李清春　孫曉梅　孫敬禮　黃濤

摘要：目的 本研究旨在對豬miR-23a-27a-24簇（miR-23a-27a-24 cluster）的潛在啟動子區(qū)域進(jìn)行預(yù)測和分析，為進(jìn)一步探索miR-23a-27a-24基因?qū)ωi轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。方法 利于生物信息學(xué)分析豬miR-23a-27a-24簇的啟動子區(qū)域、CpG島及其潛在的轉(zhuǎn)錄因子；利用截短突變和PCR技術(shù)克隆得到5個逐級缺失的miR-23a-27a-24基因啟動子片段，構(gòu)建雙熒光素酶報告載體， 通過檢測各載體的雙熒光素酶活性獲得miR-23a-27a-24基因的核心啟動子區(qū)域。結(jié)果 ?pGL3-cMiR啟動子在豬miR-23a-27a-24簇上游341bp至994bp區(qū)熒光素酶活性最強(qiáng)，為pGL3-basic空載體活性的5.02倍（P<0.05），視為miR-23a-27a-24簇核心啟動區(qū)。生物信息學(xué)分析表明：豬miR-23a-27a-24簇啟動子區(qū)不含CpG島，其核心啟動子區(qū)可能存在SP1、VDR、MAZ、YY1、E2F1和ELF1六種潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

結(jié)論 本研究構(gòu)建并確定了豬miR-23a-27a-24簇核心啟動子區(qū)域，可為今后開展豬miR-23a-27a-24簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬；miR-23a-27a-24簇；啟動子；轉(zhuǎn)錄調(diào)控

中圖分類號：中圖分類號S828文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

Prediction and activity analysis of the promoter of the porcine miR-23a-27a-24 cluster

LI? Qingchun，SUN? Xiaomei，SUN Jingli，HUANG? Tao*

（School of Animal Science and Technology， Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： Objective The aim of this study was to predict and analyse the potential promoter regions of the porcine miR-23a-27a-24 cluster and to lay the foundation for further exploration of the function of the miR-23a-27a-24 gene on the transcriptional regulatery mechanism in pigs. Methods The promoter region of the porcine miR-23a-27a-24 cluster， the CpG island and its potential transcription factors were analyzed by bioinformatics; five promoter fragments of the miR-23a-27a-24 gene with stepwise deletion were cloned by using truncated mutation and PCR techniques， and a dual luciferase reporter vector was constructed， and the dual luciferase activity of each vector was assayed to obtain the miR-23a- The core promoter region of the miR-23a-27a-24 gene was obtained by assaying the dual luciferase activity of each vector. Results showed that the pGL3-cMiR promoter had the strongest luciferase activity in the 341bp to 994bp region upstream of the porcine miR-23a-27a-24 cluster， which was 5.02 times higher than that of the pGL3-basic empty vector （P<0.05）， and was regarded as the core promoter region of the miR-23a-27a-24 cluster. Bioinformatics analysis showed that the promoter region of porcine miR-23a-27a-24 cluster did not contain CpG islands， and six potential transcription factor binding sites， SP1， VDR， MAZ， YY1， E2F1 and ELF1， might exist in its core promoter region. Conclusions This study constructed and identified the core promoter region of the porcine miR-23a-27a-24 cluster， which can lay the foundation for future work on the transcriptional regulatory mechanism of the porcine miR-23a-27a-24 cluster.

Key words： pig;miR-23a-27a-24 cluster;promoter;transcriptional regulation

MicroRNAs（miRNA）是一種內(nèi)源性保守的長度為19-22個核苷酸的非編碼RNA，通過翻譯抑制和/或促進(jìn)mRNA降解參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控進(jìn)而參與一系列重要的生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞癌變等［1］。目前對于miRNAs的研究多集中在單一的miRNA上，而miRNA中的一部分是以miRNA基因簇的形式存在，與非成簇miRNA不同的是，這些miRNA簇往往由一個共同的啟動子調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后形成多個成熟的miRNAs［2］，這些miRNA往往在功能上相同，它們或具有相同的靶基因或作用相同的信號通路［3］。因此，研究miRNA簇對調(diào)控細(xì)胞通路或決定細(xì)胞命運(yùn)的協(xié)同作用是十分必要的，這將給我們一個細(xì)胞內(nèi)miRNA調(diào)控的整體圖景。

