蛋白核小球藻胰脂肪酶抑制肽的分離純化、鑒定及其降脂活性

林 孌，柳雯郡，黃俊媛，賈璦菁，汪登謎，劉 斌，趙 超

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.泉州師范學院海洋與食品學院，福建 泉州 362000；3.福建省海洋藻類活性物質制備與功能開發(fā)重點實驗室，福建 泉州 362000）

當前，全球約40%的成年人超重或肥胖，并呈現(xiàn)快速蔓延的趨勢，肥胖已成為一種全球性的“流行病”[1]。肥胖患者能量攝入大于消耗，主要表現(xiàn)為脂肪過量堆積、脂質代謝紊亂，同時多伴有糖尿病、高胰島素血癥等引起胰島素抵抗，在世界范圍內(nèi)造成嚴重的經(jīng)濟和社會負擔[2]。目前常用降脂藥物如他汀類、貝特類、奧利司他具有一定的降脂效果，但長期服用會產(chǎn)生惡心、腹脹、肌肉酸痛等不良反應，肝毒性大，對繼發(fā)性脂代謝紊亂療效不理想[3]。食源性肽具有顯著的降脂效應，藥效持續(xù)長，副作用小且獲取來源廣泛?，F(xiàn)已從乳清[4-5]、大豆[6-8]、大米[9-10]、沙丁魚[11]、牡蠣[12]以及小球藻[13]等蛋白源的水解產(chǎn)物中分離出了多種降脂肽，其中最早鑒定序列的是乳源蛋白多肽，但對于微藻蛋白源的研究較少。

小球藻是一類普生性單細胞微藻，屬于綠藻門（Chlorophyta）、綠藻綱（Chlorophyceae）、綠球藻目（Chlorococcales）、卵囊藻科（Oocystaceae）、小球藻屬（Chlorella），生態(tài)分布極廣，生長速率快，易于培養(yǎng)，應用價值高，可作為理想的保健食品和預防或輔助藥物，己被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）列為21世紀人類的健康食品[14]。我國于60年代開始大規(guī)模養(yǎng)殖小球藻，以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、普通小球藻（C.vulgaris）和橢圓小球藻（C.ellipoidea）較為常見[15]。蛋白核小球藻中含有大量蛋白質和葉綠素，含量分別高達其干質量的42%～58%和3%～5%，其氨基酸組成高于世界衛(wèi)生組織和FAO頒布的用于人類營養(yǎng)的蛋白質標準，是一種食用安全的優(yōu)質蛋白質資源，2012年我國衛(wèi)生部將其列為新資源食品[16]。小球藻蛋白及其水解肽的多種生物活性已有相關報道，主要集中在抗氧化活性[17-18]、降血壓[19-21]、抗腫瘤[22]、礦物螯合作用[23]等，對于降脂方面的研究較少。以小球藻蛋白為載體，酶解制備活性肽，將會最大程度挖掘肽生物活性的多樣性，從而開發(fā)具有新穎結構和功能的活性肽產(chǎn)品。

Zhang Ruilin等[13]采用酶解、凝膠過濾、液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等方法從小球藻中分離得到一種新的十肽Leu-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg對豬胰脂酶有較好的抑制效果，質量濃度為600 μg/mL時能夠減少3T3-L1細胞內(nèi)27.9%三酰甘油的積累，但對體內(nèi)的降脂效果沒有涉及。Shih等[24]利用血管內(nèi)皮細胞(SVEC4-10細胞)，通過酶聯(lián)免疫吸附檢測實驗發(fā)現(xiàn)一種小球藻11肽Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe能顯著抑制E-選擇素、ICAM、VCAM、MCP-1和ET-1基因的表達，具有預防動脈粥樣硬化的潛力。然而，這些肽功能應用的真正效果取決于它們在靶組織中的穩(wěn)定性、轉運速率和生物利用度，即肽能否保持完整并到達靶器官的能力取決于肽的特性（分子質量、電荷和疏水性）[25]。有關研究表明當多肽藥物分子質量超過700 Da時，其生物利用度將隨著分子質量增加而顯著下降，而分子質量小于500 Da的小肽（2～6 個氨基酸）具有最高的生物利用度[26]。

