亞臨界水法制備姜黃素納米粒及其透膜性能分析

趙文英，鄭文迪，宋曉旭，王 珧，劉 蓓，陳 蕾，朱慶書,2,

（1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266000；2.青島科技大學(xué)高密校區(qū)，山東 高密 261550）

姜黃素是從姜科植物根莖中提取出的多酚類化合物，近年研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素有優(yōu)異的抗氧化、抗炎、抑菌等活性[1]，可廣泛用于食品、藥品、化妝品等行業(yè)。但其水溶性差，難以跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，限制了應(yīng)用[2]。對于水難溶性藥物，近年來常將其制備成納米制劑改善其缺陷[3-5]。目前，納米制劑的制備主要分為兩類，其中一類是將藥物負(fù)載在納米載體中，形成復(fù)合物靶向運(yùn)送到給藥位點(diǎn)[6-9]，然而納米載體本身或其降解產(chǎn)物常存在潛在毒性，因此，人們更傾向于制備無載體納米粒[10-11]。

溶劑沉淀法[12-14]是一種制備無載體納米粒的技術(shù)，其中需要使用有機(jī)溶劑溶解水難溶性藥物，如Sharma等[15]采用反溶劑沉淀法，以丙酮為溶劑制備姜黃素納米結(jié)晶，明顯改善了姜黃素的溶解速率，但眾所周知，丙酮等有機(jī)溶劑會(huì)產(chǎn)生溶劑殘留并對人體和環(huán)境造成危害。因此，研究人員致力于使用綠色環(huán)保溶劑替代有機(jī)溶劑，如超臨界CO2、亞臨界水等。忻娜[16]、劉曉靜[17]等采用超臨界CO2抗溶劑法制備了姜黃素與不同載體材料的復(fù)合微粒，大幅度提高了姜黃素的溶出度，但鮮見采用亞臨界水法制備姜黃素納米粒的研究報(bào)道。將水加熱至沸點(diǎn)以上，通過調(diào)節(jié)體系的壓力使其依舊保持液體狀態(tài)，稱為亞臨界水。亞臨界水具有隨溫度升高，介電常數(shù)降低的特性，可用于代替有機(jī)溶劑溶解脂溶性強(qiáng)的藥物[18]。目前已有使用亞臨界水藕合溶劑沉淀法制備來曲唑[19]、磺胺甲惡唑[20]以及倍氯米松[21]等化學(xué)合成藥物納米粒的文獻(xiàn)報(bào)道，從理論到實(shí)踐證明了采用亞臨界水技術(shù)制備水難溶性成分納米粒的可行性。本研究采用亞臨界水法制備姜黃素納米粒，以期為開發(fā)姜黃素綠色環(huán)保遞送系統(tǒng)提供支持，為天然來源功能性成分制備納米粒提供技術(shù)和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素（純度98%）南京都萊生物科技有限公司；家兔由青島科技大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供；甲醇（色譜純）德國Merck公司；乳糖、羥丙基甲基纖維素（hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC）、聚乙烯吡咯烷酮K30（polyvinyl pyrrolidone K-30，PVPK30）、無水乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1000型紫外分光光度儀 北京萊伯泰儀器有限公司；激光粉塵粒度儀 昆山鷺工精密儀器有限公司；regulus8100掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本日立株式會(huì)社；Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國賽默飛公司；DSC204F1差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）德國耐馳公司；U3000高效液相色譜儀 戴安中國有限公司；加壓提取器由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 方法

1.3.1 姜黃素納米粒制備

稱取適量姜黃素，置于加壓提取器中，加入一定量的乙醇/水混合溶劑，密閉容器；容器內(nèi)加壓并保持在0.5 MPa，調(diào)節(jié)溫度，當(dāng)溫度達(dá)到設(shè)定值時(shí)開始計(jì)時(shí)，保溫30 min后，從取樣口將提取器中的溶液勻速滴入到接收溶劑（含有穩(wěn)定劑的去離子水）中，邊滴加邊攪拌（磁力攪拌，轉(zhuǎn)速500 r/min），直至滴加結(jié)束，得到含有姜黃素納米粒的混懸液。探討接收溶劑溫度、亞臨界水溫度、亞臨界水/接收溶劑體積比、穩(wěn)定劑類型及用量等因素對混懸液中姜黃素納米粒的影響。

