果膠酶對(duì)靈武長(zhǎng)棗果實(shí)發(fā)育中阿拉伯半乳糖蛋白分布的影響

王 靜 章英才 陶珊珊 楊 雪

（寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021）

果實(shí)的組織特性是決定品質(zhì)和消費(fèi)者選擇標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵特征，果實(shí)的品質(zhì)特性主要取決于特定果實(shí)細(xì)胞代謝等過(guò)程［1］。細(xì)胞壁使果實(shí)具有一定的形狀和彈性，其結(jié)構(gòu)和物質(zhì)成分的改變被認(rèn)為是引起果實(shí)質(zhì)地變化的主要原因［1］。所有導(dǎo)致果實(shí)成熟和軟化的過(guò)程都與細(xì)胞壁的重塑有關(guān)，主要與細(xì)胞壁聚合物網(wǎng)絡(luò)的松散緊密相關(guān)［2-4］，細(xì)胞壁在其中起著至關(guān)重要的作用。纖維素主要作為細(xì)胞壁的骨架，而果膠等則有序的分布在纖維素和半纖維素微絲中，并與之交聯(lián)。多糖組裝體的修飾，尤其是果膠的修飾對(duì)果實(shí)生長(zhǎng)和成熟過(guò)程中細(xì)胞壁的變化具有重要影響。在番茄（Solanum lycopersicum）果實(shí)成熟過(guò)程中，果膠半乳糖醛酸表達(dá)量下降，這與酶促降解導(dǎo)致果膠解聚有關(guān)，細(xì)胞壁的破壞表現(xiàn)為細(xì)胞與細(xì)胞的粘附減少，同時(shí)受果膠的空間分布及其在細(xì)胞連接處流失的影響［5-6］。然而，果膠結(jié)構(gòu)的改變不僅會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞壁的改變，而且會(huì)導(dǎo)致與其他成分連接的重新排列，進(jìn)而引起細(xì)胞壁的改變［7］。其中之一是阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs），其具體分布與果實(shí)成熟階段有關(guān)［8-10］。AGPs 參與了細(xì)胞壁-質(zhì)膜連續(xù)體的建立，以及與其他細(xì)胞壁成分的交聯(lián)。

AGPs 是植物細(xì)胞壁蛋白中富含羥脯氨酸糖蛋白家族（HRGPs）的高度糖基化蛋白，是無(wú)定形植物細(xì)胞外基質(zhì)中普遍存在的組分，具有可變的核心蛋白和富含阿拉伯糖、半乳糖的糖基側(cè)鏈［11］。AGPs 的特點(diǎn)是高比例的糖基部分，以及蛋白質(zhì)骨架和碳水化合物鏈的異質(zhì)性。碳水化合物鏈對(duì)AGPs 的正常功能有較大的影響，高度分支的碳水化合物結(jié)構(gòu)域、特別是它們的異質(zhì)性，對(duì)AGPs 功能的多樣性十分重要［12-15］。AGPs 是GPI 錨定的蛋白（GAPs），由蛋白骨架C 末端的糖磷脂酰肌醇緊密結(jié)合在質(zhì)膜上［16-17］。此外，AGPs 通過(guò)阿拉伯半乳聚糖的分子共價(jià)連接到細(xì)胞壁半纖維素和果膠多糖上，形成阿拉伯木聚糖果膠-阿拉伯半乳聚糖蛋白1（APAP1）結(jié)構(gòu)。AGPs 與不同組分的相互作用有助于它們作為細(xì)胞壁-質(zhì)膜連續(xù)體的錨定物發(fā)揮作用［18-20］。自果實(shí)組織中發(fā)現(xiàn)阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）以來(lái)，前人已有的研究表明，細(xì)胞壁的組裝可能會(huì)受到這些糖蛋白的影響，這對(duì)果實(shí)的特性非常重要。

