陳思羽，王越，林麗婷，文飛燕，裴瑾

肺經草始見于《天寶本草》，載：“肺經草即半邊錢[1]?！苯浛甲C《天寶本草》中肺經草為傘形科Umbelliferae薄片變豆菜Sanicula lamelligeraHance的干燥全株[2]。肺經草在《中國民族藥辭典》、《中國民族藥志》、《中藥大辭典》、《中華本草》、《四川省中藥資源志要》等也均有記載?！吨兴幋筠o典》和《中華本草》記載為：大肺筋草為“傘形科變豆菜屬Sanicula薄片變豆菜Sanicula lamelligeraHance和天藍變豆菜Sanicula coerulescensFranchet[3,4]?！蓖瑫r，《四川中藥飲片炮制規(guī)范》1977年版和1984年版收載的“肺筋草”，均為傘形科植物薄片變豆菜干燥全株。生長在海拔500～2000m的陰濕山坡，溝邊，路旁及林下的濕潤砂質土壤，溪邊濕地路旁竹林或陰濕雜木林下[5,6]。產于四川樂山、峨眉、都江堰、涼山州等地區(qū)。依據大量文獻記載和實地調查發(fā)現，雖然四川省民間作肺經草使用的有變豆菜屬6種2變種，但形成商品品種流通的僅有薄片變豆菜和天藍變豆菜[7,8]，故將薄片變豆菜和天藍變豆菜作為肺經草基原種。

肺經草中主要含黃酮、三萜皂苷、倍半萜類成分[9-13]，其中黃酮類成分可能與其化痰止咳，活血調經的藥理作用有關。周小江對肺經草品質進行研究發(fā)現，肺經草的乙酸乙酯提取部位的主要成分為總黃酮成分，具有良好的祛痰作用[14,15]。有研究表明，肺經草中總黃酮成分具有一定的抑制流感病毒增殖的作用[16]，Liu[17]從肺經草中提取得到一個新的黃酮苷元—saniculamin C，對人胃癌細胞有強效抗增殖活性，具有較高的臨床應用價值。同時，《天寶本草》記載：“肺經草即半邊錢，專包臍風又化痰哮吼咳嗽，稱第一，四時感冒，散風寒[18]。”《中國民族藥辭典》記載：“全草治風濕疼痛；全草（燉肉）治瘦弱；全草（泡酒）治跌打損傷[19]?！彼员緦嶒炓罁偶同F代研究，擬將總黃酮作為質量標準控制物。

規(guī)范化的質量標準建立是肺經草現代化研究的重要內容，本研究按照《中國藥典》2020年版中相關規(guī)定、參照藥材質量標準的制定方法，對來自不同產地、基原的11批肺經草藥材進行形態(tài)、性狀、顯微特征和薄層色譜鑒別，對其水分、灰分、浸出物等進行檢查，并以總黃酮成分和黃酮類化合物槲皮素為指標建立提取和HPLC含量測定方法，以期建立肺經草藥材規(guī)范化的質量標準，為其質量控制和臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

Ulti Mate 3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）KQ-600DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、SOP型電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）、DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、ZF-90型紫外分析儀（溫州奧利生物醫(yī)學儀器廠）、HWS24型電子恒溫水浴鍋（上海一恒）、Spectra Max iD3型酶標儀（美谷分子儀器上海有限公司）、Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 250mm×150 mm，5μm（安捷倫科技中國有限公司）、DM2500型萊卡電子顯微鏡（青島泰斯鼎科技有限公司）。

1.2 藥物與試劑

蘆丁對照品（純度≥9 8%，批號M U S T-21101104，成都市科恩化學品有限公司），槲皮素對照品（純度≥98%，批號MUST-21101104，成都市科恩化學品有限公司）；甲醇、甲酸、乙醇、甲苯、乙酸乙酯等為分析純，均購于成都市科恩化學品有限公司。Silica gel 60型鋁箔板（德國Merck公司）；Silica gel 60型高效硅膠薄層層析板（德國Merck公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

