■ 王 彬 林仙軍 侯 軒 周 煒 周芷錦 陳曉林 蔡文金 陳 潔*

（1.浙江省動物疫病預防控制中心，浙江杭州 311199；2.綠城農科檢測技術有限公司，浙江杭州 310052）

米糠油是從米糠中提取的油脂，富含油酸等營養(yǎng)物質，可為動物生長提供優(yōu)質的營養(yǎng)物質，廣泛應用于飼料的生產。米糠油的生產方式有壓榨法和浸出法，其中，壓榨法生產的米糠油又被稱為米糠毛油，壓榨堿煉后剩余的邊角料俗稱皂腳或油腳。米糠油中油酸與亞油酸比例接近WHO 推薦的1∶1 比例[1]，為公認的食用營養(yǎng)健康油，其不飽和脂肪酸高，也是一種被廣泛使用的高熱能飼料原料[2]，因其油料內含脂肪酶活性較高，本身酸價偏高，易發(fā)生油脂腐敗[3-4]。酸價的定義為中和1 g 動植物油脂中游離脂肪酸所消耗的KOH 的毫克數(shù)[5]，其為衡量油脂品質的重要衛(wèi)生指標，如GB/T 19112—2003 中明確規(guī)定了米糠油的分級標準及其酸價指標要求。米糠油本身為成分復雜的深色油脂，因國內還沒有飼用米糠油的標準，飼用米糠油的精煉品質參差不齊，油脂中滲入皂腳或油腳的現(xiàn)象時有發(fā)生，在外觀、純度、均勻度等方面與食用米糠油差距較大，酸價測定的難度較高。

谷維素是一種由阿魏酸與植物甾醇結合形成的脂溶性有益成分，用于人體有降血脂、降膽固醇的功效[6]，其主要存在于米糠油、胚芽油等谷物油脂中，其中，米糠毛油含有1.7%～3.0%的谷維素[7]。研究表明，谷維素在酸價測定過程中會出現(xiàn)綠黃色和亮黃色，從而干擾滴定終點時溶液顏色的變化，造成表觀酸價高于真實酸價的現(xiàn)象[8]。為探究谷維素對飼用米糠油酸價測定的影響，研究采用高效液相色譜法測定了飼用米糠油中谷維素的含量，分別用堿性藍6B 指示法、百里香酚酞指示法、電位滴定法測定其酸價，通過谷維素添加試驗探析谷維素對飼用米糠油酸價測定的影響，為飼用米糠油酸價測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

從飼料生產企業(yè)采集飼用米糠油2 批、飼用米糠2 批、食用米糠油1 批、飼用大豆油1 批，樣品信息見表1。

表1 油脂和飼用米糠樣品信息

γ-谷維素標準品：純度≥99%（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C14217665）；石油醚（30～60 ℃）：分析純（上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20181022）；氫氧化鉀乙醇標準滴定溶液（0.101 1 mol/L）：本實驗室自配和標定；無水乙醇：色譜級（永華化學股份有限公司，批號：20220415）；乙醇：分析純（上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20181112）；乙醚-異丙醇混合溶液（體積比1∶1），自配；酚酞指示劑（1%酚酞乙醇溶液）；百里香酚酞指示劑（2%百里香酚酞乙醇溶液）；堿性藍6B 指示劑（稱取堿性藍1.0 g，加入50 mL煮沸的95%乙醇，在水浴中回流1 h，冷卻后過濾）。

1.1.2 儀器與設備

MF10研磨機，德國IKA 公司；ME203E電子天平，瑞士Mettler 公司；XP205DU 精密電子天平，瑞士Mettler公司；DKZ-2電熱恒溫振蕩水槽，上海精宏實驗設備有限公司；3K15 冷凍離心機，德國Sigma 公司；R-210 旋轉蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI 公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀配VWD 檢測器，美國Agilent 公司；916 Ti-Touch 電位滴定儀配6.0229.100 非水相復合酸堿pH電極，瑞士萬通有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 有機溶劑浸出法從飼用米糠中提取米糠油

取1 L 帶密塞的試劑瓶5 個，向每個瓶中加入飼用米糠200 g 和石油醚（30～60 ℃）600 mL，用玻璃棒攪拌混勻后密塞，于往返式振蕩器上振搖2 h。取出溶液及樣品，置50 mL離心管中，于10 000 r/min 離心5 min，搜集并合并上清液，取上清液置水浴溫度不高于40 ℃的旋轉蒸發(fā)儀內，負壓條件下，將其中的溶劑旋轉蒸干，取殘留的液體油脂作為飼用米糠油。