1.3.2 納米混懸液載藥量測定

按參考文獻(xiàn)[22]的方法，以80%乙醇溶液為溶劑，在最大吸收波長426 nm處測定吸光度A426nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A426nm=0.137 1C＋0.001 1（R=0.999 9），在0.4～6.4 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算混懸液中姜黃素的含量。載藥量計(jì)算公式如下：

1.3.3 納米粒粒度分布測定

使用激光粉塵粒度儀測定姜黃素混懸液中納米粒的粒徑、多分散指數(shù)（polydisperse index，PDI）以及Zeta電位。將所制得姜黃素納米粒混懸液用適量的去離子水稀釋，取1.5 mL樣品放入石英比色皿中，在25 ℃恒溫條件下每組樣品重復(fù)測定3 次。

1.3.4 FTIR分析

將姜黃素納米粒和姜黃素原料藥溶于無水乙醇，揮干溶劑后與溴化鉀混勻，壓片。在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)對樣品進(jìn)行掃描，記錄數(shù)據(jù)并繪圖進(jìn)行分析。

1.3.5 SEM表征

將姜黃素納米?；鞈乙旱渭拥焦杵?，烘干后用導(dǎo)電膠黏附在樣品臺(tái)上，姜黃素原料藥直接涂抹在導(dǎo)電膠上，將制備好的樣品噴金后在SEM下觀察顆粒形貌。

1.3.6 DSC分析

姜黃素原料藥、姜黃素納米粒進(jìn)行DSC分析。掃描范圍在24～245 ℃之間，以10 ℃/min速率升溫。記錄結(jié)果，繪制分析DSC曲線。

1.3.7 姜黃素納米粒透膜性能考察

1.3.7.1 Franz擴(kuò)散池法

以市售豬腸衣為半透膜，采用Franz擴(kuò)散池法考察姜黃素納米粒透膜性能。接受池中加入適量生理鹽水，將溫度設(shè)置為37 ℃，以300 r/min恒速磁力攪拌，定時(shí)取樣。取出的樣品用適量乙醇稀釋，以80%乙醇溶液為空白對照，測定其在426 nm波長處的吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。以累積滲透量衡量藥物透膜吸收的程度，計(jì)算公式如下：

式中：Q為累積滲透量/（μg/cm2）；V0為接受池體積/mL；Cn為第n次取樣測得的樣品質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為取樣體積/mL；Ci為第n-1次取樣測得的樣品質(zhì)量濃度/（μg/mL）；A為擴(kuò)散池有效面積/cm2。

1.3.7.2 姜黃素體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程

采用高效液相色譜法測定姜黃素在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的質(zhì)量濃度。色譜條件：Supersil ODS柱，柱溫25 ℃，甲醇-2%冰醋酸溶液（75∶25，V/V）為流動(dòng)相，流速1 mL/min。

配制不同質(zhì)量濃度的姜黃素-血漿樣品C，測量各樣品中姜黃素的峰面積A，得到血漿中姜黃素的線性回歸方程A=0.019 7C＋0.026 1（R=0.999 2），質(zhì)量濃度在2～200 ng/mL范圍內(nèi)線性良好。

選取家兔進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分別配制20 mg/kg姜黃素原料藥混懸液和20 mg/kg姜黃素納米?；鞈乙?，灌胃給藥后分別于0.17、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h心臟取血2 mL，樣品按常規(guī)方法處理后，注入高效液相色譜儀，測定樣品中姜黃素的質(zhì)量濃度，繪制藥-時(shí)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次，取平均值，使用Excel 2016軟件作圖，使用DAS2.0軟件計(jì)算分析藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備姜黃素納米粒影響因素分析

功能性成分的粒徑越小，越易跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，因而具有較高的生物利用度，但物質(zhì)的粒徑越小，越具有較高的表面能而易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，造成分散體系不穩(wěn)定[23]，因此，在制備納米粒時(shí)，必須兼顧粒徑和體系穩(wěn)定性。將制備好的姜黃素納米粒在25 ℃測定粒徑、PDI和Zeta電位，檢測各因素對納米粒粒徑、粒徑分布均勻度以及穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見表1。隨亞臨界水溫度（110～140 ℃）升高，姜黃素粒徑由177.5 nm增加至205.4 nm。目前普遍認(rèn)為亞臨界水法制備納米粒的機(jī)理[24]是通過提高溫度增加水難溶性物質(zhì)在亞臨界水中的溶解度，當(dāng)環(huán)境溫度降低時(shí)，溶液處于過飽和狀態(tài)，水難溶性物質(zhì)迅速析出，在一定范圍內(nèi)顆粒析出速率越快，析出的顆粒粒徑越小。接收溶劑溫度由30 ℃降至0 ℃，粒徑由211.9 nm變?yōu)?70.3 nm，進(jìn)一步證實(shí)了該機(jī)理的合理性。但隨溫度升高，姜黃素在亞臨界水中溶解度越大，在溫度降低后，短時(shí)間形成晶核顆粒數(shù)量越多，這些具有較高表面能的晶核發(fā)生碰撞聚合的幾率越大，從而形成更大粒徑的顆粒。