從干旱缺水到營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官的熱脅迫，AGPs 被認(rèn)為有助于植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫［21］。各種因素對(duì)果實(shí)中阿拉伯半乳糖蛋白的分布產(chǎn)生影響。就果實(shí)而言，有報(bào)道稱低氧和缺氧可調(diào)節(jié)AGPs 編碼基因的mRNA 水平，提示它們?cè)诜焉L(zhǎng)中的適應(yīng)過(guò)程和維持細(xì)胞壁穩(wěn)定性中的作用［22］。此外，葡萄（Vitis vinifera）成熟過(guò)程中的細(xì)胞擴(kuò)增與AGPs 的豐度增加有關(guān)，LM2 抗體識(shí)別的AGPs 表位β-D-GlcA 是葡萄果實(shí)成熟的潛在生物標(biāo)志物［8］。在蘋(píng)果（Malus×domestica）果實(shí)中，AGPs 表位的定位取決于采后衰老過(guò)程中細(xì)胞壁-質(zhì)膜發(fā)生變化的條件，此外，還發(fā)現(xiàn)AGPs 具有組織特異性［23］。

果實(shí)軟化的酶機(jī)制與細(xì)胞壁多糖的解聚有關(guān)。AGPs 的結(jié)構(gòu)修飾和碳水化合物部分的降解是由α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）和β-木糖苷酶（β-xylosidases）幾種糖苷酶引起。其中，α-L-Af 的活性與AGPs 中L-阿拉伯呋喃糖殘基的釋放和對(duì)β-半乳糖苷酶敏感的糖部分的形成有關(guān)［24］，可導(dǎo)致阿拉伯糖的喪失，對(duì)果實(shí)成熟過(guò)程中阿拉伯糖的代謝及果實(shí)軟化有重要作用［2］。β-半乳糖苷酶水解細(xì)胞壁的半乳糖苷鍵，切除多糖側(cè)鏈中非還原末端半乳糖殘基，導(dǎo)致細(xì)胞壁多糖中半乳糖、阿拉伯糖含量的降低，以及阿拉伯半乳聚糖等多聚物的解聚，改變細(xì)胞壁中一些組分的穩(wěn)定性，促使細(xì)胞壁膨脹進(jìn)而使其軟化，半乳糖和阿拉伯糖在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中扮演很重要的角色［25］。為了闡明AGPs 的作用，人們利用AG 糖鏈的降解酶，鑒定了2 個(gè)編碼β-葡萄糖醛酸酶的基因，它們能夠水解AGPs 的β-Glc A 和4-Me-β-Glc A殘基［26］。這些研究結(jié)果表明，酶對(duì)阿拉伯半乳糖蛋白具有作用，糖苷酶的激活可能導(dǎo)致寡糖鏈的損傷和釋放，這些寡糖鏈對(duì)于高等植物蛋白聚糖的生理功能必不可少。

果膠酶是一種復(fù)合酶，主要包括解聚酶類和水解酶類，在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中催化細(xì)胞壁果膠類物質(zhì)的降解過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞壁解體和果實(shí)成熟軟化具有重要作用［1-2］。使用酶降解和細(xì)胞壁多糖定向探針是研究果實(shí)結(jié)構(gòu)發(fā)育修飾的有效分析工具。眾所周知，AGPs 與細(xì)胞壁中的其他基本組分形成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，果膠酶影響了AGPs 在細(xì)胞壁中的分布以及AGPs 抗原表位排列的改變，AGPs 在果實(shí)軟化過(guò)程中發(fā)揮重要作用［10］。靈武長(zhǎng)棗（Ziziphus jujuba‘Lingwu Changzao’）為寧夏優(yōu)良藥食同源鮮食棗品種，在果實(shí)貯藏保鮮、生理特性等方面已有較多的研究［27-28］，而有關(guān)果膠酶對(duì)果實(shí)AGPs 分布及果實(shí)成熟過(guò)程的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究的目的是揭示果膠酶對(duì)4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期靈武長(zhǎng)棗果實(shí)AGPs 分布的影響，以明確果膠降解酶對(duì)AGPs 分布的影響。通過(guò)果膠酶處理不同時(shí)期果實(shí)材料，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，在細(xì)胞水平上對(duì)AGPs 表位進(jìn)行原位分析檢測(cè)，研究AGPs 作為果實(shí)細(xì)胞壁多糖-蛋白聚糖網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分在靈武長(zhǎng)棗果實(shí)細(xì)胞壁中排列的影響和分布的變化，為明確果膠酶對(duì)果實(shí)成熟過(guò)程的影響提供解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以位于寧夏靈武市的寧夏紅棗工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地（38°12′N(xiāo)，106°34′E）6 年生靈武長(zhǎng)棗為供試材料，采用隨機(jī)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每次重復(fù)選擇5～10 株生長(zhǎng)發(fā)育良好、樹(shù)勢(shì)適中、長(zhǎng)勢(shì)和花期相似、栽培管理水平一致的植株，用毛線于2022年6 月10 日標(biāo)記同一天開(kāi)放的花朵，每個(gè)重復(fù)標(biāo)記3 000朵［27-28］。