本研究以蛋白核小球藻為原料，通過前期酶解工藝優(yōu)化制備小球藻蛋白酶解物，采用超濾和葡聚糖凝膠對其進行分離純化，以胰脂肪酶活性抑制率為指標篩選具有降脂活性的肽組分（記為PES），以高糖飲食秀麗隱桿線蟲為模型評價純化肽PES的降脂效果。采用LC-MS/MS鑒定PES肽序列，結合分子對接技術篩選出潛在的胰脂肪酶抑制肽并初步研究其抑制機制，為深入理解蛋白核小球藻及其他微藻蛋白肽調節(jié)脂代謝或抑制肥胖功能提供理論依據(jù)，同時有助于利用蛋白核小球藻資源開發(fā)安全高效的胰脂肪酶抑制肽，促進小球藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白核小球藻粉 福清市新大澤螺旋藻有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、脂肪酶（豬胰）上海源葉生物科技有限公司；秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）野生型N2 福建上源生物科學技術有限公司；油紅O染色液 生工生物工程（上海）股份有限公司；甘油三酯試劑盒、總膽固醇試劑盒、蛋白定量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Infinite M200 Pro多功能酶標儀 帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；冷凍干燥機 北京博勱行儀器有限公司；HD-3紫外檢測儀、DBS-100全自動部分收集、HL-2D恒流泵 上海青浦瀘西儀器廠有限公司；SRA03-11恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；DHG-9203A熒光顯微鏡 德國蔡司股份有限公司；EASY-nLC 1200液相色譜儀、Q Exactive高分辨質譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 小球藻蛋白酶解物的制備

采用pH值調節(jié)法提取小球藻蛋白[27]。利用木瓜蛋白酶酶解小球藻蛋白，采用優(yōu)化后的酶解條件：用純水配制15 mg/mL的小球藻蛋白溶液，調節(jié)pH值至6.0，加入木瓜蛋白酶，酶底比為6 000 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解時間5 h，酶解結束后升溫至100 ℃滅酶10 min，冷卻到室溫，于8 000 r/min離心15 min，取上清液得到小球藻蛋白酶解液，真空濃縮后冷凍干燥，得小球藻蛋白酶解物，記為PE。

1.3.2 PE相對分子質量分布測定

采用高效液相色譜測定PE相對分子質量。配制10 mg/mL的PE溶液，經(jīng)0.45 μm膜過濾后進樣，測試條件參照GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》進行。

1.3.3 小球藻蛋白酶解液的超濾膜分離

用截留分子質量10 kDa和5 kDa的超濾膜對小球藻蛋白酶解液進行超濾，得到不同組分：＞10 kDa、5～10 kDa和＜5 kDa。冷凍干燥后，分別測定3 個組分的胰脂肪酶活性抑制率，收集抑制率最高的組分。

1.3.4 Sephadex G-25凝膠層析

采用葡聚糖凝膠色譜進一步純化，葡聚糖凝膠規(guī)格為Sephadex G-25，洗脫劑為超純水，進樣量為柱體積3%，進樣質量濃度為25 mg/mL，流速為1 mL/min，檢測波長為220 nm。收集每個主峰的洗脫液，冷凍干燥后，分別測定各主峰的胰脂肪酶活性抑制率，得到抑制率最高的主峰，即為蛋白核小球藻胰脂肪酶抑制肽。

1.3.5 胰脂肪酶活性抑制率的測定

參照廖家樂等[28]方法，稍作改動。將80 μL 的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）、40 μL的樣品溶液和120 μL的10 mg/mL胰脂肪酶溶液，混合均勻后于37 ℃溫育10 min，立即加入160 μL的0.8 mmol/L棕櫚酸對硝基苯酯（p-nitrophenyl phosphate，pNPP）作為底物，于37 ℃反應20 min。反應結束后，100 ℃水浴5 min以終止反應。離心去除沉淀，取200 μL上清液在405 nm波長處測定吸光度。對照組用緩沖液代替樣品溶液，空白組用緩沖液代替酶液，使用奧利司他（8 μg/mL）作為陽性對照，每組實驗重復3 次，并根據(jù)式（1）進行計算：