11批肺經草藥材由野外采集和藥材市場購買，經由成都中醫(yī)藥大學中藥資源教研室裴瑾教授鑒定為傘形科變豆菜屬植物薄片變豆菜Sanicula lamelligeraHance和天藍變豆菜Sanicula coerulescensFranchet的干燥全草。11批樣品的詳細信息（見表1）。

表1 肺經草樣品采集信息表

2 方法

2.1 植物形態(tài)

薄片變豆菜Sanicula lamelligera Hance 多年生矮小草本，高15～50cm。全株無毛。根莖粗短，多數細長的側根，棕褐色。莖3～17，直立，花葶狀、上部分；基生葉葉柄長5～18cm，葉片橢圓形或心形，長2～6cm，寬3～9cm，掌狀三裂，中裂片楔狀倒卵形或橢圓狀倒卵形至菱形，上部3淺裂，基部楔形、有短柄；最上部的莖生葉小，三裂至不分裂，裂片線狀披針形，葉片背面有較明顯的葉脈，淡紫紅色或淺綠色，表面綠色。花序通常二至四回二歧分枝，葉緣有刺毛；花瓣白色。果實為雙懸果，長卵形或卵形，長2.5mm，寬2mm，幼果表面有嚙蝕狀或微波狀薄層，成熟后成短直皮刺、基部連成薄片；花、果期4～11月。

天藍變豆菜Sanicula coerulescens Franch. 本品與薄片變豆菜的區(qū)別為：側生的傘形花序無柄，花序呈假總狀花序，萼齒線形或呈刺毛狀?；?、果期3～7月（見圖1）。

圖1 肺經草原植物圖1-薄片變豆菜；2-天藍變豆菜

2.2 藥材性狀鑒別

藥材多皺縮成團，根莖短，須根多呈黑褐色?；~葉柄長至近20cm；葉片常破碎，完整者展平后呈心狀卵形、圓心形或近五角形，長2～7cm，寬3～10cm，掌狀三裂，葉緣具缺刻或圓鋸齒；葉上表面灰綠色、黃綠色至黃褐色，下表面黃綠色、黃褐色或紫褐色，可見明顯的紫褐色或深褐色的葉脈。帶花者，傘形花序或呈假總狀花序，細小?？梢婋p懸果，球形、長卵形或卵形，長2～3mm，果實表面具短而直的皮刺。質脆易碎，氣微，味淡，微苦。

天藍變豆菜與薄片變豆菜的區(qū)別：側生的傘形花序無柄，花序呈假總狀花序；萼齒線形或呈刺毛狀（見圖2）。

圖2 肺經草藥材圖1-薄片變豆菜；2-天藍變豆菜

2.3 粉末顯微特征鑒別

薄片變豆菜的粉末為灰黃綠色至灰褐色，氣微，味淡，微苦。草酸鈣簇晶，直徑15～40μm，棱角多銳尖。淀粉粒單粒或多粒存在，橢圓形或圓形，直徑5～10μm，復粒由2～4個分粒組成導管多為螺紋導管，少見網紋導管，長40～400μm，直徑8～10μm。纖維成束存在，微木化或木化。木栓細胞淡黃色，長方形或類圓方形，排列緊密，垂周壁微波狀增厚。表皮細胞垂周壁波狀彎曲，氣孔不定式或不等式。（見圖3）

圖3 肺經草粉末顯微特征圖1-簇晶；2-導管；3-纖維束；4-表皮細胞及氣孔；5-木栓細胞

天藍變豆菜粉末顏色、氣味、顯微特征與薄片變豆菜類似，只是在長度大小方面有差異，天藍變豆菜導管長度平均值小于薄片變豆菜，簇晶雖有但數量不及薄片變豆菜。

2.4 薄層色譜鑒別

2.4.1 供試品溶液制備 取本品粉末1g，加80%甲醇50ml，加熱回流1h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20ml使溶解，用乙醚萃取2次，每次20ml，棄去乙醚液，水液加乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，棄去水液，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取肺經草對照藥材粉末1g，同法制成對照藥材溶液[20-23]。