在靈武長(zhǎng)棗開(kāi)花坐果到果實(shí)成熟的發(fā)育過(guò)程中共設(shè)計(jì)4 次試驗(yàn)，具體分別在果實(shí)膨大前期（7月10日）、果實(shí)快速膨大期（8月9日）、果實(shí)著色期（9月8日）、果實(shí)完熟期（9月28日）［28］，每次試驗(yàn)時(shí)間均設(shè)定于09：00—11：00 進(jìn)行，按所標(biāo)記植株從樹(shù)冠的東、西、南、北4個(gè)方位以及上、中、下、里、外各個(gè)方向選擇標(biāo)記花朵的棗吊作為試驗(yàn)對(duì)象，將棗吊采摘用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室［27-28］。

果膠酶來(lái)自黑曲霉（Aspergillus niger）、購(gòu)自Sigma Aldrich 公 司，AGPs 單 克 隆 抗 體JIM13、JIM8、MAC204 購(gòu)自美國(guó)喬治亞大學(xué)，其相應(yīng)二抗Anti-mouse-IgG-FITC購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 果膠酶處理

果實(shí)組織的酶處理是根據(jù)Leszczuk 等［29］進(jìn)行，作了一些修改。選取4 個(gè)發(fā)育時(shí)期果實(shí)，用鋒利的刀片從外果皮開(kāi)始切取2 mm×2 mm×4 mm 的果實(shí)組織，立即放入E1（0.028 U·mL-1）、E2（0.056 U·mL-1）、E3（0.084 U·mL-1）3種不同濃度果膠酶的醋酸鹽緩沖液（pH=5.5），22 ℃酶解3 h［29］。

1.2.2 樹(shù)脂包埋和切片

樣品經(jīng)10 mmol·L-1的PBS 漂洗后放入4%多聚甲醛-0.5%戊二醛的PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）固定液中（對(duì)照不用果膠酶處理，分割后直接固定），蓋緊瓶蓋后多次抽氣至樣品沉落瓶底，冰上（或4 ℃）固定4 h，再分別轉(zhuǎn)移至新鮮的固定液中，冰上（或4 ℃）固定4 h。

樣品在4 ℃下?lián)u床中以PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）漂洗3 次，每次15 min。在4 ℃下?lián)u床中分別以30%、50%、70%、90%乙醇脫水，每次15 min；100%乙醇15 min，100%丙酮30 min，共3～4 次。樣品經(jīng)脫水后滲透包埋于Spurr 樹(shù)脂。在超薄切片機(jī)（LEICA EM UC6，德國(guó)）下制作1 μm 厚的半薄切片。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)分析

將有切片的載玻片放入10%過(guò)碘酸（高碘酸）中腐蝕樹(shù)脂，在溫箱中60 ℃靜置15 min，蒸餾水沖洗，PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）沖洗；0.3%H2O2中5 min［30］。切片放入PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）淋洗（浸泡）5 min，然后用含50 mmol·L-1甘氨酸、2%BSA 的PBS （10 mmol·L-1，pH=7.4） 封閉液封閉10 min。PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）淋洗5 min，再用PBS（含1% BSA）以1∶50 體積比稀釋后的單克隆抗體，4 ℃下孵育過(guò)夜［27-28］。對(duì)照組采用含1%BSA 的PBS 溶液代替一抗。用PBS 淋洗3 次，每次5 min，以去除多余抗體；再用PBS（含1%BSA）以1∶200 體積比稀釋后的Anti-mouse-IgG-FITC 二抗37 ℃黑暗條件下孵育2 h；標(biāo)記后，PBS 淋洗3 次，每次5 min，除去未標(biāo)記的二抗；0.01% Toluidine blue 染色5 min，以去除植物本身的自發(fā)熒光，PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）淋洗10 min［27-28］。

1.2.4 Calcofluor染色

為進(jìn)行對(duì)比染色，將半薄切片用0.01% Calcofluor White 水溶液在黑暗中染色10 min［29］，以顯示細(xì)胞壁纖維素的分布和存在情況。