1.2.2 油脂中谷維素含量的測定

油脂中谷維素含量的測定方法采用LS/T 6121.2—2017。

1.2.3 滴定方法對飼用米糠油酸價測定的影響

樣品酸價測定方法主要參考GB 5009.229—2016中第一法和第二法，其中，堿性藍6B 指示劑的配制方法按1.1.1 中方法配制，與GB 5009.229—2016 稍有不同。以食用米糠油和飼用大豆油作為對照。稱取樣品2 g（飼用大豆油酸價較低，稱樣量為4 g）于錐形瓶（指示劑滴定法）或滴定杯（電位滴定法）中，加入乙醚-異丙醇混合溶液80 mL，充分振搖使試樣溶解。分別用百里香酚酞指示滴定法、堿性藍6B 指示滴定法和電位滴定法進行酸堿中和滴定試驗。指示劑滴定法需加入指示劑4 滴，用氫氧化鉀乙醇標準滴定溶液滴定至終點，滴定終點時，當顏色變?yōu)樗{色時為百里香酚酞的終點，堿性藍6B 指示劑的滴定終點為由藍色變紅色，同時進行空白試驗。

1.2.4 谷維素標準品溶液的配制

精密稱取γ-谷維素標準品4 g，置于1 000 mL容量瓶中，用異丙醇超聲溶解并定容至刻度（約4 mg/mL）。

1.2.5 空白溶劑中添加谷維素試驗

取80 mL 乙醚-異丙醇混合溶液（酸價測定方法中的溶劑）于錐形瓶中，分別加入1.00、2.00、3.00、5.00、10.00、10.00、20.00 mL 谷維素標準品溶液，分別用百里香酚酞指示法和電位滴定法滴定，百里香酚酞指示法的滴定終點為溶液顏色變?yōu)樗{色，電位滴定法以最后一次突躍對應的點作為滴定終點。

1.2.6 谷維素對飼用米糠油酸價測定的影響

稱取樣品1 g于錐形瓶（指示劑滴定法）或滴定杯（電位滴定法）中，按表2 分別加入谷維素標準品溶液，依照1.2.3 中百里香酚酞指示法和電位滴定法測定油脂樣品酸價。

表2 谷維素對飼用米糠油酸價測定的影響試驗分組編號

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010 軟件進行初步整理和計算相對偏差或RSD（相對標準偏差），繪制空白溶劑谷維素添加量與滴定體積關系曲線圖，擬合趨勢方程分析線性關系（R2≥0.99 表示兩者呈現(xiàn)顯著線性關系）。采用SPSS 21.0 軟件中“獨立樣本T檢驗法”分析飼料米糠油中添加谷維素試驗中兩種滴定方法酸價結果的差異，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 油脂樣品外觀

由圖1 可知，壓榨法和浸出法生產的飼用米糠油外觀均為深棕色，外觀無明顯差異。飼用米糠油的色澤與透亮度較食用米糠油及飼用大豆油有明顯差異。

2.2 油脂中谷維素含量測定

6 組油脂樣品中谷維素含量測定結果見表3 所示。結果表明，4 種飼用米糠油谷維素含量為1.6%～2.2%，均處于較高水平；飼用大豆油中未檢出谷維素。

表3 油脂中谷維素含量（%）

2.3 滴定方法對飼用米糠油酸價測定的影響

滴定方法對飼用米糠油酸價測定的影響見表4和圖2。圖3～圖6為電位滴定法測定樣品酸價的電位滴定曲線。由表4和圖2可知，堿性藍6B指示法滴定飼料米糠油過程中溶液顏色漸變，即使嚴重過量滴定情況下，始終沒有出現(xiàn)顏色突變的點，因此，堿性藍6B指示劑不適用于飼用米糠油酸價的測定；4種米糠油樣品中，百里香酚酞指示法測定的酸價均遠大于電位滴定法；食用米糠油3種方法測定的結果相差較大（RSD=16.0%）；飼用大豆油3種方法測定的結果相近（RSD=1.5%）。