隨著miRNA研究熱度的不斷攀升以及研究的深入，miRNA簇的作用開始逐漸被熟知。miR-23a-27a-24簇位于人19號染色體19p13.12，是由同一啟動子轉(zhuǎn)錄后形成的3個成熟的miRNAs： miR-23a， miR-27a和miR-24［4］。miR-23a-27a-24簇被證明在多種癌癥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，包括肝細(xì)胞癌、乳腺癌、胃癌、膽管癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［1］。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)miR-23a-27a-24簇中的的成員miR-23a和miR-27a涉及卵巢卵泡發(fā)育，激素合成與分泌以及卵巢衰等生理過程［5］。例如，在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)， MⅡ期卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞中miR-27a表達(dá)水平較MⅠ期卵母細(xì)胞明顯降低， 上調(diào)mi R-27a可以提高卵母細(xì)胞的成熟率［6］。在人卵巢中，miR23a和miR27a可通過FasL-Fas凋亡途徑調(diào)控顆粒細(xì)胞的凋亡過程，miR-24能夠抑制雌激素的分泌參與調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的凋亡［7］。而在家畜上，王思琪等［8］發(fā)現(xiàn)miR-23a-27a -24簇可以調(diào)控豬顆粒細(xì)胞的凋亡過程。提示miR-23a-27a-24可能作為豬繁殖育種的分子標(biāo)記。但目前尚未見豬miR-23a-27a-24簇轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的報道。為此，本研究開展豬miR-23a-27a -24簇基因簇啟動子位置的預(yù)測和活性分析等研究，旨在為分析豬miR-23a-27a-24簇的作用機(jī)制及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物有限公司），PK-15細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存），螢光素酶報告基因載體（pGL3-basic）、海腎熒光素酶報告基因載體（pRL-TK）（美國Promega公司），Dual-Luciferase Reporter Assay System（美國Promega公司）。

1.2 試驗(yàn)試劑和儀器

無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（北京全式金生物有限公司），限制性內(nèi)切酶（Xho Ⅰ、Hind Ⅲ）、T4-DNA連接酶（TaKaRa大連寶生物有限公司），瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京天根生化有限公司），LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司），DMEM/Opti-MEN培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），CyclerTM Thermal Cycler PCR儀（美國Bio-Rad公司），DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠，中國），微生物培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國）。

1.3 方法

1.3.1 豬miR-23a-27a-24簇核心啟動區(qū)域預(yù)測

利用UCSC（http：//genome.ucsc.edu/）、RNAcentral（http：//rnacentral.org/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）分析豬miR-23a-27a-24簇前體序列；獲取miR-23a-27a-24簇前體序列上游3500bp并利用Promoter 2.0 Prediction（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）、phiSITE（http：//www.phisite.org/）和softberry（http：//www.softberry.com/）預(yù)測其核心啟動子區(qū)域。

1.3.2 豬miR-23a-27a-24簇啟動區(qū)域CpG島預(yù)測

利用在線軟件Methprimer（http：//www.urogene.org/methprimer2/）和EMBOSS（http：//emboss.bioinformatics.nl）對豬miR-23a-27a-24簇啟動區(qū)CpG島進(jìn)行預(yù)測。

1.3.3 豬miR-23a-27a-24簇核心啟動區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

利用AnimalTFDB 3.0 （http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#！/）、PROPO （http：//alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？dirDB=TF_8.3）和JASPAR （https：//jaspar.genereg.net/）對豬miR-23a-27a-24簇核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，參數(shù)設(shè)定為Relative profile score threshold >90%。

1.3.4 引物設(shè)計(jì)

從NCBI和RNAcentral數(shù)據(jù)庫上獲取豬miR-23a-27a-24基因序列并利用Primer 5.0軟件對miR-23a-27a-24基因序列上游5′端分別設(shè)計(jì)6條同向續(xù)減片段引物，即miR-23a-27a-24 基因簇前體序列上游-341bp/-110bp、-667bp/-110bp、-994bp/-110bp、-1658bp/-110bp、-1876bp/-110bp和-2247bp/-110bp，做為miR-23a-27a-24基因啟動子區(qū)特異性引物，并在上下游引物序列5′端分別加入Xho Ⅰ、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（表1）。