1.2.5 成像觀察

切片PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）淋洗10 min，稍微晾干后，取甘油少許滴在樣品上封片，指甲油將蓋玻片的四周封固。盡快在LEICA STELLARIS 5 激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光和藍(lán)色熒光疊加圖，并拍照。

FITC的激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，顯示綠色熒光。Calcofluor染色切片在激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為433 nm 的條件下顯示藍(lán)色熒光。每個(gè)果實(shí)樣品至少分析15 個(gè)組織切片，每個(gè)抗體重復(fù)試驗(yàn)數(shù)次，選取有代表性的圖像利用photoshop軟件進(jìn)行圖像編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)成熟過(guò)程中果皮AGPs和纖維素分布的變化

成熟過(guò)程誘導(dǎo)了果實(shí)組織外果皮、中果皮結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化，果實(shí)成熟過(guò)程中的一個(gè)明顯特征是外果皮表皮細(xì)胞外壁角質(zhì)層的顯著增厚變化，膨大前期表皮細(xì)胞外壁角質(zhì)層相對(duì)較?。▓D1：A～C），快速膨大期（圖1：D～F）、著色期（圖1：G～I(xiàn)）、完熟期（圖1：J～L）顯著增厚；且內(nèi)部組織的細(xì)胞變得更大和更圓（圖1：D～L）。除了表皮細(xì)胞組織學(xué)上的差異外，內(nèi)部組織也表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)上的差異，果實(shí)發(fā)育前期果皮中細(xì)胞緊密排列（圖1：A～C），在發(fā)育后期成熟過(guò)程中出現(xiàn)解體和松散（圖1：D～L）。

圖1 不同發(fā)育時(shí)期果皮AGPs的分布A～C.膨大前期；D～F.快速膨大期；G～I(xiàn).著色期；J～L.完熟期；EX.外果皮；E.表皮細(xì)胞；P.薄壁細(xì)胞；下同。Fig.1 AGPs distribution of fruit pericarp during different development periods A-C.The early bulking period；D-F.The rapid enlargement period；G-I.The coloring period；J-L.The maturation period；EX.Exocarp；E.Epidermal cells；P.Parenchymal cells；the same as below.

為了檢測(cè)AGPs 的分布特征，本研究采用一系列識(shí)別AGPs 糖鏈特異性表位的單克隆抗體標(biāo)記了果實(shí)組織切片，呈現(xiàn)綠色熒光。此外，具有β-Dglycans 親和力的Calcofluor White 被用于對(duì)比染色和顯示細(xì)胞壁纖維素的分布，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，結(jié)果顯示所有形態(tài)變化都與細(xì)胞壁組成的改變有關(guān)。在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，JIM13、JIM8 和MAC204 抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光表位在4 個(gè)時(shí)期果實(shí)的外果皮（圖1：A～L），以及相鄰的內(nèi)部數(shù)層排列緊密的中果皮小細(xì)胞的細(xì)胞壁和鄰近細(xì)胞壁內(nèi)部均有分布（圖1：A～L）。內(nèi)部的中果皮大型卵圓形薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁和鄰近細(xì)胞壁處在膨大前期和快速膨大期，均有JIM13、JIM8 和MAC204 抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光表位分布（圖1：A～F），而著色期和完熟期果實(shí)JIM13、JIM8 和MAC204 抗體所識(shí)別的抗原表位均主要分布于薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁上，大部分細(xì)胞內(nèi)部無(wú)分布（圖1：G～L）。隨著果實(shí)發(fā)育成熟，內(nèi)部中果皮薄壁細(xì)胞間隙拉大排列更加松散，出現(xiàn)細(xì)胞破裂，JIM13、JIM8 和MAC204 抗體所識(shí)別的抗原表位分布逐漸減少（圖1：G～L）。識(shí)別βGlcA（1→3）-αGalA（1→2）Rha 殘基的JIM13、識(shí)別AGPs 糖基表位的JIM8 和MAC204 抗體所標(biāo)記的抗原熒光強(qiáng)弱在各時(shí)期果實(shí)的不同組織存在一定差異。在果實(shí)發(fā)育的膨大前期至快速膨大期早期階段，標(biāo)記保持在同一區(qū)域，即在細(xì)胞壁的邊緣靠近質(zhì)膜的區(qū)域，熒光信號(hào)較強(qiáng)烈；而在果實(shí)逐漸成熟的著色期至完熟期紅色果實(shí)階段，熒光信號(hào)比之前時(shí)期果實(shí)組織中減弱，且標(biāo)記的規(guī)律性較差，表明隨果實(shí)成熟過(guò)程，AGPs 的數(shù)量有所減少。此外，在纖維素分布變化方面，膨大前期至快速膨大期果實(shí)外果皮細(xì)胞壁纖維素顯著增多，在這一過(guò)程中，外果皮細(xì)胞的形狀發(fā)生了變化，主要表現(xiàn)在表皮層由細(xì)胞壁加厚的細(xì)胞組成，這些細(xì)胞的細(xì)胞壁被Calcofluor White 強(qiáng)烈地標(biāo)記為藍(lán)色熒光（圖1：A～F），而著色期和完熟期果實(shí)外果皮細(xì)胞壁纖維素有所減少，內(nèi)部組織細(xì)胞近細(xì)胞膜處纖維素顯著增多（圖1：G～L），與同期AGPs 的減少相反。