式中：A1為對照實驗組吸光度；A2為樣品實驗組吸光度；A3為對照空白組吸光度；A4為樣品空白組吸光度。

1.3.6 胰脂肪酶抑制動力學分析

參照黃琳翔[29]和廖家樂[28]等的方法，稍作改動。4-硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）標準曲線的繪制：利用二硝基亞砜配制5 mmol/L母液，用Tris緩沖液稀釋，配制不同濃度的pNP溶液（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mmol/L），測定其在405 nm波長處的吸光度。以pNP濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得到pNP標準曲線（y＝9.352 4x＋0.053，R2＝0.999 8）。

固定pNPP濃度為0.8 mmol/L，分別測定不添加和添加1 mg/mL酶抑制劑時，胰脂肪酶不同質量濃度（0、5、10、15、20 mg/mL）的酶促反應初速率，反應體系同1.3.5 節(jié)。根據(jù)pNP標準曲線得到相應的反應產(chǎn)物（pNP）的濃度（C/（mmol/L）），進而求出各反應速率。以酶促反應初速率對酶質量濃度作圖，由圖判斷抑制類型（可逆或不可逆），添加抑制劑會得到一條通過原點且斜率降低的直線，可確定為可逆抑制作用類型[28]。

固定胰脂肪酶質量濃度為10 mg/mL，酶抑制劑配制成0、1、2 mg/mL的溶液，分別測定pNPP濃度為1、2、4、8 mmol/L時的酶促反應初速率，反應體系同1.3.5節(jié)。以反應速率倒數(shù)（1/V）對底物濃度倒數(shù)（1/[S]）作圖，得到Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線。曲線與X軸的截距＝-1/Km，與Y軸截距＝1/Vmax，根據(jù)Vmax和Km的變化可判斷抑制類型，非競爭性抑制為Km不變，Vmax變??；競爭性抑制為Km增大，Vmax不變[30]。以雙倒數(shù)曲線的斜率（k）為縱坐標，抑制劑質量濃度為橫坐標，進行二次作圖繪制可得抑制常數(shù)Ki[30]。

競爭性抑制劑的抑制常數(shù)可按式（2）進行計算：

式中：1/V為反應速率的倒數(shù)/（（L·min）/μmol）；1/[S]為pNPP底物濃度的倒數(shù)/（L/mmol）；Km為米氏常數(shù)/（mmol/L）；Vmax為酶促反應的最大反應速率/（μmol/（L·min））；[I]為抑制劑質量濃度/（mg/mL）；Ki為抑制常數(shù)/（mg/mL）。

非競爭性抑制劑的抑制常數(shù)按式（3）進行計算：

Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線的斜率k計算見式（4）：

1.3.7 秀麗隱桿線蟲實驗評價降脂活性

1.3.7.1 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)與同步化

線蟲的培養(yǎng)使用線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM），在表面涂布有OP50菌液作為線蟲的食物，在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照王力等[31]采用次氯酸鈉裂解法對線蟲進行同步化處理，本實驗所用線蟲均為經(jīng)過同步化處理生長至L4期的線蟲。正式實驗時，NGM中添加12.5 μg/mL 5-氟脲嘧啶[32]。

1.3.7.2 秀麗隱桿線蟲的給藥途徑與分組

將同步化L4期線蟲分成6 組，每組設置3 個平行，每板1 000 只，如表1所示。通過使用含10 mmol/L葡萄糖的NGM培養(yǎng)C.elegans進行高糖飲食誘導，構建C.elegans高脂模型。將PES溶解在OP50菌液中，吸取500 μL含PES的OP50菌液涂布于NGM平板上（90 mm），20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h待用。在此條件下，藥物通過線蟲攝食而進入到線蟲體內(nèi)[33]。每日更換NGM，72 h后收集蟲體，用于后續(xù)實驗。

表1 實驗分組和給藥劑量Table 1 Experimental grouping and doses of drugs

1.3.7.3 油紅O染色

參照Wilber等[34]的方法，稍作改動。挑取同步化、給藥結束的6 組線蟲（n＝100），加入適量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），離心棄上清液，加入體積分數(shù)60%異丙醇溶液，脫水3 min。去除異丙醇，加入油紅O染色液，室溫避光靜置2 h，離心棄上清液。用PBS去多余染液，置于顯微鏡下觀察拍照。將線蟲轉移至新的離心管，加入200 μL無水乙醇，混合搖晃5 min，離心取上清液測510 nm波長處的吸光度。