1.3.5 豬miR-23a-27a-24簇啟動子報告載體的構(gòu)建

以豬基因組DNA為摸板擴(kuò)增miR-23a-27a-24基因上游6條續(xù)減片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定和測序無誤后，分別使用Xho Ⅰ和Hind Ⅲ對回

收的miR-23a-27a-24基因上游各續(xù)減片段及pGL3-Basic載體進(jìn)行雙酶切，膠回收miR-23a-27a-24基因上游各續(xù)減片段及pGL3-Basic線性載體并依次進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，PCR篩選陽性克隆菌株送測序。測序結(jié)果比對無誤后，根據(jù)北京天根生化有限公司無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒提取報告基因載體質(zhì)粒，用于后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3.6 PK15細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

PK15細(xì)胞培養(yǎng)使用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。待PK15細(xì)胞匯合度達(dá)95%時，利用0.25%胰酶消化細(xì)胞，接種至12孔板（2.5×105個/孔）中，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%時，分別將報告基因載體質(zhì)粒pGL3-cMiR-0.2K、pGL3-cMiR-0.5K、pGL3-cMiR-0.8K、pGL3-cMiR-1.5K、pGL3-cMiR-1.7K及pGL3-Basic空報告基因載體各1000ng與50 ng的pRL-TK質(zhì)粒混合，按Lipofec-tamineTM2000說明書共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.7 報告基因雙熒光素酶活性檢測

待PK15細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，吸棄培養(yǎng)液并用1×PBS潤洗3次，在分別向每孔中加入200 μL 1× PLB細(xì)胞裂解液，充分裂解15 min后，轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，12 000g離心5min，取上清備用。分別向96孔檢測板中加入20 μL上清液，隨后立即加入100 μL LARII，檢測螢火蟲螢光素酶活性值，然后再加入100 μL Stop & Glo Substrate，檢測海腎熒光素酶活性值。相對熒光素酶表達(dá)量為螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性的比值。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17. 0軟件的單因素方差分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，結(jié)果表示為±SD，當(dāng)P＜0.05表示為為差異顯著，用*表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬miR-23a-27a-24簇分析

利用UCSC、RNAcentral和NCBI查詢豬miR-23a-27a-24簇前體序列，miR-23a-27a-24簇定位于豬2號染色體上（chr2：65，308，116-65，308，525），DNA序列全長408 bp；該基因簇具有3個串聯(lián)排列的miRNA 前體，可編碼3個成熟的miRNA，分別為ssc-miR-23a、ssc-miR-27a、ssc-miR-24-1-5p。

2.2 豬miR-23a-27a-24簇啟動子核心區(qū)域預(yù)測

對豬miR-23a-27a-24簇前體序列上游3 500 bp進(jìn)行啟動子預(yù)測。結(jié)果顯示，Promoter 2.0預(yù)測到4處啟動子結(jié)合位點(diǎn)，分別位于miR-23a-27a-24簇上游700 bp、1 200 bp、2 200 bp和3 200 bp處，其Score分別為0.583、0.518、0.665和0.509（表2）；softberry預(yù)測到4處啟動子結(jié)合位點(diǎn)，即miR-23a-27a-24簇上游401 bp、1 335 bp、1 870 bp和2 204 bp，LDF分別為7.89、4.47、4.15和3.92（表2）。

phiSITE預(yù)測結(jié)果如圖1所示：在miR-23a-27a-24簇啟動子集中分布在上游500～900 bp，其中700 bp附近啟動子預(yù)測得分最高，為2.72；盡管3個軟件對miR-23a-27a-24簇的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果不盡相同，但是3個軟件的預(yù)測結(jié)果均集中在豬miR-23a-27a-24簇上游400 bp～900 bp、1 200 bp～1 400 bp和2 100 bp～2 300 bp區(qū)域內(nèi)，并且在400 bp～900 bp區(qū)域的綜合得分最高。因此，本研究推測miR-23a-27a-24簇前體序列上游400～900 bp區(qū)域可能是其潛在的核心啟動子區(qū)域。

