趙四標(biāo)，張加穩(wěn)，王 燦，陳 嫻，刁玉華

(昆明市食品藥品檢驗(yàn)所 食品檢驗(yàn)中心，云南 昆明 650034)

腐乳在我國有悠久的歷史[1]，具有儲(chǔ)存時(shí)間長、風(fēng)味獨(dú)特、食用方便、營養(yǎng)物質(zhì)豐富等優(yōu)點(diǎn)[2].這種發(fā)酵食品，以其低廉的價(jià)格、美味的口感而被廣泛選用[3]，一直深受消費(fèi)者的青睞.尤其是油腐乳，它以細(xì)膩的口感和香甜的滋味[4]，成為云貴川地區(qū)獨(dú)具特色的發(fā)酵食品，深受當(dāng)?shù)厝嗣竦臍g迎.牟定腐乳作為省級(jí)地理標(biāo)志產(chǎn)品[5]，在云南轄區(qū)內(nèi)知名度高，受眾面廣，但在流通過程中，品牌較多、工藝水平差異大、質(zhì)量參差不齊等食品安全問題日益突出[6-8]，引起消費(fèi)者和相關(guān)部門關(guān)注.

越來越多科研工作者通過產(chǎn)地溯源、產(chǎn)地保護(hù)、元素指紋鑒定等技術(shù)手段參與到地理標(biāo)志產(chǎn)品和食品安全保護(hù)中.隨著礦物元素指紋分析技術(shù)的發(fā)展，它已經(jīng)成為一種重要的產(chǎn)地溯源手段，被廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)之中.從馬鈴薯[9]、食用油[10]、葡萄酒[11]、蜂蜜[12]、茶葉[13]、大米[14-16]、大豆[17]、咖啡[18]、苦蕎[19]等植物性農(nóng)產(chǎn)品，到包括羊肉[20]、牛肉[21]、豬肉[22]在內(nèi)的動(dòng)物性農(nóng)產(chǎn)品，都可以通過這種方式進(jìn)行溯源，上述研究結(jié)果顯示，基于礦物元素的分析技術(shù)在產(chǎn)地溯源、元素指紋鑒定等領(lǐng)域，具有科學(xué)性、準(zhǔn)確性和普遍性，可以有效地幫助企業(yè)實(shí)現(xiàn)溯源目標(biāo).現(xiàn)有關(guān)于腐乳的研究主要集中在安全性[23]、微生物種群[24，25]、風(fēng)味物質(zhì)[26，27]、營養(yǎng)成分[28]及制作工藝[29，30]等方面，而關(guān)于礦物元素指紋分析應(yīng)用于腐乳產(chǎn)地溯源尚未見相關(guān)報(bào)道.

本研究擬以不同產(chǎn)區(qū)不同品牌的31個(gè)腐乳樣品為實(shí)驗(yàn)材料，通過礦物元素含量分析討論，開展腐乳產(chǎn)地判別研究，建立適合于腐乳中礦物元素指紋分析的方法，為地理標(biāo)志產(chǎn)品牟定腐乳開展產(chǎn)地判別、品牌鑒定及產(chǎn)地溯源保護(hù)提供一定的參考與依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ICP分析用26種元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh、Sc、Tb多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)液)(標(biāo)液元素質(zhì)量濃度分別為 100 μg/mL、10 μg/mL，標(biāo)液介質(zhì)為15%(V/V)HCl，5%(V/V)HNO3，2%(V/V)HF)；國家標(biāo)準(zhǔn)樣品汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(以上標(biāo)液來源于國家有色金屬分析測(cè)試中心，濃度為 1 000 μg/mL，標(biāo)液介質(zhì)為 1 mol/L HNO3，唯一標(biāo)識(shí)：211002-7)；硝酸(優(yōu)級(jí)純、川東化工)；過氧化氫；待測(cè)樣品腐乳；超純水(18.2 MΩ·cm).

1.2 儀器與設(shè)備

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(廠家：賽默飛，型號(hào)：ICP-MS iCAP Q)、微波消解儀(廠家：安東帕、型號(hào)Multiwave PRO、聚四氟乙烯消解罐41支)、分析天平(梅特勒、型號(hào)AL104，感量為 0.000 1 g)、自動(dòng)控溫恒溫電熱板(BHW-09A45)、超純水機(jī)(賽多利斯ariumbagtank 50)、高純氬氣(純度>99.999%)、高純氦氣(純度>99.999%).

