河北中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院/河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點實驗室

張英美 羅 琳 牛若冰 胡書嬋 朱 晗 孫 瑩 賀 明(石家莊 050200)

提要 目的：研究補腎溫陽化瘀方治療子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)的作用，探討其調(diào)控蛋白激酶C(PKC)信號通路的機制。方法：將50只SPF級8～10周齡雌性SD大鼠隨機分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組和西藥組，每組10只。采用自體移植法復制EMs大鼠模型，造模成功后分別給予補腎溫陽化瘀方低、高劑量及孕三烯酮灌胃，假手術(shù)和模型組灌胃蒸餾水，連續(xù)21 d。HE染色觀察在位內(nèi)膜及異位灶的病理形態(tài)改變；Western blot測定在位內(nèi)膜及異位灶磷酸化蛋白激酶C的α亞型(p-PKCα)、蛋白激酶C的α亞型(PKCα)蛋白的表達水平。結(jié)果：模型組在位內(nèi)膜和異位灶p-PKCα蛋白水平升高；給予補腎溫陽化瘀方治療后，p-PKCα的蛋白表達水平降低(P<0.05)，PKCα的蛋白表達水平無明顯變化。結(jié)論：補腎溫陽化瘀方通過抑制PKC信號通路來治療EMs。

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是指子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))生長在子宮腔被覆內(nèi)膜及子宮以外的部位，簡稱內(nèi)異癥。其發(fā)病率逐年上升，僅次于婦科炎癥性疾病和子宮肌瘤[1]。在育齡女性中，內(nèi)異癥的總體患病率約10%[2]。補腎溫陽化瘀方應(yīng)用于臨床多年，臨床療效顯著[3]。蛋白激酶C(PKC)是蛋白激酶家族中的一員，通過調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附、遷移、侵襲和凋亡[4-5]等病理生理過程發(fā)揮重要作用。本研究通過觀察補腎溫陽化瘀方對PKC信號通路的影響，探討補腎溫陽化瘀方治療EMs的可能分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠50只，8～10周齡，體質(zhì)量(220±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2021-0011。

1.2 實驗藥物 補腎溫陽化瘀方(組成：炮附子6 g，肉桂、小茴香各10 g，黨參、炒白術(shù)各15 g，川芎、制沒藥各10 g，川楝子15 g，川牛膝10 g，桑寄生、狗脊各30 g，吳茱萸9 g等)購于樂仁堂藥房，制成精制混懸液；中藥低劑量組生藥濃度3.9 g/mL，中藥高劑量組生藥濃度7.8 g/mL。異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，20110401)；孕三烯酮膠囊(北京紫竹藥業(yè)有限公司，3210301)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，684A)；硫酸慶大霉素注射液(石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，068210502)。

1.3 主要試劑 蛋白激酶C的α亞型(PKCα)抗體(proteintech，21991-1-AP)；磷酸化蛋白激酶C的α亞型(p-PKCα)、抗體(abcam，ab23513)；GAPDH(proteintech，60004-1-IG)；HRP標記的山羊抗兔IgG(Abbkine，A21020)；HRP標記的山羊抗鼠IgG(Abbkine，A21010)；伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司，G1108)；蘇木素染色液(北京索萊寶科技有限公司，G1080)。

1.4 主要儀器 小動物麻醉機(美國MIDMARK公司，型號：VMR)；病理圖文分析系統(tǒng)(日本，型號：DP72CCD)；切片機(德國LEICA，型號：RM2245)；攤烘烤片一體機(維克科教儀器有限公司，型號：VCM-TK7218)；低溫高速離心機(基因有限公司，型號：173R)；分光光度計(基因有限公司，型號：NANODROP 2000C)；垂直電泳槽(美國伯樂公司，型號：Mini PROTEAN?Tetra Cell)；電泳儀(美國伯樂公司，型號：PowerPacTMUniversal Power Supply)；半干式轉(zhuǎn)膜儀(美國伯樂公司，型號：Trans-Blot SD Cell)；化學發(fā)光系統(tǒng)(易孛特生命科學有限公司，型號：Touch Imager)