2.2 果膠酶處理后果皮AGPs 和纖維素分布的變化

果實(shí)用低濃度酶0.028 U·mL-1（E1）處理后，在膨大前期（圖2：A～C）、快速膨大期（圖3：A～C）、著色期（圖4：A～C）、完熟期（圖5：A～C）均未觀察到果皮組織結(jié)構(gòu)的明顯變化。比較顯著的變化出現(xiàn)在酶濃度0.056 U·mL-1（E2）處理后，在膨大前期（圖2：D～F）、快速膨大期（圖3：D～F）、著色期（圖4：D～F）、完熟期（圖5：D～F）果實(shí)組織的各部位均可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)的變化和細(xì)胞壁的紊亂。經(jīng)最高酶濃度0.084 U·mL-1（E3）處理后，膨大前期（圖2：G～I(xiàn)）、快速膨大期（圖3：G～I(xiàn)）、著色期（圖4：G～I(xiàn)）、完熟期（圖5：G～I(xiàn)）果實(shí)不均勻增厚的細(xì)胞壁解體程度增加，內(nèi)部薄壁細(xì)胞細(xì)胞壁的增厚較明顯。

圖2 3種不同濃度酶處理后膨大前期果實(shí)AGPs的分布Fig.2 The distribution of AGPs in the early bulking period fruit pericarp after treatment with three different concentrations enzymes

圖3 3種不同濃度酶處理后快速膨大期果皮AGPs的分布Fig.3 The distribution of AGPs in the rapid enlargement period fruit pericarp after treatment with three different concentrations enzymes

圖4 3種不同濃度酶處理后著色期果皮AGPs的分布Fig.4 The distribution of AGPs in the coloring period fruit pericarp after treatment with three different concentrations enzymes

圖5 3種不同濃度酶處理后完熟期果皮AGPs的分布Fig.5 The distribution of AGPs in the maturation period fruit pericarp after treatment with three different concentrations enzymes

利用酶解法，本研究揭示了AGPs 抗原表位排列的改變。作為酶處理的結(jié)果，這些表位的破壞顯示了AGPs 的變化。當(dāng)果實(shí)組織用較低濃度的酶（E1：0.028 U·mL-1）處理，膨大前期（圖2：A～C）、快速膨大期（圖3：A～C）、著色期（圖4：A～C）、完熟期（圖5：A～C）果皮及內(nèi)部薄壁細(xì)胞細(xì)胞壁中的AGPs抗原表位減少，但沒(méi)有完全消除，0.056 U·mL-1（E2）和0.084 U·mL-1（E3）處理的果實(shí)中AGPs抗原表位檢測(cè)量逐漸降低，在許多情況下，只可見(jiàn)小的熒光斑點(diǎn)（圖2：D～I(xiàn)；圖3：D～I(xiàn)；圖4：D～I(xiàn)；圖5：D～I(xiàn)）。酶濃度的增加導(dǎo)致AGPs在果實(shí)所有表位排列的影響更大和熒光信號(hào)較弱，果膠酶濃度與AGPs 抗原熒光強(qiáng)弱具有明顯負(fù)相關(guān)性。同樣，最高濃度的果膠降解酶處理后，Calcofluor White染色顯示不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)外果皮表面及果皮內(nèi)部組織細(xì)胞壁區(qū)域藍(lán)色熒光也不同程度減弱或降低，纖維素分布有所減少（圖2：G～I(xiàn)；圖3：G～I(xiàn)；圖4：G～I(xiàn)；圖5：G～I(xiàn)）。