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

隨機(jī)采集3個(gè)產(chǎn)地，14個(gè)品牌的市售腐乳產(chǎn)品，共計(jì)31個(gè)樣品，采樣相關(guān)信息見表1.將隨機(jī)采集的腐乳樣品調(diào)制均勻待用.

表1 樣品信息表

1.3.2 樣品分析

為了準(zhǔn)確地檢測(cè)腐乳樣品中各種礦物元素含量，按照現(xiàn)行國標(biāo)GB 5009.268—2016[31]開展實(shí)驗(yàn).稱取 0.300 g 腐乳樣品置于消解罐中，加入 7 mL 濃硝酸后放置過夜，之后按照GB 5009.268—2016第一法的升溫方式進(jìn)行消化處理，以確保消解完全.消解完成后，使用控溫電熱板 80 ℃ 趕酸 1.5 h，純水定容至 50 mL，待測(cè).使用經(jīng)調(diào)諧后，各元素靈敏度、氧化物、雙電荷各參數(shù)條件符合的電感耦合等離子質(zhì)譜儀測(cè)定樣品中Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe、Cu、Mn、Ni、Ti、V、Cr、Cd、As、Se、Sr、Tl、Pb、Mo、Co、Sn、Sb、Ba、Hg 24種元素的含量，用外標(biāo)法進(jìn)行定量，通過三通在線添加內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正.電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的工作條件參照GB 5009.268—2016附錄B儀器參考條件B.1.檢測(cè)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)內(nèi)標(biāo)回收率在90%～110%之間，偏差高于±10%時(shí)，重新測(cè)定，單個(gè)腐乳樣品采用連續(xù)重復(fù)測(cè)定3次后取平均值進(jìn)行定值.

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019與SPSS 19兩種不同的數(shù)據(jù)處理軟件，解析出不同的分析結(jié)果，包括方差分析、主成分分析、判別解析以及聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

對(duì)不同元素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限和定量限進(jìn)行考察，見表2，結(jié)果顯示：各種元素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)R2均大于等于 0.999 5，檢出限和定量限都很低，該檢測(cè)方法科學(xué)、準(zhǔn)確、可行，能夠準(zhǔn)確測(cè)定腐乳中24種元素含量.

表2 各元素的線性回歸方程及相關(guān)參數(shù)

2.2 不同產(chǎn)地腐乳中礦物元素含量差異分析

不同產(chǎn)地腐乳中無機(jī)元素含量對(duì)比見表3，該表中均值是指同一產(chǎn)地中同一元素的含量平均值，先通過平均值算出標(biāo)準(zhǔn)差，再通過均值、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算得到表4中的平方和、均方、F值和P值.P值是一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，根據(jù)表3、表4的數(shù)據(jù)可以看出，24種礦物元素中，有11種元素(Na、V、Cr、Mn、Fe、Zn、As、Se、Sn、Ba、Tl)的P值超過了0.05，這意味著它們之間的差異并不顯著，而另外13種元素的P值則低于0.05，這意味著它們之間的差異顯著，由此可見：腐乳中部分元素的含量會(huì)因地域不同而有顯著的差異.

表3 不同產(chǎn)地腐乳中無機(jī)元素的含量對(duì)比 mg/kg

表4 不同產(chǎn)地腐乳中無機(jī)元素的含量方差分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

續(xù)表4

2.3 礦物元素含量主成分分析

主成分分析是指應(yīng)用礦物元素含量數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上計(jì)算得到的初始特征值、提取平方和載入結(jié)果等參數(shù)，找出數(shù)據(jù)群體中主要影響因子，用數(shù)據(jù)群體中的少數(shù)關(guān)鍵性、特征參數(shù)、重要指標(biāo)或單個(gè)因素可以用來代表數(shù)據(jù)群體中的其余眾多指標(biāo)或因素，從而將問題簡化的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法[32，33].采集31個(gè)腐乳樣品中礦物元素的主成分分析如表5所示，提取匯總數(shù)據(jù)中初始特征值大于1的成分作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行成分分析研究，得到前8個(gè)主成分貢獻(xiàn)率分別為17.439%、16.532%、15.377%、8.732%、6.941%、5.899%、5.681%、4.351%(表5)，篩選出的8個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到了80.957%，它們能夠完整地展示、重現(xiàn)、描述各種來源的腐乳樣本的各種元素的含量及其構(gòu)成，從而更好地把握其本質(zhì)特征.