表1 影響姜黃素納米粒粒徑、PDI、Zeta電位的因素Table 1 Influence of processing conditions on particle size,PDI and zeta potential of Cur nanoparticles

除亞臨界水和接收溶劑溫度會(huì)影響納米粒粒徑外，二者體積比也會(huì)影響姜黃素納米粒的大小，接收溶劑用量增加至3 倍（由1∶1變?yōu)?∶3）則姜黃素粒徑由269.8 nm降至170.7 nm。這是因?yàn)榻邮杖軇┻^少，瞬時(shí)形成的大量晶核不能迅速稀釋，晶核之間容易發(fā)生碰撞，進(jìn)而團(tuán)聚成大顆粒；但當(dāng)接收溶劑用量過大，與亞臨界水的比例由1∶3增至1∶5時(shí)，姜黃素飽和溶液被接收溶劑稀釋，晶核生成量相應(yīng)減少，但晶體生長加劇，粒徑也會(huì)變大。

Danaei等[25]研究認(rèn)為，在一定范圍內(nèi)粒徑小、分布窄的溶液系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性，并且PDI值在0.1～0.25之間表明粒徑分布窄，大于0.5則表示粒徑分布廣。本實(shí)驗(yàn)制備的納米粒PDI均在0.1～0.25 之間，制備工藝各因素對其粒徑大小均勻度的影響較小。

納米粒因具有較高的表面能，易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，因此接收溶劑中加入適量穩(wěn)定劑，有助于姜黃素納米粒均勻分散在水中，防止納米粒團(tuán)聚。通常認(rèn)為添加一些位阻較大的長鏈分子或者枝狀分子能起到提高納米粒膠體穩(wěn)定性的作用，這是因?yàn)槲蛔栊?yīng)保證了納米粒之間的有效排斥。基于此種考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇HPMC、PVPK30兩種表面活性劑作為穩(wěn)定劑，結(jié)果顯示HPMC和PVPK30均使納米粒粒徑變大，并且穩(wěn)定性變差（Zeta電位分別為0.3 mV和-17.1 mV）；而選用水溶性糖類——乳糖作為穩(wěn)定劑時(shí)，能有效降低納米粒粒徑，還能增強(qiáng)體系穩(wěn)定性。其原因可能是乳糖吸附在納米粒表面，降低了顆粒表面能，使晶體生長速度減慢，從而形成粒徑更小的納米粒。但當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度（0.08 g/100 mL）超過一個(gè)臨界值時(shí)，由于糖類本身具有的黏接性導(dǎo)致納米粒黏附成團(tuán)，反而使粒徑增大，此前已有文獻(xiàn)[20,26]證實(shí)，穩(wěn)定劑濃度增加會(huì)產(chǎn)生類似的情況。為進(jìn)一步考察穩(wěn)定劑對納米粒穩(wěn)定性的影響，將加入3 種穩(wěn)定劑的姜黃素納米混懸液室溫下放置7、14、21 d，結(jié)果見表2。隨放置時(shí)間延長，以乳糖為穩(wěn)定劑的混懸液中納米粒粒徑變化不明顯，而HPMC和PVPK30為穩(wěn)定劑的納米粒粒徑明顯增大。

表2 穩(wěn)定劑對姜黃素納米粒粒徑的影響Table 2 Influence of stabilizing agents on the mean particle size of Cur nanoparticles nm