2.3 豬miR-23a-27a-24簇啟動子區(qū)CpG島預(yù)測

除順式作用元件外，CpG島也是真核生物pol Ⅱ型啟動子的重要特征之一。本研究利用Methprimer和EMBOSSS在線軟件對豬miR-23a-27a-24簇啟動子區(qū)CpG島進(jìn)行預(yù)測，在豬miR-23a-27a-24簇前體序列上游3 500 bp序列中均沒有發(fā)現(xiàn)CpG島的存在，僅在2 800～2 900 bp區(qū)域（即豬miR-23a-27a-24簇上游600～700 bp區(qū)域）有一個CpG集中分布區(qū)域（圖2，圖3）。

2.4 豬miR-23a-27a-24簇啟動子區(qū)克隆及熒光素酶報告載體構(gòu)建

以豬基因組DNA為模板，成功擴(kuò)增出miR-23a-27a-24簇5′上游6條續(xù)減片中前5條，大小分別為 231 bp、557 bp、884 bp、1 548 bp和1 776 bp，其中最長片段2 137 bp擴(kuò)增失敗。將克隆的miR-23a-27a-24基因上游5條續(xù)減片段和pGL3-Basic質(zhì)粒同時用Xho Ⅰ、Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組熒光素酶報告基因質(zhì)粒。

經(jīng)過測序結(jié)果驗(yàn)證，所有克隆的片段序列與目的序列完全一致。同時將構(gòu)建好的重組熒光素酶報告基因質(zhì)粒采用Xho Ⅰ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，miR-23a-27a-24簇5′上游5條續(xù)減片段和pGL3-Basic質(zhì)粒片斷與原始序列位置相吻合，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖4）。

2.5 豬miR-23a-27a-24簇核心啟動區(qū)域確定

雙熒光素酶報告結(jié)果顯示：pGL3-cMiR啟動子在PK-15細(xì)胞中均表現(xiàn)出熒光素酶活性，表明構(gòu)建的miR-23a-27a-24啟動子具有明顯的轉(zhuǎn)錄活性， 且各段續(xù)減片段的熒光素酶活性并不相同（圖5）。

其中最長片段pGL3-cMiR-1.7K（-1 886 bp/-110 bp）及稍短片段pGL3-cMiR-1.5K（-1 658 bp/-110 bp）沒有表現(xiàn)出最高的活性，其報告基因的活性分別為空載體（pGL3-basic）活性的3.91和3.56倍，相對于報告基因活性最高的片段pGL3-cMiR-0.8K（-994 bp/-110 bp）的活性逐漸減弱，表明豬miR-23a-27a-24簇上游（-997/-1 876 bp）可能存在負(fù)向調(diào)控因子。pGL3-cMiR-0.8K（-994 bp/ -110 bp）的活性最高，為空載體（pGL3-basic）活性的5.02倍（P<0.05）；而pGL3-cMiR-0.2K（-341 bp/-110 bp）的活性只有pGL3-cMiR-0.8K（-994 bp/-110 bp）的45%（P>0.05）。說明miR-23a-27a-24簇上游（-341 bp-994 bp）區(qū)域存在強(qiáng)啟動子活性，這與生物信息學(xué)預(yù)測的位置相一致。

2.6 豬miR-23a-27a-24簇核心啟動區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測

利用在線軟件對豬miR-23a-27a-24簇核心啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示：AnimalDB 3.0軟件在目標(biāo)序列中共預(yù)測到404個潛在的轉(zhuǎn)錄因子，JASPAR軟件共預(yù)測到139個潛在的轉(zhuǎn)錄因子，PROPO軟件共預(yù)測到59個潛在的轉(zhuǎn)錄因子（圖6A）。3個軟件共同預(yù)測到6個相同的轉(zhuǎn)錄因子，分別為SP1、VDR、MAZ、YY1、E2F1和ELF1。其中，SP1在目標(biāo)序列中發(fā)現(xiàn)有6處潛在的結(jié)合位點(diǎn)、YY1發(fā)現(xiàn)3處潛在的結(jié)合位點(diǎn)、ELF1發(fā)現(xiàn)有2處潛在結(jié)合位點(diǎn)，SP1和MAZ的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生部分重疊（圖6A，圖6B）。

