周怡錦,田新磊,祝志朋,趙文錦,朱 珊
(河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院) 鄭州 450053)
反復呼吸道感染(Recurrent respiratory tract infection,RRTI)是兒童和青少年最常見的疾病之一,多發(fā)生于5 歲以下兒童,占所有兒科呼吸道感染的10%-30%,其病理和病因機制復雜[1]。臨床上認為,該病的發(fā)病與免疫功能障礙、維生素缺乏、營養(yǎng)不良、微生物感染和護理不當有關。在大多數(shù)情況下,呼吸道感染發(fā)展迅速,兒童通常有典型的癥狀,如打噴嚏和咳嗽、流鼻涕和充血、發(fā)燒,這些癥狀隨年齡而異。除上述癥狀外,RRTI通常伴有面黃消瘦、食欲不振等癥狀,如不及時采取有效措施,還可能引發(fā)心肌炎、哮喘等疾病,嚴重影響兒童的身體發(fā)育和健康[2]。RRTI免疫缺陷的兒童可以通過抗體替代療法治療,但費用巨大[3]。因此,為RRTI 開發(fā)安全、有效和負擔得起的藥物是當務之急。
中醫(yī)經(jīng)過2000多年的發(fā)展,形成了從診斷到預后的完整保健體系,為臨床應用和醫(yī)學研究積累了寶貴的經(jīng)驗。中醫(yī)藥的功效已被越來越多的人和國家所認可,世界多個國家進行了中醫(yī)藥緩解癥狀功效的研究[4]。研究表明,中藥可以降低RRTI 的發(fā)生率,顯著改善RRTI 的臨床癥狀[5]。中醫(yī)藥有效治療RRTI 一直是許多研究人員和兒科專家關注的焦點。益正方主要由黃芪、茯苓、清半夏、川芎、炒雞內(nèi)金、甘草、西洋參、五味子、醋鱉甲、砂仁等中藥組成,已被證實是治療RRTI的有效方藥,且療效顯著[6]。
本課題結合臨床癥狀,制備RRTI 大鼠模型,擬通過不同劑量的益正方治療,并以玉屏風散(治療呼吸道疾病的重要湯劑)[7]為對照,通過評價益正方對RRTI模型的療效,并探討了中醫(yī)藥治療RRTI 的作用機制,以為益正方改善RRTI提供新思路。
益正方:黃芪、茯苓、清半夏、川芎、炒雞內(nèi)金、甘草、西洋參、五味子、醋鱉甲、砂仁等中藥組成;玉屏風散:由黃芪、防風和白術組成。均經(jīng)河南中醫(yī)院大學第二附屬醫(yī)院的藥劑科制備形成混懸液。益正方濃度為2 g生藥·mL-1;玉屏風散的濃度為1.5 g生藥·mL-1。
IL-6 ELISA 試劑盒(EK0412)、TNF-β ELISA 試劑盒(EK0584)和IL-10 ELISA(EK0418)試劑盒均獲自武漢BOSTER;HE 染色試劑盒(C0105M)、PAS 染色試劑盒(C0142M)、TUNEL 凋亡試劑盒(熒光法,QIA39)均獲自美國Merck-Calbiochem;一抗Caspase-1(ab179515)、GSDMD(ab219800)、IL-1β(ab216995)、HMGB1(ab18256)、TLR4(ab218987)、p-NF-κB p65(ab239882)和β-actin(ab8226)均獲自英國Abcam。
SPF 級別1 月齡SD 大鼠(體質(zhì)量80-100 g)80 只(雌雄各半)購自河南省實驗動物中心,許可證號SCXK(豫)2017-0001。大鼠適應生長1周后根據(jù)隨機數(shù)字表法分成正常組12 只,模型組60 只。模型組大鼠通過疲勞結合飲食失節(jié)法和刨花加煙葉煙熏法誘導脾氣虛證和肺氣虛證[8]。具體操作如下:在1-34 天中,將大鼠置于水池中(30℃)游泳至耐力極限(即大鼠口鼻首次浸入水中),在這期間大鼠自由飲水,單日每只大鼠飼喂20 g 白菜,雙日以15 mL·kg-1濃度油脂灌胃。在第13-34天中,采用刨花加煙葉煙熏大鼠30 min(各15 g)。造模后大鼠出現(xiàn)呼吸急促、咳嗽、精神萎靡、懶動、弓背等現(xiàn)象,即表明造模成功。
隨后將模型組大鼠分為5 組,每組12 只:分別為RRTI 模型組、玉屏風散對照治療組、以及益正方高、中、低劑量組,正常組還為正常組。自分組之日起開始灌胃,每日1次,連續(xù)6周。正常組和RRTI模型組灌胃生理鹽水0.5 mL·100 g-1·d-1;玉屏風散對照治療組灌胃混懸液0.5 mL·100 g-1·d-1,益正方高、中、低劑量組分別按照臨床人用藥量的15 倍,即0.75 mL·100 g-1·d-1;10 倍,即0.5 mL·100 g-1·d-1;5 倍,即0.25 mL·100 g-1·d-1給予益正方混懸液灌胃。