由于姜黃素的水難溶性，盡管采用亞臨界水為溶劑，其溶解度仍然較小，如在純水體系中，所制備納米粒粒徑為141 nm，但其載藥量僅為2.35%，因此考慮加入適量乙醇作為夾帶劑改善姜黃素的溶解性。當(dāng)增加體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，納米粒的粒徑逐漸增大，體系的載藥量也逐漸增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，粒徑為168.4 nm，載藥量增加至69.5%，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加至50%時(shí)，粒徑為235.5 nm，載藥量為87.3%，但體系的穩(wěn)定性有所下降（Zeta電位的絕對值由29.5 mV降至22.4 mV）。原因在于姜黃素在乙醇/水混合溶液中的溶解度增大，則溶液中姜黃素含量增大，促進(jìn)晶體成核、晶核間發(fā)生二次碰撞的概率增加，使納米粒粒徑增大，并使體系穩(wěn)定性下降。

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在接收溶劑溫度0 ℃、亞臨界水溫度120 ℃、亞臨界水與接收溶劑體積比為1∶3、穩(wěn)定劑乳糖質(zhì)量濃度0.04 g/100 mL、夾帶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)30%條件下，制得3 批姜黃素納米粒，平均粒徑為（166±2.7）nm，PDI為0.125±0.01，Zeta電位為（-29.8±0.62）mV，載藥量為（70.2±0.93）%。

2.3 FTIR分析結(jié)果

如圖1所示，3 361 cm-1處為姜黃素酚羥基伸縮振動(dòng)峰，2 920、2 850 cm-1附近為亞甲基伸縮振動(dòng)峰，1 660、1 646 cm-1和1 633 cm-1的峰與C＝O和C＝C基團(tuán)的伸縮振動(dòng)相關(guān)，1 470～1 416 cm-1范圍內(nèi)的峰與C＝C和苯環(huán)相關(guān)[27]。姜黃素納米粒與原料藥在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)的特征峰位置一致，峰強(qiáng)基本沒有變化。由此可知，亞臨界水制備姜黃素納米粒沒有改變藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1 姜黃素納米粒和姜黃素原料藥的FTIR圖Fig.1 FTIR spectra of Cur and Cur nanoparticles

2.4 姜黃素納米粒表征

2.4.1 SEM分析

圖2a、b為姜黃素原料藥SEM圖譜，形態(tài)呈不規(guī)則塊狀；圖2c、d為姜黃素納米粒SEM圖譜，呈現(xiàn)球形狀態(tài)，顆粒大小分布均勻，分散度較好。

圖2 姜黃素原料藥（a、b）和姜黃素納米粒（c、d）SEM圖Fig.2 Scanning electron micrographs of Cur (a and b) and Cur nanoparticles (c and d)

2.4.2 DSC分析

由圖3可知，姜黃素原料藥的熔融峰在182.4 ℃，尖銳且強(qiáng)，說明其以穩(wěn)定的晶體形式存在；姜黃素納米粒的熔點(diǎn)為174.7 ℃，相比于原料有所降低。眾所周知，熔點(diǎn)與微觀結(jié)構(gòu)中物質(zhì)間的作用力大小有關(guān)，因此，熔點(diǎn)降低說明納米粒的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變；另外，姜黃素納米粒的熔融峰由原來的尖而強(qiáng)變成矮而寬，可知姜黃素納米粒的結(jié)晶度下降，傾向于以無定型形式存在，與SEM視野下納米粒為球形結(jié)果一致。

圖3 姜黃素原料藥和姜黃素納米粒的DSC圖譜Fig.3 DSC curves of Cur and Cur nanoparticles

2.5 姜黃素納米粒透膜性能

2.5.1 Franz擴(kuò)散池法

由圖4可知，姜黃素納米粒和原料藥的累積滲透量隨時(shí)間延長而增加，但原料藥累積滲透量在12 h內(nèi)緩慢增長，而姜黃素納米粒的累積滲透量在12 h內(nèi)迅速增加，尤其是在初始2 h內(nèi)，其滲透速率為原料藥的25 倍，這可能與姜黃素納米粒水溶性增強(qiáng)，跨越腸衣膜后能迅速分散在接受液中，使膜兩側(cè)濃度差在一定時(shí)間內(nèi)保持在較高水平有關(guān)；而后，隨著膜兩側(cè)濃度差逐漸減小，姜黃素納米粒的累積滲透量增長放緩，但仍遠(yuǎn)高于原料藥的累積滲透量。12 h后，納米粒的累積滲透量為180.22 μg/cm2，為原料藥累積滲透量（27.68 μg/cm2）的6.6 倍，二者差異顯著；24 h后原料藥的最終透過率僅為33%，而納米粒的跨膜透過率達(dá)到了90%以上，即姜黃素納米粒經(jīng)腸道跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)幾乎不會(huì)產(chǎn)生藥物損失。依據(jù)藥物溶出度和腸道滲透性原理，姜黃素屬于低溶解性、低滲透性的第IV類成分（按照生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)分類）[28]，采用亞臨界水法將其制備成納米粒后，使其更易透過小腸壁跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，不僅能提高姜黃素吸收速率，而且能增加其吸收總量，有助于提高此類功能性成分在體內(nèi)的作用。