通過對(duì)礦物元素的主成分分析，可發(fā)現(xiàn)了表6中的前8個(gè)主要因子，對(duì)這些因子進(jìn)行了特征向量劃分，以便更清晰地識(shí)別出其中的關(guān)鍵元素，目的在于能夠更準(zhǔn)確地分析出這些元素.

表5 腐乳樣品中礦物元素含量的主成分分析

表6 腐乳樣品中24種礦物元素的主成分貢獻(xiàn)率分析 %

續(xù)表6 %

通過分析礦物元素的主成分，可以從表5中獲取信息.按照張新昕[9]、鹿保鑫[34]的方法，一一挑選出腐乳樣品中的各種元素.將第1個(gè)、第2個(gè)因子的載荷值分開，并將它們的絕對(duì)值分布在圖1、圖2上(原數(shù)據(jù)見表6)，以便更好地理解它們的特性.這些因子的載荷值有助于更準(zhǔn)確地識(shí)別出各種元素，從而更好地分析出腐乳的組成成分.隨著載荷值的增加，元素的方差貢獻(xiàn)也會(huì)增加，從而使得分析結(jié)果更加準(zhǔn)確.根據(jù)圖1，Co、Cu、Cd、Hg、Sr、Sn、K、Na、Ca、Pb的載荷值均超過了0.40，表明這10個(gè)元素的載荷值相對(duì)更高，能夠更好地反映第1個(gè)主成分的特征.K、Ca、Sr、Pb 4個(gè)重要的金屬元素的載荷值絕對(duì)值不僅在第1主成分載荷值超過0.40，且在第2個(gè)主成分因子中介于0.48～0.75之間，值較大，4個(gè)元素也能夠準(zhǔn)確地揭示出第2個(gè)主要組成部分的含量.結(jié)合第1、2主成分因子的載荷值絕對(duì)值含量，Co、Cu、Cd、Hg、Sr、Sn、K、Na、Ca、Pb這10個(gè)元素不僅能提供有價(jià)值的區(qū)域性信息，而且還能提供有效的腐乳產(chǎn)地追蹤依據(jù).

圖1 第1主成分因子載荷值的絕對(duì)值

圖2 第2主成分因子載荷值的絕對(duì)值

2.4 不同產(chǎn)地腐乳礦物元素含量判別分析

2.4.1 不同產(chǎn)地腐乳礦物元素含量的判別和分類分析

通過對(duì)不同產(chǎn)地腐乳樣品中24種礦物元素含量分析，可以準(zhǔn)確識(shí)別云南省楚雄州牟定縣、昆明市石林縣、貴州省貴陽市三大主要食品產(chǎn)區(qū)的腐乳，利用Fisher函數(shù)、交叉檢驗(yàn)，采取逐步判別法進(jìn)行判別分析[15，33]，分析結(jié)果表明：楚雄牟定、昆明石林、貴陽判別正確率分別為100%、100%、96%，利用24種礦物元素之間的含量差異，可以將貴州省和云南省楚雄州兩大生產(chǎn)區(qū)進(jìn)行區(qū)分，以此實(shí)現(xiàn)昆明市石林縣、楚雄州牟定縣原產(chǎn)地的溯源，能夠滿足腐乳產(chǎn)品的溯源要求.