圖2 3種油脂堿性藍6B指示法測定酸價滴定終點顏色對比

圖3 飼用米糠油A電位滴定曲線

表4 不同指示劑和電位滴定方法酸價測定結果（n=5）

由圖2 可知，采用堿性藍6B 指示法滴定時，食用米糠油滴定終點顏色為淺紅色，比飼用大豆油滴定終點顏色要淺，而飼用米糠油滴定過程是顏色慢慢褪去（樣品溶液起始為灰黃色，加入堿性藍6B 指示劑后變?yōu)樗{色），漸漸恢復為本底灰黃色，再漸漸變?yōu)樽攸S色，始終沒有突變點。以上結果表明，深色油脂（米糠油）本底顏色對堿性藍6B 的變色指示效果具有干擾效應，且本底顏色越深干擾越嚴重。

圖3～圖6 為電位滴定法測定樣品酸價的電位滴定曲線，圖中藍色線為pH-滴定體積V 曲線，紫紅色線為pH 隨滴定體積變化的一階導數(shù)曲線，即ΔE/ΔV-滴定體積V 曲線。由圖3～圖6 可知，飼用大豆油滴定過程只有一次pH 突躍，為典型的“S”型曲線（與GB 5009.229—2016中附錄E中圖E.1為同一類型），飼用米糠油和食用米糠油的滴定過程則有兩次pH突躍，為多次不同pH范圍“pH”突躍的“S”型曲線（與GB 5009.229—2016中附錄E中圖E.2為同一類型），應以“突躍”起始的pH最接近于7.5～9.5范圍的突躍點作為滴定終點（如圖3中EP1、圖4和圖6中EP2即判定為滴定終點）。

圖4 飼用米糠油C電位滴定曲線

圖5 飼用大豆油電位滴定曲線

圖6 食用米糠油電位滴定曲線

2.4 空白溶劑中添加谷維素試驗

兩種方法測得的空白溶劑中谷維素的量與中和滴定終點體積的對比曲線圖見圖7，滴定體積數(shù)據(jù)見表5。由圖7 可知，兩種方法中和滴定試驗消耗的滴定液體積均與谷維素的添加量呈極顯著的線性關系（兩組曲線R2分別為0.997 7 和0.999 2），百里香酚酞指示法與電位滴定法測定的滴定終點體積結果極為接近。由表5 可知，電位滴定法比百里香酚酞指示法測定結果的相對偏差要小，表明電位滴定法的精密度優(yōu)于百里香酚酞指示法。

圖7 兩種滴定方法空白溶劑添加谷維素試驗滴定終點體積對比

表5 兩種滴定方法空白溶劑添加谷維素試驗滴定終點體積（n=5）

圖8～圖10為電位滴定法測定空白溶劑中添加谷維素試驗的電位滴定曲線。由圖8～圖10 可知，添加谷維素后，溶劑的滴定曲線由一次pH 突躍的“S”型變?yōu)閮纱蝡H 突躍的“S”型。第一次pH 突躍的點（對應紫紅色線上第一個尖峰）對應的pH 在10 左右，符合GB 5009.229—2016 中測定酸價的滴定終點判定標準（pH 最接近7.5～9.5 范圍的突躍點），此滴定點即為空白滴定體積，此滴定點位置隨著谷維素添加量的增大未發(fā)生顯著變化。第二次pH 突躍的點(對應紫紅色線上第二個尖峰)對應的pH 在13左右，該突躍點位置隨谷維素的添加量增大而不斷后移，表明該突躍點是因谷維素而產生。

圖8 電位滴定曲線（空白）

圖9 電位滴定曲線（添加谷維素12 mg）

圖10 電位滴定曲線（添加谷維素20 mg）

以上結果表明，在中和滴定過程中，谷維素會消耗氫氧化鉀乙醇滴定液，致使滴定過程中產生一次pH 突躍，消耗滴定液的量與谷維素含量呈顯著正相關關系。

2.5 谷維素對飼用米糠油酸價測定的影響

2.5.1 谷維素對飼用米糠油百里香酚酞指示法測定酸價結果的影響

由表6可知，隨著谷維素含量的增加，A組和C組兩種飼用米糠油酸價結果均顯著升高，通過線性回歸分析發(fā)現(xiàn)酸價和谷維素的添加量均呈顯著的線性關系（兩組曲線R2分別為0.998 5和0.993 9）。若以含相同量谷維素的溶劑作為空白，則計算得出的酸價趨勢較為穩(wěn)定（RSD分別為2.3%和3.6%），表明扣除掉谷維素消耗的滴定液體積后計算得出的酸價，應為其真實酸價。