根據(jù)制造商說明,使用AniRes2005 動物肺功能分析系統(tǒng)(北京貝蘭博科技有限公司)評估大鼠的肺功能。簡而言之,在治療結束后,用3%戊巴比妥鈉(70 mg·kg-1)將大鼠麻醉并置于固定仰臥位的容量盒中。最后,對大鼠進行氣管插管,插管來連接呼吸機和信號調(diào)節(jié)器,將氣流和體積變化的數(shù)據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C。呼吸頻率預設為每分鐘75 次,呼氣/吸氣時間比為1.5∶1。檢測用力肺活量(Forced vital capacity,F(xiàn)VC)和0.3 秒用力呼氣量(Forced expiratory volume in 0.3 seconds,F(xiàn)EV0.3),以兩者之比(FEV0.3/FVC)作為評價大鼠肺功能的指標。
治療結束后,大鼠禁食(可飲水)12 h后,摘取眼球收集血液于促凝管中,用于炎癥因子水平的檢測。取血后頸椎脫臼處死大鼠,取部分左肺上葉組織用于制作病理切片,左肺下葉組織置于-80℃冰箱中備用。右肺用于檢測肺干濕比。
收集的大鼠血液在自然條件下凝固20 min,而后在4℃下離心20 min(2000 r·min-1),收集上清。將待測樣本和標準品在15 min內(nèi)添加到酶標板中孵育2 h。去除孔中液體,添加對應的生物素化抗體后孵育1 h。添加顯色劑避光孵育20 min后加入終止液混勻,隨后檢測A450值(450 nm波長處的A值)。繪制標準曲線,通過樣品的A450值和標準曲線獲得樣品相應的濃度。
左肺分離后部分組織用4%多聚甲醛固定,脫水后石蠟包埋,切成5 μm 厚的切片,用HE 染色后,通過光學顯微鏡分析其組織病理學。肺組織的炎癥損傷情況以0-5的等級確定[9]:0:正常;1:炎癥細胞很少;2:存在一層較深的環(huán)狀炎癥細胞;3:存在2-4 層厚的炎癥細胞;4:炎癥細胞環(huán)超過4 個細胞深度。通過PAS染色來分析氣道杯狀細胞。根據(jù)PAS 陽性細胞的百分比對杯狀細胞的增生進行評分[10]:0:無杯狀細胞;1:杯狀細胞百分比小于25%;2:杯狀細胞百分比介于25%-50%之間;3:杯狀細胞百分比介于51%-75%之間;4:杯狀細胞百分比超過75%。此外,將部分切片脫蠟、復水后進行TUNEL 染色,DAPI 復染,最后在熒光顯微鏡下觀察細胞的凋亡情況。
處死大鼠后,分離右肺,立即記錄肺的重量作為濕重。用濾紙吸干肺上的血液,然后將肺儲存在60℃的培養(yǎng)箱中48 h。肺的重量被記錄為干重。肺干濕比(濕重/干重)用于評估肺水腫程度。
經(jīng)過超聲處理將-80℃的肺組織均質(zhì)化,并使用補充有PMSF 的RIPA 裂解緩沖液提取肺組織的總蛋白。定量后經(jīng)SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后,將膜與Caspase-1、GSDMD、IL-1β、HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 和β-actin一抗在4℃下低溫孵育過夜。添加二抗進一步培養(yǎng)2 h后通過ECL 化學發(fā)光觀察。經(jīng)Image J 軟件對蛋白質(zhì)條帶的整體灰度值進行量化。
使用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料均以平均值±標準差(±s)來表示。多組間差異比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
表1 結果顯示,與正常組比較,RRTI模型組FEV0.3與FEV0.3/FVC 比值均明顯下調(diào),F(xiàn)VC 顯著上調(diào)(P<0.05)。與RRTI 模型組比較,玉屏風散對照治療組以及益正方高、中、低劑量治療組FEV0.3與FEV0.3/FVC 比值均明顯上調(diào),F(xiàn)VC 顯著下調(diào)(P<0.05)。與玉屏風散對照治療組比較,益正方高劑量治療組FEV0.3、FVC 以及FEV0.3/FVC 比值變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05),益正方中、低劑量組FEV0.3與FEV0.3/FVC 比值明顯下調(diào),F(xiàn)VC顯著上調(diào),且均呈益正方劑量依賴性(P<0.05)。