3 討論

MiR-23a-27a-24簇是由同一啟動子轉(zhuǎn)錄生成的3個相互鄰近的一簇小分子miRNA［9］。該miRNA簇在脊椎動物中高度保守［4］，常被報道與人類疾病相關(guān)［10］。但該基因簇在豬中的研究相對匱乏，本研究通過生物信息學(xué)和雙熒光素酶試驗(yàn)預(yù)測并驗(yàn)證豬miR-23a-27a-24簇的核心啟動子位置，為豬miR-23a-27a-24簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

熒光素酶報告基因系統(tǒng)因其敏感性高、操作簡單等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于監(jiān)測細(xì)胞基因表達(dá)和調(diào)控的研究，核心啟動子是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵和核心要素，通過熒光素酶檢測報告基因的表達(dá)量可直接反映所克隆片段的啟動子活性［11］。本研究成功構(gòu)建了豬miR-23a-27a-24簇上游的報告基因載體，雙熒光報告基因系統(tǒng)顯示豬miR-23a-27a-24簇上游341 bp至994 bp區(qū)域的熒光素酶活性最強(qiáng)。表明豬miR-23a-27a-24簇上游341 bp至994 bp可能是其核心啟動子區(qū)域，這與生物信息學(xué)預(yù)測的位置相一致。然而，我們并不排除在該啟動子上游含有另外的啟動子的可能性。在相似研究中，Lee等［9］發(fā)現(xiàn)在人miR-23a-27a-24簇上游403～603 bp區(qū)域的熒光素酶活性最高，比本研究在豬miR-23a-27a-24簇上發(fā)現(xiàn)的啟動子范圍要小。這可能是由于物種間堿基序列之間差異造成的。

除了順式作用元件外，CpG島也是啟動子序列的重要特征［12］。CpG島作為表觀調(diào)控的重要組成部分，在基因調(diào)控方面起著重要作用［13］。研究表明，CpG島主要位于基因的啟動子區(qū)和第1外顯子區(qū)，CpG島的GC含量>50%，長度>200 bp［13］。對真核生物而言，CpG島主要位于管家基因的啟動子調(diào)控區(qū)［14］。本研究在miR-23a-27a-24簇啟動子區(qū)未檢測到CpG島，表明miR-23a-27a-24簇可能屬于組織特異性基因。

基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是一種協(xié)調(diào)有序的過程，基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控［15］。據(jù)報道，基因上游的啟動子調(diào)控元件表達(dá)水平及結(jié)合區(qū)域可影響重組載體的轉(zhuǎn)錄活性［16］，轉(zhuǎn)錄因子作為一種協(xié)助真核生物基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件，通過與目的基因啟動子直接結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)［17］。本研究中對miR-23a-27a-24簇的核心啟動子區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，發(fā)現(xiàn)6個潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（SP1、VDR、MAZ、YY1、E2F1和ELF1）。但值得關(guān)注的是，轉(zhuǎn)錄因子SP1和YY1在豬miR-23a-27a-24簇核心啟動子區(qū)域上存在多處結(jié)合位點(diǎn)。推測SP1和YY1可能是豬miR-23a-27a-24簇核心啟動區(qū)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，但是本研究所發(fā)現(xiàn)的其他轉(zhuǎn)錄因子，如：VDR、MAZ、E2F1和ELF1對豬miR-23a-27a-24簇的調(diào)控作用也是不容忽視的。

