薄層鑒別結(jié)合多成分測(cè)定方法評(píng)價(jià)苓桂術(shù)甘顆粒質(zhì)量

馬曉敏，周建新，肖蘇萍*，謝彬，3，李龍妹，3，陳蒙，杜杰，王繼永，盧亞楠

1.中國(guó)中藥有限公司，北京 102600；2.北京城市學(xué)院，北京 100191；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

苓桂術(shù)甘湯出自東漢·張仲景《金匱要略》，主治心下痰飲、胸脅支滿、三焦有水氣，溫陽(yáng)以化飲，使水飲下行，療效確切，是苓桂劑的代表方劑。原方由茯苓、桂枝、白術(shù)和甘草4 味藥組成，“以水六升，煮取三升，分溫三服”[1]。苓桂術(shù)甘湯是治療痰飲的代表方劑，痰飲疾病癥狀復(fù)雜，易累及其他系統(tǒng)?，F(xiàn)代臨床研究表明，苓桂術(shù)甘湯對(duì)于心系疾病、肺系疾病和腎系疾病等均有確切療效[2-3]。桂枝的主要有效成分為桂皮醛、肉桂酸、原兒茶酸和香豆精等，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱和抗驚厥作用，桂皮醛、肉桂酸為其中主要有效成分。白術(shù)中主要含有多糖、揮發(fā)油、內(nèi)酯類和綠原酸類成分。綠原酸類成分具有抑菌、抗感染、抗腫瘤、調(diào)血脂、調(diào)血糖、保護(hù)心血管、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，其在抑菌、抗感染等方面研究較多，并可與其他有效成分共同發(fā)揮藥理活性[4-7]。苓桂術(shù)甘顆粒中白術(shù)內(nèi)酯類成分含量較低，且采用高效液相色譜法較難分離。結(jié)合近年來相關(guān)研究[4-7]，選擇肉桂酸、桂皮醛、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸作為定量指標(biāo)，肉桂酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為定性指標(biāo)評(píng)價(jià)苓桂術(shù)甘顆粒的質(zhì)量。

依據(jù)《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[8]的要求，將苓桂術(shù)甘湯經(jīng)現(xiàn)代制備工藝制成使用便攜、劑量準(zhǔn)確的顆粒制劑。經(jīng)典名方研發(fā)需“遵古”，即按照古籍記載的工藝確定基準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)后，顆粒制劑需與基準(zhǔn)樣品質(zhì)量保持一致，并建立制劑的相關(guān)質(zhì)量控制方法。目前，對(duì)于經(jīng)典名方苓桂術(shù)甘湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究多針對(duì)基準(zhǔn)樣品進(jìn)行，尚未有公布的苓桂術(shù)甘顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過薄層鑒別及含量測(cè)定方法對(duì)苓桂術(shù)甘顆粒的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為苓桂術(shù)甘顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Visualizer 型薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)、Linomat型薄層色譜半自動(dòng)點(diǎn)樣儀（卡瑪公司）；AE 240 型電子天平[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]；XB320M 型電子天平（Presisa 公司）；KQ-500E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；3-16L 型離心機(jī)（Sartorius 公司）；e2695 型高效液相色譜儀（Waters公司）。

1.2 試藥

苓桂術(shù)甘顆粒（自制，批號(hào)分別為L(zhǎng)G2220411001、LG220331003、LG220331004）；對(duì)照藥材桂枝、白術(shù)（批號(hào)分別為121191-201906、120925-202013），對(duì)照品肉桂酸、桂皮醛、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、綠原酸（批號(hào)分別為110786-201604、110710-202223、111976-201501、111978-201501、110753-202119，純度分別為99.8%、99.5%、96.3%、≥98%、≥98%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；苓桂術(shù)甘桂枝、白術(shù)陰性顆粒（自制，批號(hào)分別為L(zhǎng)G220715GZY、LG220715BZY）；對(duì)照品新綠原酸、隱綠原酸（成都埃法生物有限公司，批號(hào)分別為AF20030804、AF21010310，純度分別均為98%）；水為娃哈哈純凈水；甲醇、乙酸乙酯、石油醚、甲酸、乙醚均為分析純；乙腈、磷酸為色譜純；硅膠GF254薄層板（青島譜科分離材料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱定桂皮醛17.31 mg、肉桂酸10.69 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ5.88 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ9.32 mg，分別置于10 mL 量瓶中甲醇定容，得桂皮醛、肉桂酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量濃度分別為1.731、1.069、0.588、0.932 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液制備 桂枝對(duì)照藥材：取桂枝對(duì)照藥材粉末2 g，加乙醚10 mL，浸泡30 min，時(shí)時(shí)振搖，濾過，濾液揮干，殘?jiān)尤燃淄? mL 使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