2.4.2 薄層色譜條件及結果 照薄層色譜法（中國藥典2020年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上。以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:4:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在Rf值0.2～0.7范圍內，應呈現1個淺藍色主斑點（見圖4）。

圖4 肺經草樣品TLC圖

2.5 藥材檢查項

對藥材進行常規(guī)檢查可以有效評價藥材的優(yōu)劣。水分照《中國藥典》2020年版水分測定法通則0832第二法測定[24]；總灰分和酸不溶性灰分照《中國藥典》2020年版灰分測定法通則2302測定[25]；浸出物根據《中國藥典》2020年版浸出物測定法通則2201項下的熱浸法進行測定[26]。11批樣品的水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的測定結果（見表2）。根據測定結果，11批樣品的水分在11.162%～13.178%，平均為12.056%；總灰分在13.932%～28.570%，平均為17.692%；酸不溶性灰分在1.063%～6.551%，平均為2.638%；水浸出物（熱浸法）在15.707%～22.827%，平均為19.027%。

表2 肺經草樣品檢查項測定結果（n=3）

2.6 總黃酮含量測定

2.6.1 蘆丁對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品5mg，用50%乙醇定容溶解并定容至25ml，配成0.2mg·ml-1的蘆丁標準溶液。

2.6.2 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液1、2、3、4、5、6ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（2020年版《中國藥典》四部，通則0401[27]），在500nm波長處測定吸光度。以濃度（X，mg·ml-1）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線。

2.6.3 供試品溶液制備和測定方法 取薄片變豆菜粉末（過三號篩）0.5g，采用超聲提取的方法，選取體積分數為50%的乙醇溶液、料液比1:20（g·ml-1）、提取時間30min、超聲功率（100W，100HZ），過濾，精密量取0.5ml濾液，置25ml容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，即得。照“2.6.2”項下，自“加水至6ml”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀取供試品溶液中含蘆丁的濃度（mg·ml-1），計算，即得[28,29]。

2.6.4 加樣回收率試驗 采用加樣回收法，對已知濃度的藥材粉末提取液6份，分別加入已知濃度50%的對照品溶液，按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液，測定吸光度，計算回收率，計算得RSD為1.674%（n=6）（見表3）。

表3 肺經草樣品加樣回收率結果（n=6）

2.6.5 線性關系考察 以濃度（X，mg·ml-1）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得到回歸方程Y =10.593X+0.0044（r=0.9991，n=6）。結果表明，蘆丁對照品溶液質量濃度在0.0083～0.0495 mg·ml-1的范圍內與吸光度線性關系良好。

2.6.6 測定結果 稱取11批樣品，按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液，測定吸光度。11批樣品的總黃酮含量測定結果（見表4）。根據測定結果，總黃酮含量在1.658%～6.598%之間，平均值為3.420%。

表4 肺經草樣品總黃酮含量測定結果（n=3）

2.7 槲皮素含量測定

2.7.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（250mm×150 mm，5μm）；流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；檢測波長為360nm；流速1mL min-1；進樣量：10μL；柱溫：25℃。

2.7.2 對照品溶液制備 精密稱取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液。

2.7.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末（過三號篩）約2g，置于250ml具塞錐形瓶中，精密加入50ml 80%甲醇，稱定質量，加熱回流1.5h，取出，放冷，80%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，加濃鹽酸5ml，加熱回流1.5h，放涼，轉移至50ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.7.4 系統適應性考察 取對照品、供試品溶液適量，在“2.7.1”項色譜條件下進樣測定（見圖5）。由此可知，各成分色譜峰周圍無干擾峰，與其它峰完全分離（分離度＞1.5），理論塔板數以槲皮素計，不低于5000。

圖5 對照品和肺經草供試樣品HPLC圖

2.7.5 線性關系考察 精密量取對照品溶液適量，逐級稀釋，定容，制得6個質量濃度，在“2.7.1”項色譜條件下進樣測定。以槲皮素峰面積（y）對樣品濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程：y=2.5097x-0.4215，R2=0.9929，表明槲皮素含量在1μg·ml-1～6μg·ml-1的范圍內線性關系良好。

