黃露文,朱麗萍,顏世敢

齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物工程學部,山東 濟南 250353

食用色素可以根據來源不同,分成天然色素和人工合成色素兩大類[1]。在以往的研究中,天然色素已經被證明具有良好的著色性能和促進健康的作用,但運用于工業(yè)生產仍然存在著成本較高、來源有限等挑戰(zhàn)[2]。近年來,合成色素在食品工業(yè)中被廣泛應用,但所有的人工合成色素幾乎都不是營養(yǎng)物質,部分甚至有致癌危險。因此,天然色素再次回歸大眾的視野[3]。在天然色素中,天然藍色素出現的頻率遠低于紅色、綠色或黑色[4]。目前市面上所使用的藍色素,例如常被用來裝點食物的輝煌藍(FD&C Blue No.1)和靛青(FD&C Blue No.2)大多是由人工合成[5]。雖然在一定程度上這些人造藍色素被認為是安全的,但消費者無疑更喜歡天然的東西[6]。因此,從自然界中分離出稀有的天然藍色素,并找到大規(guī)模的生產方法具有重要的現實意義和巨大的市場前景[7]。

大多數天然色素是從植物組織中提取,但考慮到工業(yè)應用,這類原材料的獲取將受到眾多自然因素的制約[8]。近年來,利用微生物發(fā)酵代謝的方式獲取天然色素受到了廣泛關注[9]。然而,目前所研究的產色素的菌種中只有極少數能夠產生藍色素,所以開發(fā)新的生產藍色素的菌種是當今市場的一個主要需求[10]。本研究采用由實驗室保藏的藍色刺孢霉菌株在液態(tài)搖瓶培養(yǎng)條件下生產藍色素,并對其發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行系統(tǒng)優(yōu)化,旨在為天然藍色素的規(guī)?；a奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所采用的藍色刺孢霉QY229為本實驗室保藏菌株;碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉和果糖)、氮源(蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、酵母膏、牛肉膏和硝酸鈉)、瓊脂粉、無機鹽等試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA);種子培養(yǎng)基:40 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L MgSO4、1.0 g/L KH2PO4、pH為5.5～6.0。初始發(fā)酵培養(yǎng)基:60 g/L葡萄糖、30 g/L蛋白胨、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L MgSO4、1.0 g/L KH2PO4、pH為5.5～6.0。

取藍色刺孢霉QY229劃線接種到PDA斜面培養(yǎng)基,35 ℃下恒溫培養(yǎng)5～7 d。吸取5 mL無菌水反復沖洗斜面制備孢子懸浮液,并將其添加到30 mL的種子培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶),于32 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器(150 r/min)上培養(yǎng)48 h,獲得種子培養(yǎng)液。最后,以體積分數5%的接種量將種子培養(yǎng)液轉移到100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶),6層紗布封口,在32 ℃的恒溫培養(yǎng)振蕩器(180 r/min)上培養(yǎng)6 d,獲得含藍色素的發(fā)酵液。

1.2.2 發(fā)酵液的預處理與色價測定方法

收集含藍色素的發(fā)酵液于4 ℃下離心20 min(6 000×g),棄去沉淀,上清液用蒸餾水定容至原發(fā)酵液體積。

參照已報道的方法進行發(fā)酵液色價的測定[11]。每毫升含藍色素的發(fā)酵上清液,稀釋合適倍數后,在pH為9,于580 nm下測定吸光度,吸光度值為0.1時相當于1個色素效價相對單位(U/mL),藍色素發(fā)酵液色價計算公式如下:

色價=總稀釋倍數×OD_580 nm。 (1)

1.2.3 單因素試驗設計

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分為基礎,添加不同種類的碳源(乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、果糖)和氮源(硝酸銨、硫酸銨、酵母膏、蛋白胨、硝酸鈉、牛肉膏),檢測其對藍色刺孢霉產藍色素的影響。

1.2.4 Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上,選取葡萄糖質量濃度、蛋白胨質量濃度、溫度、裝瓶量、時間、接種量、初始pH、轉速、種齡9種因素作為考察對象,以發(fā)酵液色價(Y)為響應值,通過Design-Expert 8.0軟件中Plackett-Burman篩選影響發(fā)酵液色價的顯著性因素。各因素試驗設計水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman設計的因素與水平

1.2.5 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman試驗分析結果,將篩選出的影響發(fā)酵液色價的顯著性因素進行最陡爬坡試驗設計,得到關鍵因子的最佳水平范圍。爬坡試驗的方向通過回歸方程關鍵因素系數的正負確定,爬坡試驗的步長依據響應值的變化進行設計,旨在快速、經濟地逼近最大響應區(qū)域。