表2 結果顯示,與正常組比較,RRTI 模型組TNFβ、IL-6 水平明顯升高,IL-10 水平顯著降低(P<0.05)。與RRTI 模型組比較,玉屏風散對照治療組以及益正方高、中、低劑量治療組TNF-β、IL-6 水平明顯降低,IL-10 水平顯著升高(P<0.05)。與玉屏風散對照治療組比較,益正方高劑量治療組TNF-β、IL-6和IL-10水平變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05);益正方中、低劑量組TNF-β、IL-6 水平明顯升高,IL-10 水平顯著降低,且均呈益正方劑量依賴性(P<0.05)。
圖1、表3 結果顯示,正常組肺組織和支氣管杯狀細胞無病理損傷情況,在RRTI 模型大鼠中出現(xiàn)肺組織間隔增厚、肺間質(zhì)水腫以及炎癥細胞浸潤等病理改變,并且杯狀細胞明顯增生,在使用玉屏風散和益正方治療后以上病理損傷程度均得到不同程度的改善。具體體現(xiàn)在,與正常組比較,RRTI模型組病理學評分、PAS 評分、TUNEL 陽性細胞數(shù)以及肺干濕比均明顯上調(diào)(P<0.05)。與RRTI模型組比較,玉屏風散對照治療組以及益正方高、中、低劑量治療組病理學評分、PAS評分、TUNEL 陽性細胞數(shù)以及肺干濕比均明顯下調(diào)(P<0.05)。與玉屏風散對照治療組比較,益正方高劑量治療組病理學評分、PAS評分、TUNEL陽性細胞數(shù)以及肺干濕比變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05);益正方中、低劑量組病理學評分、PAS 評分、TUNEL 陽性細胞數(shù)以及肺干濕比均上調(diào),且均呈益正方劑量依賴性(P<0.05)。
圖1 組織病理學分析益正方對RRTI大鼠肺損傷的影響
表3 益正方對RRTI大鼠肺損傷的影響(n=6)
圖2 結果顯示,與正常組比較,RRTI 模型組Caspase-1、GSDMD 和IL-1β 蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.05)。與RRTI 模型組比較,玉屏風散對照治療組以及益正方高、中、低劑量治療組Caspase-1、GSDMD 和IL-1β 蛋白水平均明顯下調(diào)(P<0.05)。與玉屏風散對照治療組比較,益正方高劑量治療組Caspase-1、GSDMD 和IL-1β 蛋白水平變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05);益正方中、低劑量組Caspase-1、GSDMD和IL-1β蛋白水平均上調(diào),且均呈益正方劑量依賴性(P<0.05)。
圖2 Western blot檢測Caspase-1、GSDMD和IL-1β蛋白表達情況
圖3 結果顯示,與正常組比較,RRTI 模型組HMGB1、TLR4和p-NF-κB p65蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.05)。與RRTI模型組比較,玉屏風散對照治療組以及益正方高、中、低劑量治療組HMGB1、TLR4 和p-NFκB p65蛋白水平均明顯下調(diào)(P<0.05)。與玉屏風散對照治療組比較,益正方高劑量治療組HMGB1、TLR4和p-NF-κB p65蛋白水平變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05);益正方中、低劑量組HMGB1、TLR4和p-NF-κB p65蛋白水平均上調(diào),且均呈益正方劑量依賴性(P<0.05)。
圖3 Western blot檢測HMGB1、TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達情況