2 方法

2.1 動物模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按隨機數(shù)字表法分為5組，每組10只，分別為假手術(shù)組、模型組、中藥低、高劑量組和西藥組。采用自體移植法建立內(nèi)異癥大鼠模型[6]。戊酸雌二醇片灌胃3 d，期間陰道涂片觀察大鼠處于統(tǒng)一動情周期后，予以異氟烷麻醉，取大鼠尿道口正上方約2 cm 處開腹，剪右側(cè)子宮中段(約2 cm)，立刻放置于生理鹽水中，剝離干凈后縱形剖開子宮，將子宮內(nèi)膜面緊貼在左側(cè)腹壁上，然后縫合固定在腹腔內(nèi)壁。假手術(shù)組只開腹不造模。為預(yù)防術(shù)后感染，造模后給予慶大霉素腹腔注射，連續(xù)3 d，術(shù)后第4 d開始給藥治療。補腎溫陽化瘀方低、高劑量組分別給予相應(yīng)劑量19.4 g/kg 、38.8 g/kg灌胃，1次/d；孕三烯酮組灌胃劑量同臨床等效劑量，即0.25 mg/kg，2次/w；假手術(shù)組、模型組及孕三烯酮組非給藥時間均給與同體積蒸餾水灌胃，連續(xù)21 d。

2.2 組織的收集與處理 采用異氟烷對大鼠進行麻醉后，觀察腹壁異位灶形態(tài)，取異位灶和在位子宮組織，部分組織采用 4%多聚甲醛溶液固定，剩余組織置于-80℃冰箱保存。

2.3 一般狀況觀察 開腹后觀察大鼠異位灶組織生長情況。

2.4 HE染色觀察各組大鼠異位灶病理形態(tài) 大鼠組織切片按常規(guī)步驟處理后，采用蘇木素和伊紅染液分別進行細胞核和細胞質(zhì)染色，顯微鏡下觀察并進行圖像采集。

2.5 Western blot測定p-PKCα、PKCα蛋白的表達 提取在位內(nèi)膜及異位灶組織的總蛋白，測定蛋白濃度后，每組取等量蛋白變性，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白分離后，采用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h后，采用相應(yīng)一抗4℃孵育過夜。次日洗膜后，對應(yīng)二抗孵育1 h，清洗后用化學發(fā)光系統(tǒng)進行凝膠成像。用Image J分析軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標蛋白/GAPDH的數(shù)值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠異位灶情況觀察 模型組異位灶明顯，體積較大，表面血管豐富，與周圍組織黏連嚴重；與模型組比較，中藥組異位灶體積及血管網(wǎng)隨劑量加大而逐漸減??；西藥組也同樣抑制異位灶的形成。見圖1。

注：A.模型組；B.中藥低劑量組； C.中藥高劑量組；D.西藥組

3.2 各組大鼠異位灶組織形態(tài)觀察 HE結(jié)果顯示，假手術(shù)組子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，高柱狀上皮細胞整齊、緊密排列，腺體豐富；模型組異位內(nèi)膜上皮細胞呈低柱狀或乳頭突起狀，炎性細胞浸潤及血管增生明顯，腺體數(shù)量較少；各中藥組和西藥組的異位內(nèi)膜均可見不同程度的萎縮，上皮細胞不完整，間質(zhì)細胞小，腺體數(shù)目少，腺腔內(nèi)有少量白細胞。見圖2。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組異位灶；C.中藥低劑量組異位灶；D.中藥高劑量組異位灶；E.西藥組異位灶

3.3 各組大鼠在位內(nèi)膜和異位灶中p-PKCα、PKCα蛋白水平的比較 模型組子宮在位內(nèi)膜p-PKCα的蛋白表達水平高于假手術(shù)組(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義；中藥高劑量組和西藥組子宮在位內(nèi)膜p-PKCα的蛋白表達水平低于模型組(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義，詳見表1。

表1 各組大鼠在位內(nèi)膜中 PKCα、p-PKCα蛋白相對表達量

中藥高劑量組和西藥組異位灶組織p-PKCα的蛋白表達水平低于模型組(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義，詳見表2。各組大鼠子宮在位內(nèi)膜和異位灶組織中PKCα的蛋白表達水平均無明顯變化(P>0.05)。詳見表1、表2。

表2 各組大鼠異位灶中 PKCα、p-PKCα 蛋白相對表達量

4 討論

EMs因人和病變部位的不同，臨床表現(xiàn)各異，常表現(xiàn)為疼痛、不孕、月經(jīng)異常等癥狀，嚴重影響女性的生活品質(zhì)和健康。內(nèi)異癥雖然是良性病變，卻具備侵襲、轉(zhuǎn)移及復發(fā)等惡性行為，因其確切發(fā)病機制尚不明確，是目前臨床常見的難治性婦科疾病[7]。故對本病發(fā)病機制及治療手段的探索己成為婦科領(lǐng)域十分關(guān)注的問題。

