 8.33±3.72##7.33±2.73第42天0.00±0.00 8.17±2.86##6.33±2.42第49天0.00±0.00 10.17±1.94##6.50±3.83*第56天0.00±0.00 9.67±2.94##5.17±5.17**

2.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)變化

通過HE 染色對(duì)各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)的評(píng)估表明，與正常組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞增加，滑膜細(xì)胞增生，關(guān)節(jié)軟骨被侵蝕且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，傅山風(fēng)濕外治方組大鼠異常明顯減輕（圖1）。病理學(xué)評(píng)分結(jié)果表明（表3），與正常組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)評(píng)分顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風(fēng)濕外治方大鼠大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)評(píng)分顯著降低（P<0.01）。

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)評(píng)分及血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ表達(dá)水平變化（±s，n=10，pg·mL-1）

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)評(píng)分及血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ表達(dá)水平變化（±s，n=10，pg·mL-1）

注：與正常組相比， ##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風(fēng)濕外治方組滑膜病理學(xué)評(píng)分0.00±0.00 2.80±0.52##1.35±0.28**TNF-α 1.61±0.11 6.18±0.25##2.68±0.14**IL-6 1.15±0.05 81.40±4.54##18.82±0.74**IL-17 2.50±0.13 8.82±0.60##5.14±0.15**IFN-γ 1.41±0.11 10.64±0.36##3.38±0.12**

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ 表達(dá)水平變化

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示（表3），與正常組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風(fēng)濕外治方組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。

2.4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1 和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平變化

qRT-PCR 結(jié)果顯示（表4），與正常相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟組織中Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA的表達(dá)顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風(fēng)濕外治方組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟組織中Notch2、DLL1和NF-κBp65mRNA的表達(dá)顯著降低（P<0.01）。

表4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平（±s，n=10）

表4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風(fēng)濕外治方組關(guān)節(jié)脾臟NF-κBp65 1.00±0.00 4.26±0.03##0.84±0.06**Notch2 1.00±0.00 4.17±0.06##1.51±0.19**DLL1 1.00±0.00 2.35±0.11##1.40±0.07**NF-κBp65 1.00±0.00 3.52±0.37##1.85±0.14**Notch2 1.00±0.00 4.22±0.30##1.02±0.08**DLL1 1.00±0.00 2.43±0.04##0.87±0.04**

2.5 各大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1 和NFκBp65蛋白表達(dá)水平變化

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2 和表5），與正常組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟組織中Notch2、DLL1 和NF-κBp65 蛋白的表達(dá)顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風(fēng)濕外治方組大鼠踝滑膜關(guān)節(jié)和脾臟組織中Notch2、DLL1 和NF-κBp65 表達(dá)顯著降低（P<0.01）。

圖2 各大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白表達(dá)水平

表5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 蛋白表達(dá)水平（±s，n=10）

表5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 蛋白表達(dá)水平（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風(fēng)濕外治方組關(guān)節(jié)脾臟NF-κBp65 0.77±0.24 1.21±0.18##0.16±0.05**Notch2 0.58±0.30 2.31±0.59##0.80±0.06**DLL1 0.98±0.21 3.87±0.27##2.00±0.06**NF-κBp65 0.83±0.22 1.26±0.28##0.24±0.09**Notch2 0.82±0.19 2.74±0.06##1.20±0.06**DLL1 0.67±0.61 1.79±0.04##0.28±0.01**

2.6 各組大鼠踝關(guān)節(jié)Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫組織化學(xué)分析

免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示（圖3 和表6），正常組、模型組、傅山風(fēng)濕外治方組大鼠踝關(guān)節(jié)成纖維滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等均有不同程度的Notch2、DLL1 和NFκBp65 陽(yáng)性表達(dá)。與正常組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)Notch2、DLL1 和NF-κBp65 陽(yáng)性表達(dá)增多（P<0.01）。與模型組相比，傅山風(fēng)濕外治方組大鼠踝關(guān)節(jié)Notch2、DLL1和NF-κBp65陽(yáng)性表達(dá)減少（P<0.01）。

圖3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)Notch2、DLL1和NF-κBp65 免疫組化代表性圖像（×100）

表6 各組大鼠踝關(guān)節(jié)Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫組化分析（±s，n=10）

表6 各組大鼠踝關(guān)節(jié)Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫組化分析（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

NF-κBp65 3.59±0.49 40.82±2.12 ##28.13±3.20**組別正常組模型組傅山風(fēng)濕外治方組Notch2 1.39±0.16 31.26±1.91##13.77±1.60**DLL1 3.14±0.66 41.60±2.10 ##19.38±1.10**

2.7 各組大鼠肝腎組織病理學(xué)和血清AST、ALT、BUN、Cr水平

肝腎組織病理學(xué)結(jié)果表明（圖4），模型組和傅山風(fēng)濕外治方組大鼠的肝腎組織均未見明顯的病理?yè)p傷。血清AST、ALT、BUN和Cr水平檢測(cè)結(jié)果表明（表7），傅山風(fēng)濕外治方組大鼠血清AST、ALT、BUN和Cr無顯著變化（P>0.05）。