表6 谷維素對飼用米糠油百里香酚酞指示法測定酸價結果的影響（n=4）

2.5.2 谷維素對飼用米糠油電位滴定法測定酸價結果的影響

谷維素對飼用米糠油電位滴定法測定酸價影響試驗的滴定曲線見圖12～圖15。由圖12～圖15 可知，隨著飼用米糠油樣品中谷維素含量的不斷增加，一階導數(shù)曲線（圖中紫紅色曲線）的第二個尖峰的位置不斷的向后移動，而第一個尖峰的位置未發(fā)生顯著變化。第一個尖峰起始時對應的溶液的pH大約為9，符合GB 5009.229—2016 中酸價終點判定的標準（突躍點起始pH 最接近7.5～9.5 范圍），第二個尖峰的位置對應的pH 均在12 左右，顯然不符合酸價終點判定的標準，因此，應以第一個尖峰對應的體積為滴定終點。以上表明，谷維素不影響第一次pH 突躍的滴定體積，即不干擾游離脂肪酸與堿反應造成的pH 突躍的曲線，但會致使滴定終點后在滴定曲線上產生另外一次pH 突躍，此突躍可初判為谷維素與堿發(fā)生反應所引起。由于滴定結束后儀器會顯示多個滴定體積，需要試驗人員參考GB 5009.229—2016結合滴定曲線類型和滴定點所處位置及pH 進行綜合判斷，最終選出滴定終點。

圖12 A1組試驗電位滴定曲線

圖13 A3組試驗電位滴定曲線

圖14 A5組試驗電位滴定曲線

圖15 A6組試驗電位滴定曲線

由表7 可知，B 組和D 組兩種飼用米糠油酸價均較為穩(wěn)定，其6 組試驗的組間RSD值分別為0.8%和1.4%，表明酸價與谷維素的含量沒有顯著關系。

表7 谷維素對飼用米糠油電位滴定法測定酸價結果的影響（n=4）

2.5.3 飼料米糠油中添加谷維素試驗兩種滴定方法酸價結果比較

將表6中飼用米糠油真實酸價和表7中酸價數(shù)據(jù)進行對比，結果分別見表8 和表9。由表8 和表9 可知，兩種方法測定的酸價結果均無顯著差異（P＞0.05），電位滴定法的精密度高于百里香酚酞指示法（RSD值更?。?。

表8 飼料米糠油A中添加谷維素試驗兩種方法酸價結果比較

3 討論

3.1 滴定方法對飼用米糠油酸價測定的影響

目前，油脂酸價測定的方法多采用GB 5009.229—2016 或ISO 660—2020，兩個標準中適用于米糠油的測定方法均列出了冷溶劑指示劑滴定法和冷溶劑電位滴定法兩種，其中GB 5009.229—2016 指明米糠油酸價指示劑滴定應采用堿性藍6B 作為指示劑。有試驗表明，指示劑滴定法測定酸價過程中，樣品稱樣量、溶劑量、指示劑等均對酸價測定結果有一定影響[9]。為避免樣品溶劑使用量、滴定液等對指示劑顯色產生干擾，本試驗中溶劑使用量均為80 mL，考慮到滴定液中水分可能致使皂化反應后生成的脂肪酸鹽形成乳濁液或出現(xiàn)油水分層的現(xiàn)象，試驗采用氫氧化鉀乙醇標準滴定溶液。此外，為提高堿性藍6B 指示劑的靈敏度，試驗中使用的堿性藍6B 指示劑未采用GB 5009.229—2016 中的乙醇直接溶解配制方法，而是參照GB/T264—1983采用熱乙醇溶解并經(jīng)熱回流處理。