2.7.6 方法學考察 對該方法進行精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率試驗，發(fā)現所得結果均符合分析要求。

2.7.7 樣品含量測定 取11批藥材，按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.7.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量結果（見表5）。根據測定結果，槲皮素含量在0.0000168～0.000104 mg·g-1之間。因其平均值含量小于千分之一，不納入質量標準。

表5 供試品中槲皮素含量測定結果（ˉx±SD, n = 3）

3 討論

本文依據《中國藥典》2020年版四部通則，分別從性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜鑒別對肺經草藥材進行了定性鑒別，從水分、總灰分、酸不溶灰分、水熱浸法對肺經草藥材進行了檢查，以蘆丁為對照品進行了總黃酮含量測定，同時以槲皮素為對照品進行了HPLC含量測定，系統開展了肺經草的質量標準研究。通過研究發(fā)現，薄片變豆菜與天藍變豆菜之間在根、莖、葉有極大的相似性，2者之間的區(qū)別為：薄片變豆菜花序為二歧分枝，天藍變豆菜側生的傘形花序無柄，花序呈假總狀花序；萼齒線形或呈刺毛狀。綜合評價不同產地及批次的11批樣品結果。

肺經草現主產于成都平原及周邊地區(qū)，夏秋季節(jié)雨水較多，故應保持藥材干燥，規(guī)定水分不得過14.000%。根據測定結果FJC-3的總灰分含量為28.570%，FJC-5的酸不溶灰分為6.551%，均高于平均值。查看原藥材性狀可知，市場購買的藥材為直接采挖曬干，并未進行過任何清洗加工，所以含的泥沙較多；考慮此標準有著規(guī)范市場的作用，故規(guī)定總灰分不得過20.000%，酸不溶性灰分不得過4.000%。浸出物測定時，對冷浸法和熱浸法進行考察，其中熱浸法中以水為溶劑含量最高，這也與民間民族常用用法水煎煮相吻合，因此擬定浸出物含量不得少于15.000%?？傸S酮與肺經草的藥效息息相關，根據測定的數據，擬定總黃酮含量以蘆?。–27H30O16）計，不得少于2.000%，但由于槲皮素含量較少，作者不建議將槲皮素作為質量標志控制物。因此，確定肺經草藥用基原植物為傘形科變豆菜屬薄片變豆菜Sanicula lamelligeraHance和天藍變豆菜Sanicula coerulescensFranchet的干燥全草。

本實驗采取的方法經過多次篩選獲得。薄層色譜鑒別比較了甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:5:1、5:4:1、5:3:1）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-水（6:12:5:2）等展開系統，經過反復試驗，確定甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:4:1）為展開系統，最終得到的薄層色譜斑點分離度較好，還增加了2種基原的對照藥材，提高了TLC法的專屬性。同時比較了不同廠家，不同類型的薄層色譜板和鋁箔板并進行耐用性考察，結果均表明本方法的專屬性和耐用性良好。本實驗在對肺經草總黃酮含量進行測定時，考察了三種因素—乙醇體積分數、液料比和提取時間對其提取率的影響，設置乙醇體積分數：50、60、70、80、90%；料液比：1:20、1:30、1:40、1:50、1:60；提取時間：30、45、60、75、90min。最終確定肺經草總黃酮提取料液比為20:1，乙醇濃度為50%，提取時間為30min。

本研究為四川省藥品監(jiān)督管理局《四川省民族藥材標準》品種質量標準制定科研項目內容之一，綜合評價不同產地及批次的11批樣品結果。根據研究結果擬定了肺經草質量控制指標，填補了肺經草作為藥材入藥無相關質量標準的空白，區(qū)別于現行藥典日漸提高精細化的標準制定方向，本標準是實用性和適用性兼?zhèn)涞膶嵱脴藴?，落地可實施，能很好地?guī)范市場，同時也為肺經草資源的進一步綜合利用與開發(fā)奠定基礎。