1.3.7.4 甘油三酯和總膽固醇含量的測定

挑取同步化、給藥結束的6 組線蟲（n＝900），并配制M 9 緩沖液（稱取3 g KH2PO4，15.14 g Na2HPO4·12H2O，5g NaCl，加水定容至1 L，高壓滅菌，冷卻后在超凈工作臺中加入1 mL 1 mol/L無菌MgSO4溶液，混合均勻）。用M9緩沖液洗線蟲3 遍，離心，棄上清液。加入1 mL M9緩沖液重懸，將離心管放入液氮速凍10 min后置于室溫解凍，反復3 次后研磨破碎蟲體，制成線蟲勻漿。按照試劑盒方法測定甘油三酯和總膽固醇含量，結果通過蛋白質濃度標準化。

1.3.8 基于LC-MS/MS鑒定純化肽PES

委托深圳市微納菲生物技術有限公司完成純化肽PES的結構鑒定。采用EASY-nLC 1200液相系統(tǒng)，質譜采用Q Exactive系統(tǒng)結合納升噴霧Nano Flex離子源，噴霧電壓為1.9 kV，離子傳輸管加熱溫度為275 ℃，掃描范圍為m/z100～1 500。質譜采集的原始圖譜文件，采用PEAKS Studio 8.5軟件進行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析，從UniProt數(shù)據(jù)庫下載Chlorella pyrenoidosa物種蛋白數(shù)據(jù)庫。

1.3.9 分子對接技術

參照歐海亞等[35]方法，通過檢索PDB蛋白數(shù)據(jù)庫（www.rcsb.org/）獲取人胰脂肪酶（human pancreatic triacylglycerol lipase，PTL）的3D晶體結構（PDB代碼：1LPB）并將其作為受體，將晶體結構中的原始配體（甲氧基十一烷基磷酸）所在的位置定義為結合口袋。應用Molecular Operating Environment（MOE）軟件中的對接模塊進行基于結構的虛擬篩選，對接流程采用柔性的induced fit模式。配體的結合模式首先通過London dG打分函數(shù)進行排序，最優(yōu)構象通過進一步優(yōu)化和GBVI/WSA dG方法對結合自由能再次評價。結合自由能最低的構象被選為最佳的結合模式，采用PyMOL將對接結果可視化。

1.3.10 合成肽與活性驗證

將確定的氨基酸序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司采用Fmoc固相合成法制備，所得肽段經(jīng)過液質聯(lián)用儀鑒定純度＞95%。合成肽的胰脂肪酶抑制活性測定參照1.3.5節(jié)進行，胰脂肪酶抑制動力學分析參照1.3.6節(jié)進行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 PE相對分子質量分布

如表2所示，將PE按分子質量大小可分為6 個部分，小于5 000 Da的肽段含量總和達到98.16%，其中180～1 000 Da的肽段比較集中，含量約為51.97%，還有31.86%的組分為游離氨基酸和氨基酸殘基。由于組成多肽的氨基酸殘基平均相對分子質量約為110 Da[36]，因此預測組成PE的多肽大多是由少于10 個氨基酸組成的肽段。2～6 個氨基酸組成的小肽將有助于提升肽類藥物在靶組織中的穩(wěn)定性、轉運效率和生物利用度。Zhang Ruilin等[13]研究獲得的小球藻蛋白酶解物中小于1 000 Da的肽段僅占13.81%。

表2 PE相對分子質量分布Table 2 Relative molecular mass distribution of PE

2.2 超濾膜分離各組分對胰脂肪酶活性的抑制作用

由圖1可知，在8 mg/mL質量濃度下觀察PE及各個組分對胰脂肪酶活性的抑制作用，＜5 kDa組分對胰脂肪酶活性抑制率最高（（45.44±3.52）%），顯著（P＜0.05）高于PE和其他2 個組分，與奧利司他（8 μg/mL）沒有顯著差異（P＞0.05）。因此，選擇＜5 kDa組分進一步分離純化。