由圖1 所示，飼用米糠油較食用米糠油色澤更深透亮度更差，因此，選擇食用米糠油（顏色淺于樣品的深色油脂，含有谷維素）和飼用大豆油（淺色油脂，不含谷維素）作為對照。如圖2 所示，在滴定過程中溶液本底顏色對堿性藍6B 指示劑指示劑的靈敏度具有不同程度的干擾，飼用米糠油本底顏色太深，該方法完全無法適用。由表4 可知，樣品組中百里香酚酞方法測定的酸價結果顯著大于電位滴定法測定的結果。從圖3、圖4、圖6 可知，3 種米糠油酸價測定滴定終點所對應的pH 均在9.5 左右，前人試驗確認，百里香酚酞指示劑在有機溶劑中變色范圍為9.3～10.5[10]，堿性藍6B 指示劑在95%乙醇中變色范圍為9.5～11.2[11],因此，3 種方法滴定終點時溶液的pH 接近，所測定的酸價結果理論上應無顯著差異，表4 中飼用大豆油的結果也從側面證實了該理論的科學性。李英軍等[12]試驗采用指示劑滴定法和電位滴定法測定花生油、大豆油、植物調和油等7 種植物油脂的酸價，結果沒有顯著差異，但電位滴定法準確度和精密度更高；劉婷婷等[13]采用人工滴定法和自動電位滴定法測定番茄紅素保健品的酸價，試驗認為兩種方法也沒有顯著差異；薛斌等[14]試驗研究也認為除了米糠油外，電位滴定法對各類食用植物油酸值的測定結果與傳統(tǒng)的人工指示劑滴定法的測定結果十分接近?？梢?，百里香酚酞指示法和電位滴定法中一定有一種方法測得的酸價結果失真。食用米糠油中百里香酚酞方法測定的酸價顯著大于堿性藍6B 和電位滴定法測得的酸價，而后兩者的結果較為一致，則可從側面證實是百里香酚酞指示劑測定的酸價結果失真，即表觀酸價大于真實酸價。程歲寒等[15]研究認為深色油脂酸價測定時，指示劑滴定法檢測結果存在偏差，電位滴定法測定的結果不受油脂本身顏色的干擾，以上試驗也印證了前人的研究結果。

3.2 谷維素對飼用酸價測定的影響

谷維素本身為白色結晶，在有機溶劑中溶解后為無色溶液，溶液本底不會對指示劑的顯色產生干擾。有研究認為谷維素導致油脂酸價測定值升高的原因可能有兩點：①谷維素與堿溶液反應生產淺黃色或亮黃色物質；②谷維素分子結構中酚羥基一定條件下可與堿基發(fā)生反應 ，從而消耗堿性滴定液的用量[16]。因此，能確認是在滴定過程中谷維素與堿反應產生了有色物質干擾了滴定過程中溶液顏色的變化，這種物質的干擾致使堿性藍6B 完全失去了指示作用，并使百里香酚酞指示劑測定值偏大?？瞻兹軇┲刑砑庸染S素試驗表明，溶劑在堿滴定中消耗的體積與谷維素含量呈顯著正相關，且百里香酚酞指示法與電位滴定法測定的滴定體積結果并無顯著差異。依照圖7 中谷維素含量與滴定液消耗體積標準曲線，按照天然米糠油中谷維素含量1.7%～3.0%計算，百里香酚酞指示法所測表觀酸價將比真實酸價偏高3.5～6.1 mg/g。

對于電位滴定方法，谷維素的存在可使油脂樣品滴定過程中除游離脂肪酸與堿反應產生的第一次電位突躍后再出現(xiàn)一次電位突躍，由于谷維素產生的電位突躍點對應的pH 已在12 左右，并不干擾游離脂肪酸導致的電位突躍，對酸價的測定無顯著影響。因百里香酚酞指示劑在有機溶劑中變色范圍為9.3～10.5，也表明由于谷維素的存在致使米糠油酸價測定中百里香酚酞的變色范圍從下限9.5 左右變成了12 左右。

由表8 和表9 可知，電位滴定法的精密度高于指示劑滴定法，表6 和表7 中電位滴定法測定的酸價的相對偏差也顯著低于百里香酚酞指示法，許多研究結果均表明，電位滴定法的精密度和準確度均高于指示劑滴定法[12，14-15]，尤其在深色油脂的酸價測定時，指示法受到本底顏色的干擾作用更強，結果偏差更大，因此，飼用米糠油的酸價測定應首選電位滴定法，以確保結果的準確可靠。對于沒有條件使用電位滴定法的實驗室，可使用百里香酚酞作為指示劑測定酸價，但需要測定樣品中的谷維素含量，在酸價測定時向溶劑中添加相同量的谷維素作為空白對照。金俊等[17]研究也認為可以通過大豆油添加相同濃度谷維素計算表觀酸價與真實酸價的差值，然后測定米糠油的表觀酸值,再減去差值得到真實酸值。

4 結論

飼用米糠油酸價的測定應首選電位滴定法，采用電位滴定法測定的酸價不受谷維素的影響，其第一次pH 突躍點對應的體積即滴定終點體積。電位滴定法精密度高于指示劑滴定法。指示劑滴定法中，需選用百里香酚酞作為指示劑，以含相同量谷維素的溶劑溶液代替空白溶液。