2.3 果膠酶處理后果實(shí)維管束和薄壁組織AGPs和纖維素分布的變化

AGPs在4個(gè)時(shí)期外果皮內(nèi)維管束和薄壁組織的分布變化，果實(shí)發(fā)育前期薄壁組織和維管束細(xì)胞壁區(qū)域在所觀察的AGPs表位中最為豐富（圖6：A，D），著色期至完熟期薄壁組織細(xì)胞變大，細(xì)胞間隙拉長(zhǎng)，AGPs 表位減少（圖6：G，J）。Calcofluor White 標(biāo)記的纖維素分布于整個(gè)細(xì)胞壁表面，在細(xì)胞壁及靠近內(nèi)壁的質(zhì)膜上出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光信號(hào)，突出了細(xì)胞壁AGPs 的分布特征（圖6：A，D，G，J），在果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程中纖維素影響組織完整性和細(xì)胞壁形狀，從而觀察到細(xì)胞解離和AGPs 表位重排（圖6：A，D，G，J）。

圖6 酶處理后4個(gè)發(fā)育時(shí)期的外果皮內(nèi)薄壁組織及維管束AGPs的分布A～C.膨大前期；D～F.快速膨大期；G～I(xiàn).著色期；J～L.完熟期；VB.維管束。Fig.6 The distribution of AGPs in parenchyma tissues and vascular bundle beside exocarp after treatment with different concentrations enzymes during 4 development stages A-C.The early bulking period；D-F.The rapid enlargement period；G-I.The coloring period；J-L.The maturation period；VB.Vascular bundle.

果膠酶處理后AGPs 和纖維素分布變化的觀察顯示，細(xì)胞壁的酶解特征表現(xiàn)為熒光信號(hào)較少且無(wú)序。經(jīng)0.028 U·mL-1（E1）濃度的酶處理后，AGPs抗原表位標(biāo)記不局限于細(xì)胞壁/質(zhì)膜，分布在整個(gè)細(xì)胞壁表面和細(xì)胞間隙，在薄壁細(xì)胞中，AGPs 抗原表位有時(shí)會(huì)出現(xiàn)在被破壞的細(xì)胞壁邊緣（圖6：B，E，H，K）。經(jīng)最高濃度酶0.084 U·mL-1（E3）的處理后，在纖維素藍(lán)色熒光對(duì)比下，抗體與AGPs結(jié)合的綠色熒光信號(hào)顯得相當(dāng)弱（圖6：C，F(xiàn)，I，L）。因此，AGPs 分布模式的紊亂和抗原表位的缺失與組織中纖維素組裝的變化有關(guān)。

3 討論

3.1 果膠酶導(dǎo)致AGPs排列的中斷和果實(shí)組織結(jié)構(gòu)的變化

高等植物細(xì)胞壁的共同特征是均由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和糖蛋白等大分子組成。利用多項(xiàng)生化技術(shù)和過(guò)表達(dá)技術(shù)的研究揭示了細(xì)胞壁酶在果實(shí)成熟中的功能，在蘋(píng)果果實(shí)中，甲酯化聚半乳糖醛酸、結(jié)晶纖維素和巖藻糖基化木葡聚糖側(cè)鏈等3 種關(guān)鍵多糖的水解對(duì)薄壁組織的機(jī)械性能有重大影響［31］。AGPs 作為纖維素微纖絲與半纖維素、果膠交聯(lián)的共外延網(wǎng)絡(luò)的元素，在細(xì)胞壁中的分布因果膠酶而改變。本研究的目的是揭示果膠酶的誘導(dǎo)對(duì)靈武長(zhǎng)棗果實(shí)AGPs 碳水化合物分布的影響。