圖1 超濾各組分的胰脂肪酶抑制活性Fig.1 Pancreatic lipase inhibitory activity of fractions obtained by ultrafiltration

2.3 Sephadex G-25分離純化

如圖2所示，＜5 kDa組分經(jīng)Sephadex G-25分離后得到2 個主峰（F1、F2）。根據(jù)凝膠柱分離原理可知F1分子質量大于F2，且F2的相對含量更高，這與前面PE分子質量分布測定結果一致。由圖3可知，F(xiàn)1和F2均表現(xiàn)出一定的胰脂肪酶抑制活性，在8 mg/mL質量濃度下F2對胰脂肪酶活性抑制率顯著（P＜0.05）高于F1，達到（42.33±0.61）%。分子質量是影響蛋白質水解物或肽生物利用度的重要因素，因此確定分子質量較小且抑制率較高的主峰F2為蛋白核小球藻胰脂肪酶抑制肽（PES），作為進一步研究對象。

圖2 ＜5 kDa組分的Sephadex G-25分離譜圖Fig.2 Chromatogram of fraction with molecular mass less than 5 kDa separated on Sephadex G-25 column

圖3 Sephadex G-25分離各主峰的胰脂肪酶抑制活性Fig.3 Pancreatic lipase inhibitory activity of fractions from Sephadex G-25 chromatography

2.4 純化肽PES的降脂活性評價結果

2.4.1 油紅O染色

油紅O為脂溶性染料，能夠進入線蟲透明體著色，使組織內(nèi)的脂滴呈現(xiàn)紅色，從而量化蟲體內(nèi)的脂肪[37]。如圖4所示，高脂模型組線蟲蟲體顏色整體較深，純化肽PES各劑量組蟲體顏色隨質量濃度增大而逐漸變淺，在高劑量組中表現(xiàn)比較明顯，高劑量組蟲體顏色介于正常對照組與陽性對照組之間。

圖4 油紅O染色圖Fig.4 Photographs of oil red O staining

通過對各組蟲體染料的定量分析，可以反映油紅O染色處理的吸光度與脂肪含量的關系，吸光度越大說明體內(nèi)脂肪沉積越多[38]。由圖5可知，高脂模型組線蟲體內(nèi)脂肪沉積量顯著（P＜0.05）高于正常對照組，說明使用含10 mmol/L葡萄糖NGM培養(yǎng)的C.elegans能夠誘導脂肪過度生成。在高劑量1 mg/mL時，純化肽PES對線蟲體內(nèi)的降脂效果最佳，其脂肪沉積量比高脂模型組低22.5%，與陽性對照組無顯著差異（P＞0.05）。

2.4.2 線蟲體內(nèi)甘油三酯和總膽固醇的含量

由圖6可見，高脂模型組線蟲體內(nèi)甘油三酯、總膽固醇含量均顯著高于正常對照組（P＜0.05），說明使用含10 mmol/L葡萄糖的NGM培養(yǎng)C.elegans成功構建C.elegans高脂模型。純化肽PES各劑量組線蟲的甘油三酯含量均顯著低于高脂模型組（P＜0.05），與陽性對照組差異不顯著（P＞0.05），各劑量組之間差異不顯著（P＞0.05）。純化肽PES各劑量組線蟲的總膽固醇含量均顯著低于高脂模型組（P＜0.05），與陽性對照組差異不顯著（P＞0.05），中劑量組、高劑量組與正常對照組之間差異不顯著（P＞0.05）。整體來看，純化肽PES具有較好的降脂能力，質量濃度為1 mg/mL時能夠降低高脂模型組線蟲體內(nèi)27.4%甘油三酯和29.4%總膽固醇水平，改善高糖飲食線蟲的脂代謝紊亂。

圖6 純化肽PES對線蟲體內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量的影響Fig.6 Effect of PES on triglyceride and total cholesterol contents in C.elegans