陰陽因子1（Yin-Yang-1，YY1）是一種普遍表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，通過占據(jù)靶基因活性增強(qiáng)子或啟動子區(qū)域激活或抑制特定基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控其正常生理功能［18］。YY1可參與雌性動物卵母細(xì)胞成熟以及顆粒細(xì)胞的擴(kuò)張過程［19］。在豬顆粒細(xì)胞中，YY1可激活TAC3基因轉(zhuǎn)錄活性［20］。同時，Dong等［21］發(fā)現(xiàn)YY1參與了克隆豬胚胎XIST和XCI的表達(dá)調(diào)控，抑制YY1的表達(dá)可以提高克隆豬胚胎的發(fā)育率。特異性蛋白（specificity protein 1，SP1）是一種進(jìn)化上高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等過程［22］。原始卵泡（PF）池對于動物生殖至關(guān)重要，SP1通過調(diào)節(jié)哺乳動物卵巢中的顆粒前細(xì)胞發(fā)育來控制卵巢儲備的建立［23］。同時，研究發(fā)現(xiàn)SP1可通過調(diào)節(jié)卵巢中的原始到初級卵泡過渡［24］.在湖羊中的研究表明，湖羊SP1基因可抑制人卵巢顆粒細(xì)胞 （KGN） 增殖、誘導(dǎo)其凋亡過程［25］。對此，本研究推測SP1和YY1基因作為真核生物基因啟動子上的調(diào)控因子，可能與哺乳動物卵泡發(fā)育過程相關(guān)。但是本研究中，轉(zhuǎn)錄因子YY1和SP1是否與豬miR-23a-27a-24簇核心啟動子區(qū)結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)及影響豬卵泡的發(fā)育過程，還有待于今后通過基因突變、ChIP以及EMSA等技術(shù)，重點(diǎn)對豬miR-23a-27a-24簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及其在豬特定生物學(xué)過程中調(diào)控作用進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建并確定了豬miR-23a-27a-24簇核心啟動子區(qū)域，并預(yù)測了SP1和YY1可能參與豬miR-23a-27a-24簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。本研究結(jié)果可為豬miR-23a-27a-24簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及其對豬特定生物學(xué)過程的研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)（References）

［1］崔夢瑩. MicroRNA-23a-27a-24-2簇在肝細(xì)胞癌中的功能及調(diào)控機(jī)制研究［D］. 吉林：吉林大學(xué)， 2020.

［2］TANZER A， STADLER P F. Molecular evolution of a microRNA cluster［J］. J Mol Biol， 2004，339（2）：327- 335.

［3］KIM Y K， YU J， HAN T S， et al. Functional links between clustered microRNAs： suppression of cell-cycle inhibitors by microRNA clusters in gastric cancer［J］. Nucleic Acids Res， 2009，37（5）：1672- 1681.

［4］CHHABRA R， DUBEY R， SAINI N. Cooperative and individualistic functions of the microRNAs in the miR-23a～27a～24-2 cluster and its implication in human diseases［J］. Mol Cancer， 2010，9：232.

［5］聶明月，楊曉葵. miR-23a和miR-27a在卵巢中的生理與病理作用［J］. 國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志， 2014， 33（5）： 367-369.

NIE M Y，YANG X K. Physiological and pathological roles of miR-23a and miR-27a in the ovary［J］. International Journal of Reproductive Health/Family Planning， 2014， 33（5）： 367-369.

［6］KIM Y J， KU S Y， KIM Y Y， et al. MicroRNAs transfected into granulosa cells may regulate oocyte meiotic competence during in vitro maturation of mouse follicles［J］. Hum Reprod， 2013，28（11）：3050- 3061.

［7］NIE M， YU S， PENG S， et al. miR-23a and miR-27a promote human granulosa cell apoptosis by targeting SMAD5. Biol Reprod， 2015，93（4）：98.

［8］王思琪，張卓凡，楊柳，等. miR-23a-27a-24簇在豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡中的作用［J］. 畜牧與獸醫(yī)， 2022， 54（4）： 1-9.

WANG S Q，ZHANG Z F，YANG L，et al.The role of the miR-23a-27a-24cluster in the apoptosis of porcine ovarian granulosa cells［J］.Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2022， 54（4）： 1-9.

［9］LEE Y， KIM M， HAN J， et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II［J］. EMBO J， 2004，23（20）：4051-4060.

［10］LI X， LIU X， XU W， et al. c-MYC-regulated miR-23a/24-2/27a cluster promotes mammary carcinoma cell invasion and hepatic metastasis by targeting Sprouty2［J］. J Biol Chem， 2013，288（25）：18121-18133. .

［11］ALAM J， COOK J L. Reporter genes： application to the study of mammalian gene transcription［J］. Anal Biochem， 1990，188（2）：245-254.

［12］ZHOU X， RUAN J， WANG G， et al. Characterization and identification of microRNA core promoters in four model species［J］. PLoS Comput Biol， 2007，3（3）：e37.