果膠酶混合物中含有果膠裂解酶（PL）EC 4.2.2.2、內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶（PG）EC 3.2.1.15、果膠甲酯酶（PME）EC 3.1.1.11，以及少量半纖維素酶（EC3.2.1.8，EC 3.2.1.89）和 纖 維 素 酶Cx（EC 3.2.1.4）。細(xì)胞壁修飾酶，如果膠裂解酶（PL）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果膠甲酯酶（PME），負(fù)責(zé)重塑果膠網(wǎng)絡(luò)［32-33］。果膠甲酯酶在整個(gè)果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中催化半乳糖醛酸殘基的C6 羧基的去甲基化，使果膠（多聚半乳糖醛酸）降解，細(xì)胞壁解體，果實(shí)軟化［1-2］；PME 對(duì)于果實(shí)軟化具有前導(dǎo)或啟動(dòng)作用，在果實(shí)成熟過(guò)程中參與了果實(shí)的降解代謝，影響組織結(jié)構(gòu)完整性［34］；果膠裂解酶催化果膠聚合物中去甲基化的半乳糖醛酸殘基的裂解［35］；在果實(shí)成熟過(guò)程中，PG 對(duì)于果膠多聚物的降解和溶解有重要作用，其活性在番茄成熟軟化過(guò)程中均可檢測(cè)到［36］；PG 在許多果實(shí)成熟軟化后期作用明顯，但其并非果實(shí)軟化的決定性因素［37］。在果膠發(fā)生降解的同時(shí)，半纖維素多糖也被不斷修飾而參與了果實(shí)軟化的進(jìn)程［38］。在整個(gè)靈武長(zhǎng)棗成熟過(guò)程所有被檢測(cè)的AGPs 表位中，與質(zhì)膜相鄰的細(xì)胞壁及細(xì)胞間隙區(qū)域較為豐富，細(xì)胞壁修飾酶處理與果實(shí)細(xì)胞壁組裝中AGPs 表位的丟失或重塑有關(guān)，這與AGPs 碳水化合物結(jié)構(gòu)域的降解緊密相關(guān)。因此，果實(shí)中特異的阿拉伯聚糖沉積并附著在細(xì)胞壁及細(xì)胞間隙很可能是導(dǎo)致果實(shí)成熟的關(guān)鍵因素。

果實(shí)軟化與纖維素的合成，以及纖維素微纖絲的物理特性及其沉積有關(guān)［3］。細(xì)胞外基質(zhì)中纖維素的定位與細(xì)胞壁中其他成分的存在有關(guān)［39］。纖維素微纖絲被阿拉伯聚糖和半乳糖側(cè)鏈直接連接，因此AGPs 碳水化合物的損失與纖維素微纖絲的解體有關(guān)，這導(dǎo)致果實(shí)軟化和細(xì)胞分離的變化［40］。有證據(jù)表明，果膠酶的最高濃度對(duì)所檢測(cè)的番茄果實(shí)AGPs 表位的分布有影響，也對(duì)纖維素的存在有影響［29］；這與本研究結(jié)果相似。眾所周知，纖維素酶是由多種纖維素酶類組成的混合酶，通過(guò)纖維素的分解參與了果實(shí)發(fā)育和成熟階段細(xì)胞壁物質(zhì)降解［41］。Cx 酶作用于纖維素，使細(xì)胞壁中纖維素微纖絲-半纖維素-果膠連接的結(jié)構(gòu)松散，導(dǎo)致果實(shí)軟化。本研究結(jié)果表明，同樣缺乏另一種細(xì)胞壁成分，即AGPs 蛋白聚糖導(dǎo)致纖維素不同程度的解體。這些結(jié)果表明，熒光信號(hào)的降低與碳水化合物鏈的降解、細(xì)胞壁的擴(kuò)張以及纖維素組裝的變化相聯(lián)系。

隨著果實(shí)成熟衰老，多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠甲酯酶（PME）和纖維素酶等活性增加，果膠、纖維素組分降解，導(dǎo)致果肉軟化［1］。李歡等［42］測(cè)定了鮮食棗‘冬棗’（Z.jujuba‘Dongzao’）、制干棗‘木棗’（Z.‘Muzao’）和‘駿棗’（Z.‘Junzao’）果實(shí)成熟和軟化7 個(gè)發(fā)育時(shí)期細(xì)胞壁物質(zhì)（果膠和纖維素）含量及相關(guān)酶類（PG、PE或PME、Cx）活性，比較結(jié)果表明，鮮食棗靈武長(zhǎng)棗、冬棗與木棗、駿棗果實(shí)質(zhì)地和成熟軟化機(jī)制不同，棗果實(shí)成熟過(guò)程與果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶基因等細(xì)胞壁代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控相關(guān)；揭示了鮮食棗與制干棗成熟過(guò)程的細(xì)胞壁物質(zhì)及酶類生理和分子調(diào)控的不同機(jī)制，為深入探究棗果實(shí)成熟品質(zhì)調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。