2.5 基于LC-MS/MS鑒定純化肽PES

總離子流色譜圖見圖7，鑒定得到999 條肽段，來源于64 種小球藻蛋白。結果顯示，999 條肽段中五肽的相對含量總和達到72%，六肽的相對含量總和達到23%，七肽及7 個氨基酸以上組成的肽段僅占5%，且相對分子質量在400～700 Da之間的肽段相對含量總和占比89.7%，其中肽段FLGPF的相對含量最高（圖8），單個肽占比高達7.9%。有關研究表明當多肽藥物分子質量超過700 Da時，其生物利用度將隨分子質量增加而顯著下降，而分子質量小于500 Da的小肽（2～6 個氨基酸）具有最高的生物利用度[26]。因此，以5～6 個氨基酸組成的肽段為主要研究對象，選取相對含量及圖譜鑒定可信度較高的10 條肽段，按相對含量從高到低排序（表3），進入下一步分析。

圖7 純化肽PES的總離子流色譜圖Fig.7 Total ion current chromatogram of PES

圖8 LC-MS/MS鑒定FLGPF的一級質譜圖（A）和二級質譜圖（B）Fig.8 Primary (A) and secondary (B) mass spectra of FLGPF by LC-MS/MS

表3 LC-MS/MS多肽測序結果Table 3 Results of polypeptide sequence identified by LC-MS/MS

2.6 分子對接虛擬篩選

分子對接技術實質是大分子蛋白受體與小分子配體之間通過能量匹配和幾何匹配從而相互識別，用來模擬蛋白和小分子之間的相互作用[39]。采用MOE軟件進行對接，將10 條肽段與PTL蛋白受體對接能絕對值由大到小排列，如表4所示。對接能絕對值越高，說明該分子與受體的結合親和力越強。因此，可以認為HMPALV（-10.32 kcal/mol）、VPIIMH（-10.01 kcal/mol）、FLSQPF（-9.94 kcal/mol）、LLAPY（-9.60 kcal/mol）和FLGPF（-9.39 kcal/mol）肽段可能具有較強的抑制胰脂肪酶活性能力，用于下一步合成和活性驗證。

表4 肽與PTL蛋白分子對接能Table 4 Molecular docking energy between peptides and PTL

2.7 合成肽的活性驗證

采用Fmoc固相合成法制備HMPALV、VPIIMH、FLSQPF、LLAPY和FLGPF五條肽段，如圖9所示，在1 mg/mL質量濃度時HMPALV對胰脂肪酶活性抑制率最低，F(xiàn)LGPF的抑制率最高。通過查看5 個肽段與酶蛋白的結合模式，發(fā)現(xiàn)雖然HMPALV對接能絕對值較高，但并不是在胰脂肪酶靶點上結合，所以沒有起到良好的抑制作用。將VPIIMH、FLSQPF、LLAPY和FLGPF這4 條肽段序列與活性肽數(shù)據(jù)庫（BioPepDB、DFBP和EROP-Moscow）中現(xiàn)存數(shù)據(jù)進行比較，沒有發(fā)現(xiàn)相同的降脂肽序列，表明發(fā)現(xiàn)新的胰脂肪酶抑制肽，這為蛋白核小球藻在降脂方面的應用提供新的參考依據(jù)。

圖9 合成肽的胰脂肪酶抑制活性Fig.9 Pancreatic lipase inhibitory activity of synthetic peptides

2.8 合成肽FLGPF與胰脂肪酶分子作用特征

如圖10所示，測定了不同質量濃度下FLGPF的胰脂肪酶活性抑制率，使用奧利司他（8 μg/mL）作為陽性對照?？梢钥闯鯢LGPF的胰脂肪酶活性抑制率呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性增加，在質量濃度為4 mg/mL和8 mg/mL時，對胰脂肪酶活性抑制率分別達到（38.39±3.47）%和（50.12±0.84）%，與從紅小豆中篩選得到的一種抗肥胖十三肽FDTGSSFYNKPAG在4 mg/mL時的胰脂肪酶抑制率（36.28%）[40]接近。

圖10 不同質量濃度下FLGPF的胰脂肪酶抑制活性Fig.10 Pancreatic lipase inhibitory activity of FLGPF at different concentrations