［13］陸杏蓉，段安琴，馬小婭，等. 水牛HSD17B1基因啟動子熒光素酶報告基因載體構(gòu)建與分析［J］. 中國畜牧獸醫(yī)， 2021， 48（10）： 3512-3521.

LU X R，DUAN A Q，MA X Y，et al.Construction and analysis of the luciferase reporter gene vector of HSD17B1Gene promoter in buffalo［J］.China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2021， 48（10）： 3512-3521.

［14］薛梅，李旭，陳葳. 人UCA1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的生物信息學(xué)分析與鑒定［J］. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2013， 33（11）： 1596-1599.

XUE M，LI X，CHEN W.Bioinformatics analysis and identification of transcriptional regulation of human UCA1gene［J］.Journal of Southern Medical University，2013， 33（11）： 1596-1599.

［15］馬冬梅，韓林強(qiáng)，白俊杰. 大口黑鱸GHRH基因啟動子區(qū)域序列分析及其活性檢測［J］. 海洋漁業(yè)， 2016， 38（4）： 383-390.

MA D M，HAN L Q，BAI J J，et al. Sequence and activity analysis of GHRHpromoter region from Micropterus salmoides［J］.Marine Fisheries， 2016， 38（4）： 383-390.

［16］周琳，高春芳，王皓，等. 人B細(xì)胞活化因子基因啟動子活性研究［C］.中國免疫學(xué)會第五屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要， 2006： 293.

［17］FITZ E， WANKA F， SEIBOTH B. The promoter toolbox for recombinant gene expression in trichoderma reesei［J］. Front Bioeng Biotechnol， 2018，6：135.

［18］ATCHISON M， BASU A， ZAPRAZNA K， et al. Mechanisms of Yin Yang 1 in oncogenesis： the importance of indirect effects［J］. Crit Rev Oncog， 2011，16（3-4）：143-161.

［19］MARK B，JOHN S. Targeted inhibition of the transcription factor YY1 in an embryonal carcinoma cell line results in retarded cell growth， elevated levels of p53 but no increase in apoptotic cell death［J］. Eur J Cell Biol， 2005，84（5）：543-553.

［20］李忠慧，袁曉龍，邢燕，等. 豬速激肽3基因啟動子活性及其表達(dá)調(diào)控的初步研究［J］. 畜牧與獸醫(yī)， 2018， 50（6）： 12-18.

LI Z H，YUAN X L，XING Y，et al.Analysis of the promoter activity and its regulation of TAC3 gene expression in pig［J］.Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2018， 50（6）： 12-18.

［21］DONG Y Z， WU X， PENG X T， et al. Knockdown of YY1 inhibits XIST expression and enhances cloned pig embryo development［J］. Mdpi Ag， 2022， 23（23）： 14572.

［22］VELLINGIRI B， IYER M， DEVI S， et al. Understanding the role of the transcription factor sp1 in ovarian cancer： from theory to practice［J］. Int J Mol Sci， 2020，21（3）：1153.

［23］HAN C，BINGYING L，HUARONG W， et al. SP1 governs primordial folliculogenesis by regulating pregranulosa cell development in mice［J］. Oxford University Press（oup）， 2019， 12（3）： 230-244.

［24］ZHOU J， LIN L， CAI H， et al. SP1 impacts the primordial to primary follicle transition by regulating cholesterol metabolism in granulosa cells［J］. FASEB J， 2023，37（2）：e22767.

［25］姚一龍，李隱俠，安外爾·熱合曼，等. 湖羊Sp1基因CDS區(qū)克隆及其對顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報， 2017， 48（11）： 2098-2106.

YAO Y L，LI Y X，REHEMAN·Anwaier，et al.Cloning of Sp1Gene CDSRegion of Hu sheep and its effect on proliferation and apoptosis of granulosa cells［J］.Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences，2017， 48（11）： 2098-2106.

（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-11-16

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460586，31960645），新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目（2020CB018），石河子大學(xué)動植物育種專項(xiàng)項(xiàng)目（XJ2019000401）

作者簡介：李清春（1995—），男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)閯游镞z傳育種與繁殖。

*通信作者：黃濤（1978—），男，教授，從事豬分子育種研究，e-mail：taohuang100@sina.com。