圖4 姜黃素原料藥和姜黃素納米粒體外透皮累積滲透量Fig.4 Transdermal permeability of Cur nanoparticles and Cur

2.5.2 姜黃素體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程

姜黃素納米粒及原料藥在家兔體內(nèi)口服藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3，姜黃素在家兔體內(nèi)藥-時(shí)曲線如圖5所示。姜黃素納米粒和原料藥在家兔體內(nèi)消除半衰期一致，沒有顯著差異，轉(zhuǎn)運(yùn)過程符合一級動(dòng)力學(xué)方程；姜黃素納米粒在家兔體內(nèi)質(zhì)量濃度峰值為83.85 ng/mL，為原料藥（21.86 ng/mL）的3.84 倍，這可能與原料藥脂溶性高，易溶解于細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層中，而姜黃素制備成納米粒后，在水中溶解性增強(qiáng)，更易跨過細(xì)胞膜進(jìn)入血液循環(huán)有關(guān)。藥時(shí)曲線下面積（AUC0-t）與進(jìn)入家兔體內(nèi)的藥物量呈正比，姜黃素納米粒及其原料藥的AUC0-t分別為（357.68±5.41）ng·h/mL和（92.39±1.09）ng·h/mL，二者差異顯著（P＜0.01）。張心潔等[28]制備的姜黃素固體脂質(zhì)納米粒和微膠囊相比于未經(jīng)處理的姜黃素，其生物利用度分別提高了4.31 倍和3.19 倍，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差不大。但Bao Chengliu等[29]設(shè)計(jì)的一種可滲透腸道黏液層的α-乳白蛋白納米管制劑，藥代動(dòng)力學(xué)評估顯示，所負(fù)載的姜黃素生物利用度比其游離狀態(tài)高6.85 倍，與本實(shí)驗(yàn)體外透膜性能考察結(jié)果接近。對此，該研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為活體動(dòng)物腸道內(nèi)的黏液可保護(hù)上皮表面不被大多數(shù) 納米粒滲透，從而限制了口服藥物的輸送效率，而體外評價(jià)用腸衣去除了黏液層的影響。

圖5 姜黃素納米粒與姜黃素原料藥-時(shí)曲線Fig.5 Plasma concentration-time curves of Cur nanoparticles and Cur suspension after oral administration

表3 姜黃素納米粒與姜黃素原料藥藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Pharmacokinetic parameters of Cur nanoparticles and Cur

3 結(jié)論

采用亞臨界水法制備姜黃素納米粒，顆粒呈均一球形，在最佳制備工藝條件下，納米粒粒徑為166 nm，放置21 d后，其粒徑仍然在胃腸道可吸收的范圍內(nèi)[30]，而且在不借助其他載體情況下，載藥量可高達(dá)70%以上。FTIR顯示與原料藥相比納米粒的化學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，亞臨界環(huán)境對姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響。所制備的姜黃素納米粒相較于原料藥，在體外顯示出更強(qiáng)的透膜性能，初始2 h的透膜速率為原料藥的25 倍，12 h內(nèi)累積滲透量約為原料藥的6 倍。姜黃素納米粒在家兔體內(nèi)也表現(xiàn)出良好的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力，其達(dá)峰質(zhì)量濃度和藥時(shí)曲線下面積均提高至原料藥的3 倍以上。

姜黃素作用廣泛、毒性低，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域需求量日益增加，但受制于其本身理化性質(zhì)缺陷，相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用十分有限，因此，尋求制備工藝簡單，可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的姜黃素納米制劑方法是推動(dòng)姜黃素產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的關(guān)鍵。亞臨界水法制備姜黃素納米粒，工藝過程簡單，無需使用高分子載體，對機(jī)體無潛在危害；使用亞臨界水代替有機(jī)溶劑，對環(huán)境友好，是一種新型、綠色、前景廣闊的制備納米制劑的方法。