在產(chǎn)地判別應(yīng)用中，如果同時(shí)測(cè)定24種礦物元素含量，對(duì)儀器設(shè)備、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、試劑耗材等消耗較大，檢測(cè)周期長，經(jīng)濟(jì)成本較高.為了更有效地識(shí)別產(chǎn)地，可使用SPSS軟件的識(shí)別功能，篩選出有效的礦物物元素.在確保識(shí)別準(zhǔn)確性的前提下，可采用逐步識(shí)別的方法來追蹤不同地區(qū)的腐乳樣品的產(chǎn)地.經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)6種元素被納入了判別模型，它們分別是Co、Cu、Cd、Hg、Sr和Sn.經(jīng)過回代檢驗(yàn)，這些元素的正確判別率達(dá)到了93.5%，可以滿足實(shí)際工作需求.根據(jù)這些元素的特性，建立了一個(gè)線性判別函數(shù)，具體系數(shù)參見表7.

表7 判別式分類函數(shù)系數(shù)

2.4.2 驗(yàn)證判別分析結(jié)果

為驗(yàn)證主成分分析的可靠性，采集楚雄牟定腐乳6份，貴陽腐乳2份，并將3個(gè)產(chǎn)區(qū)的31個(gè)腐乳樣品的礦物元素?cái)?shù)據(jù)以及用于判定的8份腐乳樣品作為分組變量進(jìn)行結(jié)果判別.通過判別6個(gè)礦物元素指標(biāo)、6個(gè)判別組樣品均判別準(zhǔn)確，昆明石林、楚雄牟定2個(gè)產(chǎn)地樣品存在錯(cuò)判率，交叉檢驗(yàn)的錯(cuò)判率為3.3%小于10%，錯(cuò)判率較小，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腐乳產(chǎn)地判別的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，證明6種礦物元素Co、Cu、Cd、Hg、Sr、Sn，對(duì)貴州貴陽和云南省內(nèi)腐乳，以及楚雄牟定和昆明市石林生產(chǎn)的腐乳都具有有效的判別能力，可以很好地把楚雄牟定腐乳區(qū)分出來.

2.5 基于礦物元素含量的聚類分析

圖3 不同腐乳產(chǎn)地的礦物元素聚類分析

使用SPSS 19.0軟件，將不同產(chǎn)地的31個(gè)參試腐乳樣品(包含14個(gè)腐乳品牌)中24種元素進(jìn)行聚類分析，采用Ward聚類方法計(jì)算歐式距離，用最短距離法得到樹狀圖[9]，結(jié)果如圖3所示.以最小分類級(jí)別為分割線，所有樣品可以分為6類，其中牟定與貴陽產(chǎn)地腐乳元素含量的歐式距離較遠(yuǎn)，被完全分離，其礦物元素組成差異較大，牟定與石林樣品存在交叉現(xiàn)象，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)牟定樣品也被劃分為5類，石林不同地區(qū)在礦物元素的組成上存在較大差異，證明了礦物元素的組成也可應(yīng)用于石林不同品牌腐乳的品牌鑒別、產(chǎn)地區(qū)分.

3結(jié)論

通過對(duì)腐乳樣品中礦物元素含量和組成進(jìn)行分析，說明不同產(chǎn)地腐乳中不同礦物元素組成和含量均存在顯著差異.使用Fisher函數(shù)和逐步判別分析法，可以準(zhǔn)確地識(shí)別出腐乳中礦物元素含量，再通過對(duì)腐乳中礦物元素含量的方差分析、主成分分析、判別分析進(jìn)行礦物元素特征指標(biāo)確認(rèn)，結(jié)合Ward聚類分析計(jì)算歐式距離，并使用最短距離法生成樹狀圖.通過判別分析結(jié)果的驗(yàn)證，結(jié)果表明：

96.7%的樣本中含有Co、Cu、Cd、Hg、Sr和Sn 這6種重要的金屬元素，判別結(jié)果良好，可以作為楚雄州牟定縣腐乳產(chǎn)地區(qū)分、品牌溯源的關(guān)鍵指標(biāo).本研究利用微波消解進(jìn)行樣品前處理，結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定腐乳中的24種礦物元素，由于腐乳加工工藝成熟，具有地域特色，影響因素較小，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、結(jié)果可信度高、可行性強(qiáng)，故該技術(shù)可以作為腐乳的產(chǎn)地溯源和質(zhì)量控制的有效指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腐乳的產(chǎn)地溯源、質(zhì)量控制、特色地理標(biāo)志食品的保護(hù)、真?zhèn)舞b別等目的.