歷代中醫(yī)學典籍中并無“RRTI”的明確記錄,故將其歸為“體虛感冒”、“虛癥”等范疇。傳統(tǒng)研究認為RRTI 以“肺脾氣虛”為主,故治療當以益氣、健和補肺為主[8]。因此本研究通過疲勞結合飲食失節(jié)法和刨花加煙葉煙熏法誘導脾氣虛證和肺氣虛證的RRTI 大鼠模型,以探究益正方對RRTI的療效。
益正方是一種中草藥配方,其中黃芪具有益氣、扶正的功效;茯苓則在健脾、潤肺等方面有顯著療效;西洋參則在保肺機制中頗有研究[11-13]。此外,益正方已被證實是改善RRTI 的有效方劑,然而其具體機制仍不清楚。因此,本研究試圖探究益正方緩解RRTI的作用機制。于是,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),益正方治療可明顯改善RRTI 模型大鼠的肺功能。與以往研究結果一致[6]。此外,肺損傷的過程中伴隨著以炎癥細胞浸潤的急性炎癥[14-15],如項憶瑾等[16]研究表明,小續(xù)命湯可能通過抑制炎癥反應改善急性肺損傷,故而可推測持續(xù)性的肺部炎癥也是判斷RRTI 的關鍵指標。據(jù)報道,TNF-β、IL-6 是主要的促炎因子,在炎癥性疾病中高表達,而IL-10 在炎癥反應中主要發(fā)揮抗炎因子的作用[17-18]。結合本研究結果證實,益正方治療可通過調(diào)控上述炎性因子的表達水平顯著降低RRTI 模型大鼠的炎癥反應。同時,進一步的研究顯示,益正方治療后可明顯改善RRTI 模型大鼠病理學肺損傷和細胞凋亡情況得。以上結果表明,益正方可通過降低炎癥反應、感染病理損傷、抑制細胞凋亡進而對RRTI 模型大鼠發(fā)揮保護作用。然而,益正方是如何發(fā)揮保護作用的分子機制尚不清楚。
既往研究表明,阻斷細胞焦亡可對脂多糖誘導的肺損傷發(fā)揮保護作用[19-20]。Liu 等[21]報道顯示,減少氧化應激和抑制MLRP3 炎癥小體介導的焦亡可明顯緩解脂多糖誘導的急性肺損傷。并且已知細胞焦亡是一種程序性細胞死亡的炎癥形式。依次推測益正方在治療RRTI中可能與細胞焦亡有關。于是,本研究進一步探究了參與焦亡的IL-1β、Caspase-1和GSDMD蛋白表達情況來探究細胞焦亡是否參與此過程。據(jù)報道,細胞焦亡具有不同于其他類型細胞死亡的獨特形態(tài)和機制,其中Caspase-1 是一種白細胞介素1 轉(zhuǎn)換酶,可通過蛋白水解切割炎性細胞因子的前體,如IL-1β,以及焦化誘導劑GSDMD;裂解的GSDMD 形成膜孔,導致細胞因子釋放和細胞焦亡[22-23]。結果顯示,RRTI模型大鼠中IL-1β、Caspase-1 和GSDMD 蛋白表達明顯升高,提示RRTI 誘導細胞焦亡;而使用益正方干預后可通過降低上述焦亡相關蛋白的表達進而明顯抑制細胞焦亡。以上數(shù)據(jù)證實,益正方通過抑制細胞焦亡減輕RRTI 大鼠肺損傷。然而,益正方抑制細胞焦亡的機制仍不清楚。
以往研究報告表明,炎癥增強了核膜的通透性,使核HMGB1 蛋白能夠到達細胞質(zhì),敲低HMGB1 可通過減少氣道平滑肌厚度、膠原沉積、粘液分泌和氣道炎癥來降低呼吸道相關疾病的嚴重程度。TLR4 蛋白可充當HMGB1 的受體之一,參與免疫細胞反應和炎癥,其在肺中的過度表達通過NF-κB 磷酸化來增加炎癥相關介質(zhì)的表達(如IL-6 等)進而參與調(diào)控氣道炎癥性疾病[24-25]。研究顯示,吳茱萸堿治療可通過下調(diào)HMGB1/TLR4/NF-κB 減輕哮喘大鼠肺組織炎癥和氣道重塑[10]。本研究結果與之相似,益正方治療后可明顯抑制RRTI大鼠中HMGB1、TLR4、NF-κB 蛋白表達。結合以往研究表明,益正方通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路對RRTI大鼠發(fā)揮保護作用。
綜上,益正方通過緩解病理性損傷、抑制炎癥反應和削弱細胞焦亡提高RRTI 大鼠肺功能,其機制可能與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 通路有關。本研究為益正方的臨床用藥提供了參考。然而,本研究并未深入探究HMGB1/TLR4/NF-κB 通路是如何參與益正方的對RRTI 大鼠的療效改善的過程;此外并未探究是否還有其他的通路參與此過程,后續(xù)仍需繼續(xù)探索。