由圖11可知，抑制劑組和無抑制劑組擬合得到的曲線都通過原點，且添加1 mg/mL的FLGPF后，曲線斜率降低，說明FLGPF對胰脂肪酶的抑制作用類型為可逆抑制。FLGPF通過非共價鍵與酶和（或）酶-底物復合物進行可逆性地結合使酶活性降低或失活，影響酶催化效率。

圖11 FLGPF對胰脂肪酶的抑制作用類型Fig.11 Inhibition types of FLGPF on pancreatic lipase

由圖12可知，在底物濃度1～8 mmol/L范圍內(nèi)，通過繪制添加1、2 mg/mL抑制劑組和無抑制劑組的Lineweaver-Burk曲線發(fā)現(xiàn)，3 條曲線相交于橫軸，此時Km不變，Vmax變小，且Vmax隨抑制劑質量濃度的增加而減小，表明FLGPF對胰脂肪酶的抑制作用類型為非競爭性抑制，其抑制作用不會隨底物濃度增加而減弱，該特性比競爭性抑制劑更有利于控制餐后血脂的增高[30]。

圖12 FLGPF對胰脂肪酶的Lineweaver-Burk曲線圖Fig.12 Lineweaver-Burk curve of the effect of FLGPF on pancreatic lipase

抑制常數(shù)Ki是反映酶和抑制劑復合物解離難易程度的重要指標，其數(shù)值越小，說明抑制劑與酶結合越緊密，酶與抑制劑越難分離，抑制作用越強[30]。以雙倒數(shù)曲線的斜率（k）為縱坐標，抑制劑質量濃度為橫坐標，進行二次作圖繪制（圖13）可計算得到FLGPF對胰脂肪酶的抑制常數(shù)Ki為5.23 mg/mL，小于廖家樂等[28]測定的枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的Ki值（6.04 mg/mL）。

圖13 FLGPF對胰脂肪酶的Lineweaver-Burk曲線斜率圖Fig.13 Slope plot of the Lineweaver-Burk curve

為進一步明確FLGPF與胰脂肪酶的作用模式，進行分子對接（圖14），F(xiàn)LGPF與PTL蛋白的結合位點形成了合適的空間互補。FLGPF的Phe1主鏈上—NH3＋基團上的氫作為氫鍵供體，與PTL蛋白的Arg79側鏈的氧原子形成氫鍵作用。FLGPF的Phe1主鏈上的—NH3＋基團與PTL蛋白Trp252的苯環(huán)形成π-陽離子作用。FLGPF的Phe5主鏈上—NH3＋基團上的氫與PTL蛋白Tyr114的苯環(huán)形成π-氫鍵作用。FLGPF與PTL蛋白也存在范德華力。相關研究發(fā)現(xiàn)底物（脂類）與胰脂肪酶活性中心催化位點Ser152、His263、Asp176相結合[30]，而分子對接結果顯示FLGPF與酶催化活性中心之外的位點Arg79、Trp252、Tyr114相結合，符合非競爭性抑制作用特征，此結果與圖12所示的抑制動力學結果一致。

圖14 FLGPF與PTL的二維（A）、表面（B）及三維（C）結合模式圖Fig.14 2D (A),surface (B) and 3D (C) binding models of FLGPF and PTL

3 結論

本研究以蛋白核小球藻為原料，深入分析分離得到純化肽（PES）的降脂效果，篩選出FLGPF、VPIIMH、LLAPY和FLSQPF 4 條新的胰脂肪酶抑制肽。結果表明，PES具有較好的降脂活性，能夠有效抑制高糖飲食線蟲體內(nèi)的脂肪沉積，顯著降低甘油三酯和總膽固醇水平。鑒定得到的短肽FLGPF為一種可逆非競爭性抑制的胰脂肪酶抑制肽，但其相關作用機制尚未明確，后期將從秀麗線蟲脂代謝通路出發(fā)（如TGF-β和胰島素代謝通路、sbp-1/mdt-15介導的固醇反應元件結合蛋白代謝通路、nhr-49介導的核激素信號通路、5-羥色胺（tph-1）介導的信號通路等），明確關鍵作用靶點，進一步探明其降脂作用機理。本研究可為小球藻降脂活性肽的開發(fā)提供理論參考。