表7 各組大鼠血清AST、ALT、BUN、Cr水平（±s，n=10）

表7 各組大鼠血清AST、ALT、BUN、Cr水平（±s，n=10）

組別正常組模型組傅山風(fēng)濕外治方組AST（U·L-1）43.74±3.06 42.90±3.56 43.84±3.97 ALT（U·L-1）186.75±18.10 181.81±23.83 187.14±29.25 BUN（mmol·L-1）5.44±0.69 5.60±0.64 5.56±0.72 Cr（mmol·L-1）0.12±0.02 0.11±0.05 0.12±0.05

3 討論

傅山風(fēng)濕外治方包括牛皮膠、天南星、生姜、羌活、乳香和沒藥等藥味，具有祛風(fēng)勝濕、散寒止痛、活血消腫等功效。牛皮膠屬于皮膠類藥物，主要偏于外用，主要成分為明膠[11]。明膠作為一種變性膠原蛋白，已被證明是一種有吸引力的藥物載體材料[12]。膠原蛋白經(jīng)酶水解后被吸收并分布到關(guān)節(jié)組織，具有鎮(zhèn)痛和抗炎特性[13]。天南星含有類黃酮成分，具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[14]。生姜及其主要成分酚類化合物具有抗氧化和抗炎活性[15]。羌活被廣泛用于RA 治療，主要含有香豆素和酚酸類化合物，具有鎮(zhèn)痛和抗炎活性[16]。乳香和沒藥作為經(jīng)典藥對(duì)，具有協(xié)同抗炎、鎮(zhèn)痛及促進(jìn)透皮等作用[17]。本研究表明，傅山風(fēng)濕外治方降低了CIA 大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分和病理學(xué)評(píng)分，減少了關(guān)節(jié)損傷，緩解了CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，說明傅山風(fēng)濕外治方各味藥共同發(fā)揮了對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用。

慢性炎癥是RA 的重要病理特征，炎性細(xì)胞因子在RA 中的表達(dá)水平與RA 患者慢性滑膜炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[18]。TNF-α、IL-6 和IFN-γ 炎性細(xì)胞因子滲入滑膜中將促進(jìn)炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[19]。而IL-17 會(huì)刺激RA 滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，引發(fā)RA 的骨侵蝕和組織破壞[20]。因此，抑制炎性細(xì)胞因子將有助于改善RA 的炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞。本研究對(duì)血清炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)傅山風(fēng)濕外治方降低了炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，表明傅山風(fēng)濕外治方對(duì)RA的治療作用可能與其抗炎作用有關(guān)。

RA 的關(guān)節(jié)損傷往往和破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)密切相關(guān)，Notch2 被認(rèn)為是RA 破骨細(xì)胞活化的重要效應(yīng)分子，Notch2/DLL1 軸對(duì)破骨細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)可能是改善RA患者骨侵蝕的重要靶點(diǎn)[21]。同時(shí)，炎性細(xì)胞因子促進(jìn)了Notch2 的表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的Notch2激活依賴于NF-κBp65與啟動(dòng)子之間的直接相互作用[22]。在炎癥環(huán)境中，Notch2 與NF-κB 和炎性細(xì)胞因子形成正反饋，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性、促進(jìn)骨侵蝕、導(dǎo)致骨破壞[23]。因此，本研究重點(diǎn)從Notch2信號(hào)通路對(duì)傅山風(fēng)濕外治方的治療機(jī)制進(jìn)行了探討。本研究中，CIA 大鼠Notch2/DLL1 軸異常激活，NFκBp65 表達(dá)升高，而傅山風(fēng)濕外治方治療降低了Notch2、DLL1和NF-κBp65在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)，表明傅山風(fēng)濕外治方可能通過抑制Notch2/DLL1軸在RA 中的激活，阻斷Notch2 與NF-κB 和炎性細(xì)胞因子的正反饋，發(fā)揮了對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用。此外，傅山風(fēng)濕外治方的安全性缺乏客觀證據(jù)，因此本研究主要通過檢測(cè)對(duì)肝腎功能的影響進(jìn)一步探討了其安全性，結(jié)果表明對(duì)肝腎無毒副作用。

綜上，傅山風(fēng)濕外治方可緩解CIA 大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀，減輕關(guān)節(jié)損傷，且對(duì)肝腎無毒副作用，其機(jī)制可能與降低炎性細(xì)胞因子，下調(diào)Notch2、DLL1 和NFκBp65的表達(dá)有關(guān)。但由于目前尚無公認(rèn)的用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的外用藥物，本研究未設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組。此外，本研究未能完全闡明傅山風(fēng)濕外治方對(duì)炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)是否與Notch2/DLL2 軸以及NFκBp65 的協(xié)同作用有關(guān)，其相互作用和具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。本研究為傅山風(fēng)濕外治方治療RA 提供了研究基礎(chǔ)和思路，也為RA 外用藥物的發(fā)掘提供了參考，然而傅山風(fēng)濕外治方作為一種治療RA 的外用藥物在臨床的應(yīng)用和推廣仍然需要更深入的基礎(chǔ)和臨床研究。