1.2.6 Box-Behnken試驗設計

以最陡爬坡試驗設計得出的試驗結果為依據進行3因素3水平Box-Behnken試驗,利用Minitab 18軟件將得到的數據構建二次多項式數學模型同時進行回歸分析,最終確定藍色刺孢霉QY229產天然藍色素的最佳發(fā)酵參數,優(yōu)化后各因素間的交互關系通過三維響應面圖呈現。

1.2.7 試驗驗證

將Box-Behnken分析得到的藍色刺孢霉最佳發(fā)酵參數進行3次重復試驗,3次試驗得到的結果取平均值,進而驗證該試驗模型及試驗設計應用是否合理可行,并得出最終優(yōu)化結果。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 培養(yǎng)基碳源種類的影響

碳源的種類直接關系到微生物的生長和代謝物質的產生[12]。果糖、葡萄糖是常見碳源里能被微生物直接利用的單糖,尤其是葡萄糖,也是發(fā)酵培養(yǎng)基中最常被選擇作為碳源和能源的糖類物質之一[13]。其他雙糖或多糖類物質如蔗糖、麥芽糖和淀粉在水解后也可被微生物逐步利用[14]。本試驗以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎,更換不同種類的碳源測定其對發(fā)酵液色價的影響,試驗結果見圖1。

注:不同字母代表兩組數據之間存在顯著性差異(p<0.05);相同字母代表兩組數據之間不存在顯著性差異(p>0.05)。碳源質量濃度為60 g/L。

由圖1可知,當碳源質量濃度均為60 g/L時,以葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源,發(fā)酵液色價達到167.7 U/mL,顯著(p<0.05)高于其它底物作為碳源時的色價。因此,本研究選擇葡萄糖作為藍色刺孢霉液態(tài)發(fā)酵生產藍色素的最優(yōu)碳源。

2.1.2 培養(yǎng)基氮源種類的影響

氮源參與各類微生物細胞重要成分的構建,應用于培養(yǎng)基中的無機氮源在發(fā)酵過程早期可以被微生物快速利用,同時能夠促使培養(yǎng)基的pH發(fā)生變化[15]。而有機氮源如牛肉膏、酵母膏和蛋白胨等工業(yè)副產品,除提供氮源外,還可以提供大量的無機鹽及生長因子[16]。該過程以葡萄糖為碳源(最佳碳源),結合初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他條件,研究不同氮源對菌株發(fā)酵液色價的影響,依據發(fā)酵液色價值的高低選擇出最佳氮源,實驗結果見圖2。

由圖2可知,蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源色價達到164.4 U/mL,普遍高于其他物質作為氮源時發(fā)酵液的色價,其次是酵母膏。而硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨作為氮源,色價均在60 U/mL以下,與有機氮源存在顯著(p<0.05)差異性,這就說明與無機氮源相比,有機氮源更能促使該菌株代謝產生藍色素。因此,本實驗中蛋白胨可以作為藍色刺孢霉液態(tài)發(fā)酵獲取藍色素的最優(yōu)氮源。

注:氮源質量濃度為30 g/L。

2.2 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman試驗設計對菌株發(fā)酵關鍵影響因素的篩選結果如表2所示。采用Minitab 18軟件對試驗數據進行擬合分析,獲得發(fā)酵液色價Y(響應值)對X1～X9(自變量的編碼值)9個因素的一次回歸方程:

Y=149.28+8.57X1+11.33X2+62.96X3-26.03X4-5.51X5+6.53X6+7.24X7+1.12X8+1.04X9。

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果

經分析,該回歸方程顯著(p=0.010 3),相關系數R2=0.997 7,這表明該回歸模型的可信度較高,該方程可以對試驗中99.77%的數據作出解釋,模型試驗誤差合理可靠。

另外,根據表3中效應值的大小可知影響藍色刺孢霉產天然藍色素的關鍵因素依次為溫度、蛋白胨質量濃度、裝瓶量。其中溫度和蛋白胨質量濃度對發(fā)酵液色價的影響達到了極顯著水平(p<0.01),裝瓶量對發(fā)酵液色價的影響達到了顯著水平(p<0.05),其余因素的影響均不顯著(p>0.05)。因此后續(xù)試驗選取X2(蛋白胨質量濃度)和X3(溫度)、X4(裝瓶量)為關鍵因素。