白術(shù)對(duì)照藥材：取白術(shù)對(duì)照藥材粉末0.5 g，加正己烷2 mL，超聲處理15 min（250 W，40 kHz），濾過，取濾液作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取苓桂術(shù)甘顆粒5 g，加水20 mL 使溶解，乙醚萃取2 次，每次20 mL。收集乙醚層，揮干，殘?jiān)蛹状? mL 復(fù)溶，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 取缺白術(shù)的苓桂術(shù)甘顆粒和缺桂枝的苓桂術(shù)甘顆粒各5 g，加水20 mL 使溶解，乙醚萃取2 次，每次20 mL。收集乙醚層，揮干，殘?jiān)蛹状? mL復(fù)溶，作為陰性樣品溶液。

2.1.5 薄層色譜鑒別 照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取桂皮醛對(duì)照品溶液、肉桂酸對(duì)照品溶液各5 μL，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液各5 μL，桂枝對(duì)照藥材溶液5 μL，白術(shù)對(duì)照藥材溶液8 L，供試品溶液20 μL，白術(shù)、桂枝陰性樣品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（17∶4∶0.1）為展開劑，預(yù)先飽和15 min，展開，取出，晾干，置于紫外254 nm 檢視，在與桂皮醛對(duì)照品、肉桂酸對(duì)照品、桂枝對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。噴以5%二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下烘烤3 min，置于紫外366 nm檢視，在與白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌?、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品、白術(shù)對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)（圖1）。

圖1 苓桂術(shù)甘顆粒薄層鑒別

2.1.6 3 批苓桂術(shù)甘顆粒薄層色譜鑒別 對(duì)3 批實(shí)驗(yàn)室自制苓桂術(shù)甘顆粒樣品使用2.1.5 項(xiàng)下方法進(jìn)行薄層鑒別，見圖2。

圖2 苓桂術(shù)甘顆粒薄層鑒別多批驗(yàn)證

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 X-Bridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相洗脫梯度（0～25 min，7%～13%A；25～30 min，13%～30%A；30～40 min，30%A；40～50 min，30%～32%A）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為290、325 nm；進(jìn)樣量：10 μL，色譜圖見圖3。

圖3 苓桂術(shù)甘顆粒高效液相色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品新綠原酸3.150 mg、綠原酸2.720 mg、隱綠原酸3.185 mg、肉桂酸4.735 mg、桂皮醛5.06.mg，置10 mL量瓶中，吸取該對(duì)照品母液1 mL至50 mL量瓶甲醇定容，即得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、肉桂酸、桂皮醛質(zhì)量濃度分別為6.30、5.44、6.37、9.47、10.12 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取苓桂術(shù)甘顆粒約1 g，精密稱定，置50 mL 錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，45 kHz）30 min，放至室溫，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 專屬性考察 按2.2.3 項(xiàng)下方法制備苓桂術(shù)甘顆粒樣品溶液、陰性樣品溶液、陽(yáng)性樣品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，觀察陰性樣品在目標(biāo)峰相同位置是否有干擾，結(jié)果見圖4。桂枝、白術(shù)陰性樣品無(wú)干擾，此方法專屬性強(qiáng)。

圖4 苓桂術(shù)甘顆粒缺桂枝、白術(shù)陰性圖譜

2.2.5 線性關(guān)系考察 采用二倍稀釋法對(duì)混合對(duì)照品母液進(jìn)行稀釋，新綠原酸質(zhì)量濃度分別為68.40、34.20、17.10、7.88、3.90、0.95 μg·mL-1；綠原酸質(zhì)量濃度分別為54.60、27.30、13.65、6.83、3.41、1.71 μg·mL-1；隱綠原酸質(zhì)量濃度分別 為63.70、31.85、15.93、7.96、3.90、0.98 μg·mL-1；肉桂酸質(zhì)量濃度分別為10.12、5.06、1.27、0.63、0.32、0.16 μg·mL-1。按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系見表1。