中醫(yī)古籍中并無EMs病名，但依據(jù)其臨床表現(xiàn)，歸屬于中醫(yī)“痛經(jīng)”“癥瘕”“不孕”等范疇。中醫(yī)學者認為“血瘀”是EMs的病理基礎(chǔ)，眾多醫(yī)家從不同角度對EMs“血瘀證”的病機進行了探討和研究，豐富了內(nèi)異癥的病機學說。瘀血阻于沖任、胞宮，為本病的基本病理特點，“久病及腎”，易致腎虛；臨床常表現(xiàn)為下腹部畏寒喜暖、甚至腰以下冰冷，當屬虛寒。腎陽不足，虛寒內(nèi)生，寒客胞宮，血與寒凝，瘀血阻于沖任，致使沖任氣血失調(diào)，離經(jīng)之血凝集，而發(fā)生內(nèi)異癥[8]。

近年來，中醫(yī)藥治療EMs取得了很多進展。連方等采用祛瘀解毒法[9]，魏郁清等采用補腎序貫結(jié)合活血化瘀法[10]，趙瑞華等采用活血化瘀法[11]能明顯改善EMs抑郁焦慮患者臨床癥狀。劉海燕等應(yīng)用補腎祛瘀法分排卵期前和排卵期后治療EMs不孕，患者妊娠率可得到有效提高[12]。全國名中醫(yī)杜惠蘭教授提出補腎溫陽、祛寒化瘀為基本治法，并以此為理論指導，創(chuàng)立補腎溫陽化瘀方應(yīng)用于臨床多年，臨床療效顯著。對補腎溫陽化瘀方進行臨床研究，發(fā)現(xiàn)中藥組患者在生理領(lǐng)域、心理領(lǐng)域、獨立性領(lǐng)域、社會關(guān)系領(lǐng)域的評分均優(yōu)于孕三烯酮對照組，可以明顯改善患者的臨床癥狀及生活品質(zhì)，臨床總有效率達73.33%～82%，可明顯改善患者痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)期腰骶痠痛、性交痛、性欲減退、形寒肢冷、神疲乏力等癥狀體征，且無明顯副作用出現(xiàn)[13]。方中炮附子和桑寄生共為君藥，二者共奏補火助陽、散寒止痛、補益肝腎之功；肉桂和狗脊共為臣藥，加強溫陽散寒止痛功效；小茴香、川芎、制沒藥等活血化瘀、理氣止痛，共為佐藥。藥理學研究顯示附子具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，對延緩EMs病灶形成及緩解疼痛均具有良好的療效[14]，除此之外，桑寄生中的總黃酮[15]、狗脊的有效成分[16]、川芎的有效成分生物堿類[17]等均具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用。補腎溫陽化瘀方可以降低異位內(nèi)膜的黏附、侵襲、種植能力，抑制血管生成及神經(jīng)生長、降低細胞自噬、改善乏氧狀態(tài)從而抑制內(nèi)異癥的發(fā)展[18-22]。

現(xiàn)代研究認為，EMs的發(fā)病機制主要與基于腫瘤特征的侵襲和遷移、細胞增殖及凋亡等密切相關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，PKC信號通路激活可以刺激血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和白細胞介素-8(IL-8)的基因表達來誘導子宮內(nèi)膜修復[24]。采用基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，在EMs基質(zhì)細胞中PKCβ1表達增高[25]。在炎性痛和神經(jīng)病理性疼痛模型中，PKC的表達上調(diào)[26]，通過瞬時感受器電位香草酸亞型1(TRPV1)通道改變電流，導致痛覺過敏[27]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補腎溫陽化瘀方能夠激活TRPV1通道[18]，因此我們猜測PKC通路的激活可能與EMs的疼痛癥狀相關(guān)。也有大量文獻報道，中醫(yī)藥可通過核因子-κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt等多條信號通路改善EMs[28]。而PKC能調(diào)控MAPK/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移[29]、磷酸化的PKC可磷酸化NF-κB，進而促進炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)等釋放，導致疼痛的發(fā)生[30]。此可見PKC信號通路可能多途徑參與EMs的發(fā)生。

在本研究中，筆者檢測了各組大鼠在位內(nèi)膜及異位灶中PKCα、p-PKCα蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，模型組的p-PKCα蛋白水平顯著升高，經(jīng)治療后，治療組的p-PKCα蛋白水平均有不同程度下降。綜上所述，筆者認為補腎溫陽化瘀方通過抑制PKC信號通路來治療EMs，可能是通過PKC影響增殖、遷移、疼痛等，但還需進一步研究驗證。