2.3 最陡爬坡試驗

由Plackett-Burman回歸方程可知X2(蛋白胨質量濃度)和X3(溫度)對Y(發(fā)酵液色價)具有正效應,X4(裝瓶量)對Y(發(fā)酵液色價)具有負效應。梯度增加溫度和蛋白胨質量濃度,同時梯度降低裝瓶量,進行最陡爬坡試驗,進而確定3個關鍵因素的最佳水平范圍,試驗設計及結果如表4所示。由表4可知,試驗的最優(yōu)點在試驗4附近。因此,以試驗4的條件設置作為后續(xù)響應面試驗的中心點,實現以最少試驗量快速逼近最大發(fā)酵液色價區(qū)域的目的。

表4 最陡爬坡試驗設計及試驗結果

2.4 Box-Behnken試驗優(yōu)化確定最佳因素水平

在最陡爬坡實驗結果的基礎上,以蛋白胨質量濃度(X2)、溫度(X3)及裝瓶量(X4)作為響應因素,發(fā)酵液色價(Y)作為響應值,共計進行15次試驗,優(yōu)化確定最佳因素水平,試驗設計與結果見表5和表6。

表5 Box-Behnken設計的因素與水平

表6 Box-Behnken試驗設計與結果

表7 Box-Behnken試驗設計回歸分析結果

采用Design-Expert 8.0軟件,對Box-Behnken試驗建立的回歸模型中各因素交互作用結果進行響應曲面作圖,結果見圖3。從圖3(a)可以看出,以蛋白胨質量濃度和溫度二因素交互生成的三維響應面圖中,隨著蛋白胨質量濃度和溫度的增加,發(fā)酵液色價先升高后降低。其中蛋白胨質量濃度的曲面坡度較緩慢于培養(yǎng)溫度的曲面坡度,說明發(fā)酵液色價受培養(yǎng)溫度的影響更大[18]。圖3(b)為蛋白胨質量濃度與裝瓶量交互生成的三維響應面圖,圖中等高線的形狀為橢圓形,表明二因素交互作用明顯,同時驗證了方差分析交互項中分析結果的顯著性[19]。圖3(c)為溫度和裝瓶量交互生成的三維響應面圖,溫度和裝瓶量交互作用顯著,且溫度的曲面坡度比裝瓶量的曲面坡度陡峭,可知溫度對發(fā)酵液色價的影響更大[20]。對模型最優(yōu)點進行分析,得到上述關鍵因素的最佳水平:培養(yǎng)溫度為31.67 ℃,蛋白胨質量濃度為34.61 g/L,裝瓶量為72.33 mL,對應發(fā)酵液色價的預測值為350.4 U/mL。

(a)蛋白胨質量濃度與培養(yǎng)溫度之間的相互作用

(b)裝瓶量與蛋白胨質量濃度之間的相互作用

2.5 試驗驗證

為了驗證Box-Behnken分析方法所建模型的預測值與實際值是否能夠較好的擬合,將上述優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件:蛋白胨質量濃度34.61 g/L,溫度為31.67 ℃,裝瓶量72.33 mL,進行3次試驗,3次試驗結果的平均值為348.2 U/mL,與理論預測值350.4 U/mL相接近,說明本試驗設計的優(yōu)化模型切實可靠,可應用于藍色刺孢霉的發(fā)酵條件優(yōu)化。經分析,優(yōu)化后的發(fā)酵液色價是優(yōu)化前色價的2.1倍,得出該方案可以明顯提高藍色刺孢霉QY229液態(tài)發(fā)酵條件下藍色素的產量。

3 結 論

本研究對藍色刺孢霉產天然藍色素的液態(tài)發(fā)酵工藝進行系統(tǒng)優(yōu)化。以單因素試驗結果為基礎,采用Plackett-Burman試驗設計從9種考察因素中篩選出關鍵影響因素:氮源質量濃度(蛋白胨)、培養(yǎng)溫度、裝瓶量。利用最陡爬坡實驗設計和Box-Behnken試驗對篩選出的3個關鍵影響因素進行響應面分析,結果表明當蛋白胨質量濃度為34.61 g/L,溫度為31.67 ℃,裝瓶量為72.33 mL時,發(fā)酵液色價達348.2 U/mL,是優(yōu)化前色價的2.1倍。試驗驗證顯示,預測值與試驗值之間沒有顯著差異,表明優(yōu)化后的條件是合理可行的。由此可見,藍色刺孢霉液態(tài)QY229發(fā)酵產藍色素作為稀有天然藍色素的又一新來源,具有廣闊的發(fā)展?jié)摿Α?/p>