表1 苓桂術(shù)甘顆粒中5個(gè)成分線性關(guān)系

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、肉桂酸和桂皮醛的峰面積的RSD 分別為2.87%、0.60%、0.78%、0.44%、0.62%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、肉桂酸和桂皮醛峰面積的RSD 分別為1.62%、0.52%、2.03%、0.15%、0.49%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取苓桂術(shù)甘顆粒，按2.2.3 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、肉桂酸和桂皮醛的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.050 0、0.207 8、0.061 7、0.223 6、1.205 6 mg·g-1，RSD 分別為2.14%、0.87%、1.12%、0.29%、1.00%，表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的苓桂術(shù)甘顆粒，按1∶1 比例加入混合對(duì)照品，平行制備6 份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、肉桂酸、桂皮醛的加樣回收率分別為109.46%、93.45%、97.04%、103.70%、102.41%，RSD 均小于3%。

2.2.10 3 批苓桂術(shù)甘顆粒5 個(gè)成分的含量測(cè)定 結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 薄層鑒別條件考察

薄層鑒別色譜圖中因顆粒劑中桂皮醛斑點(diǎn)較弱，考慮到桂皮醛成分不穩(wěn)定，桂枝對(duì)照藥材在366 nm下顯示斑點(diǎn)與白術(shù)內(nèi)酯類成分比移值接近；白術(shù)對(duì)照藥材斑點(diǎn)較多，但主要斑點(diǎn)為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ。因此，選擇肉桂酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為薄層鑒別指標(biāo)鑒別苓桂術(shù)甘湯顆粒?？疾炝瞬煌崛》绞剑ɑ亓魈崛　⒊曁崛?、有機(jī)溶劑萃取），3 種提取方式對(duì)肉桂酸斑點(diǎn)影響較大，采用有機(jī)溶劑萃取法獲得的肉桂酸斑點(diǎn)最為清晰。因此，選擇有機(jī)溶劑萃取。此外，考察了不同取樣量、不同點(diǎn)樣量，其中取樣量5 g、供試品點(diǎn)樣量15 μL，斑點(diǎn)最為清晰。不同溫度對(duì)薄層條件無(wú)影響，但是濕度對(duì)薄層條件影響較大，濕度越大，薄層色譜分離越差，相對(duì)濕度為35%時(shí)效果較好。

3.2 含量測(cè)定條件考察

對(duì)含量測(cè)定的色譜條件和提取條件進(jìn)行考察?？疾炝? 種型號(hào)色譜柱CAPCELL PAK、X-Bridge，乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水對(duì)色譜圖的影響。結(jié)果X-Bridge 色譜柱、乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相效果更佳；又分別考察了超聲提取和回流提取，甲醇提取、乙醇提取和水提取，25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇提取，提取15、30、45 min，加溶劑10、20、30 mL，結(jié)果以加25%甲醇20 mL提取30 min最佳。

3.3 方法可行性的探討

《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版收載的中藥復(fù)方制劑中薄層鑒別或含量測(cè)定方法大多是多項(xiàng)鑒別、多項(xiàng)含量測(cè)定、制備多種供試品溶液、多塊薄層板、展開多次、鑒別不同藥材、不同色譜條件、測(cè)定不同成分的傳統(tǒng)鑒別模式。為排除干擾，樣品前處理復(fù)雜、繁瑣、試劑耗材消耗大、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，而且對(duì)環(huán)境造成污染。本研究建立了苓桂術(shù)甘顆粒中桂枝、白術(shù)2 味中藥同時(shí)定性、定量質(zhì)量控制方法，可縮短檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)、節(jié)約試劑耗材、減少環(huán)境污染等。由于桂枝、白術(shù)2 味中藥的成分在苓桂術(shù)甘湯中的含量差異較大，顆粒制劑與基準(zhǔn)樣品因輔料等略有差異，本研究的含量測(cè)定方法從經(jīng)濟(jì)適用性和標(biāo)準(zhǔn)方法可行性上具有一定參考價(jià)值，但顆粒質(zhì)量是否完全與基準(zhǔn)樣品一致需多批量樣品驗(yàn)證。

4 結(jié)語(yǔ)

苓桂術(shù)甘顆粒為古代經(jīng)典名方苓桂術(shù)甘湯經(jīng)現(xiàn)代工藝制備而成的復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和控制難度較大。本研究建立的方法還未見報(bào)道。建立不同的質(zhì)量控制方法對(duì)保證經(jīng)典名方的質(zhì)量具有一定意義。本研究使用了薄層鑒別和高效液相方法同時(shí)對(duì)苓桂術(shù)甘顆粒中的桂枝、白術(shù)相關(guān)成分進(jìn)行測(cè)定，在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)進(jìn)行2 味中藥的薄層鑒別和含量測(cè)定，能夠更好地反映苓桂術(shù)甘顆粒的信息，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，方法可行。