3.2 酶促因素和非酶促因素影響均可能導(dǎo)致AGPs排列中斷

果實(shí)的成熟軟化受到多種內(nèi)外因素的影響。果實(shí)軟化主要是在多種胞壁水解酶的作用下，細(xì)胞壁多糖發(fā)生降解和解聚合，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變，胞壁結(jié)構(gòu)分離造成的。除外源果膠酶的作用外，內(nèi)源PG、PME、Cx、β-Gal 等與果實(shí)細(xì)胞壁多糖降解或解聚密切相關(guān)，在果實(shí)成熟軟化的不同時(shí)期起著不一樣的作用［43］。除酶促因素外，內(nèi)源乙烯［43］、抗壞血酸［44］等非酶促因素也可能導(dǎo)致果實(shí)細(xì)胞壁多糖的降解，引起細(xì)胞壁疏松，促進(jìn)果實(shí)軟化。因此，果實(shí)的軟化可能是多種因素共同作用引起細(xì)胞壁多糖的降解進(jìn)而導(dǎo)致AGPs 與細(xì)胞壁中的其他基本組分復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)破壞的結(jié)果，影響了AGPs 在細(xì)胞壁中的分布以及AGPs 抗原表位排列的改變。

由此看來(lái)，適宜濃度的果膠酶逐漸溶解靈武長(zhǎng)棗果實(shí)中大部分的果膠多糖和纖維素、半纖維素，內(nèi)源細(xì)胞壁修飾酶促進(jìn)了果膠、纖維素、半纖維素的酶切，導(dǎo)致果膠多糖的斷裂，纖維素-半纖維素-果膠連接的結(jié)構(gòu)松散，因而果實(shí)自然軟化。成熟的果實(shí)細(xì)胞AGPs 減少、細(xì)胞壁硬度降低與果膠多聚體等細(xì)胞壁物質(zhì)分解增加有關(guān)，這是細(xì)胞壁修飾酶活性較高的機(jī)制，其參與了阿拉伯半乳糖-果膠復(fù)合物的降解增溶作用，導(dǎo)致熟化過(guò)程中細(xì)胞壁松弛。因而，針對(duì)不同AGPs 抗原表位抗體的標(biāo)記模式不同，熒光信號(hào)呈現(xiàn)多樣性。

3.3 果膠酶的作用影響了果實(shí)成熟過(guò)程

影響果實(shí)結(jié)構(gòu)的成熟關(guān)聯(lián)變化與許多因素有關(guān)，但其中最顯著的決定因素之一是果膠酶的活性［3，7］。果實(shí)發(fā)育初期果皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密均勻而連續(xù)，在發(fā)育后期成熟過(guò)程中出現(xiàn)解體和松散。說(shuō)明果膠的溶解和解聚合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁之間空隙增大，細(xì)胞間粘合力降低，細(xì)胞間隙不斷增大，使胞壁水解酶更好接觸底物，從而導(dǎo)致果實(shí)的軟化［45］。本研究表明，果膠酶的作用引起組織的微結(jié)構(gòu)改變，但誘導(dǎo)細(xì)胞壁的改變與自然成熟果實(shí)中發(fā)生的改變不具有可比性。本研究采用不同濃度水平的細(xì)胞壁水解酶對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行酶解，觀察結(jié)果表明果膠酶的作用可能影響了果實(shí)成熟過(guò)程。由此看來(lái)，根據(jù)果實(shí)質(zhì)地和成熟軟化機(jī)制不同，通過(guò)果膠酶等調(diào)控果實(shí)成熟進(jìn)程，對(duì)果實(shí)成熟軟化及品質(zhì)調(diào)控具有重要意義。

因此，4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期果皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異對(duì)細(xì)胞壁功能具有影響，也與AGPs 分布相關(guān)。果實(shí)AGPs 碳水化合物的分布因多種因素而不同，這與果實(shí)組織結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。盡管組成果實(shí)細(xì)胞壁的纖維素和果膠多糖是果實(shí)成熟的基本要素和關(guān)鍵因素，但筆者認(rèn)為各成分之間的相互作用在控制成熟和采后生理方面的作用最為顯著。AGPs 聚糖鏈的缺失使所有細(xì)胞壁成分之間相互作用的建立發(fā)生中斷和重塑，誘導(dǎo)整個(gè)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變。