趙繼秀，馬 祥，琚澤亮，劉凱強(qiáng)，何紀(jì)桐，馬小龍，賈志鋒

（青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院, 青海 西寧 810016）

氮素是植物生長過程中必需的營養(yǎng)元素之一[1]，加大氮肥投入普遍成為人們發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要方法[2-3]。隨著農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，國內(nèi)化肥施用量也在逐年增加，而作物真正能夠利用的氮肥只有少部分，絕大部分氮肥依舊存留在土壤中，并隨著水土流失進(jìn)入江河湖海[4]，進(jìn)而引發(fā)土壤酸化、溫室效應(yīng)和水體富營養(yǎng)化等一系列環(huán)境問題[5-6]。這一環(huán)境代價(jià)已經(jīng)被廣泛關(guān)注，學(xué)者們相繼嘗試在不影響作物產(chǎn)量的情況下，適當(dāng)減少氮肥用量，這一措施在小麥(Triticum aestivum)[7]、玉米(Zea mays)[8]、水稻(Oryza sativa)[9]等作物上取得了一定的成效，但上述研究為僅1 年田間試驗(yàn)結(jié)果。宮亮等[10]長期定位減施氮肥對(duì)水稻(Oryza sativa)產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)長期減氮，水稻產(chǎn)量存在下降的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)此，研究者考慮從作物自身的基因型出發(fā)，篩選耐低氮種質(zhì)，在最大程度上節(jié)約資源，實(shí)現(xiàn)氮高效利用。

篩選耐低氮種質(zhì)是作物耐低氮育種工作的前提，而耐低氮種質(zhì)的確定離不開適宜的篩選指標(biāo)[11]。目前，已在玉米、棉花(Gossypium hirsutum)、谷子(Setaria italica)、小麥等作物上開展有關(guān)耐低氮性的研究。李強(qiáng)等[12]以葉面積、地上部干重和根體積等7 個(gè)性狀作為評(píng)價(jià)玉米苗期耐低氮能力的指標(biāo)，并篩選出了2 個(gè)耐低氮品種。王準(zhǔn)等[13]以總干物質(zhì)質(zhì)量、地上部干物質(zhì)質(zhì)量和根干物質(zhì)質(zhì)量等6 個(gè)性狀作為棉花苗期氮效率評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出了2 個(gè)耐低氮品種。連盈等[11]以植株苗高、生物量、氮累積量和SPAD 值(soil and plant analyzer develotrnent)等為篩選指標(biāo)，選出3 個(gè)耐低氮谷子品種。李俊杰等[14]以小麥幼苗生長發(fā)育性狀以及根系形態(tài)篩選出了5 份耐低氮型小麥。以上研究表明不同作物低氮耐受性的評(píng)價(jià)指標(biāo)不同。

目前有關(guān)燕麥(Avena sativa)耐低氮性的研究較少。苗玉紅等[15]采用土壤盆栽法探索了24 個(gè)燕麥品種在常規(guī)氮和低氮條件下的生長特性，并通過成熟期的生物量和氮積累量指標(biāo)篩選出了4 份耐低氮品種。然而采用土培法篩選耐低氮種質(zhì)存在一定的局限性，如土壤環(huán)境復(fù)雜，存在肥力不均、難以準(zhǔn)確控制氮素、試驗(yàn)重復(fù)性差等問題[16-17]。水培試驗(yàn)?zāi)軌虮苊庖陨蠁栴}[18]，不足之處在于水培法只能觀測作物苗期的生長狀況，不利于進(jìn)行整個(gè)生育期的探索。但有研究表明，作物苗期的耐低氮性在一定程度上能夠代表其成熟期的耐低氮性[18-19]。因此，本研究采用苗期水培方法，設(shè)置低氮脅迫和常規(guī)氮兩個(gè)處理，分析燕麥幼苗農(nóng)藝性狀以及根系形態(tài)指標(biāo)對(duì)氮素的響應(yīng)，篩選不同耐低氮性燕麥種質(zhì)材料，明確評(píng)價(jià)燕麥耐低氮能力的指標(biāo)，旨在為燕麥耐低氮育種工作提供材料，為燕麥耐低氮脅迫分子生理機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020 年種植來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院的139 份燕麥種質(zhì)資源，通過對(duì)考種指標(biāo)的篩選和聚類分析，初步得出了19 份表現(xiàn)較好的材料，包括7 份裸燕麥：ZY000090、ZY000150、ZY000304、ZY004071、ZY004080、ZY004085、ZY004093 ，12 份 皮 燕 麥：ZY003178、ZY004058、ZY004066、ZY004067、ZY004068、ZY004070、ZY004101、ZY004104、ZY004105、ZY004106、ZY004108和ZY004109。為探究上述田間表現(xiàn)良好的19 份燕麥材料是否同時(shí)具備耐低氮能力，試驗(yàn)將對(duì)其開展耐低氮性研究。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 初篩試驗(yàn)

燕麥種子用2% NaClO 溶液消毒10 min，用蒸餾水沖洗干凈，放至濕潤濾紙待其發(fā)芽。6 d 后，挑選長勢一致的燕麥幼苗，用海綿條包裹采用漂浮育苗方式，移入打孔的泡沫板中，每塊泡沫板平均分布24 個(gè)孔(4 × 6)，每孔種植1 株燕麥苗。試驗(yàn)溫度控制在20～25 ℃，晝夜16 h/8 h 給予光照，每間隔1 h使用充氣泵通氣培養(yǎng)，每5 d 更換一次營養(yǎng)液。每份種質(zhì)在各處理下設(shè)3 組重復(fù)。幼苗在裝有蒸餾水的水培箱中培養(yǎng)2 d 后進(jìn)行營養(yǎng)液處理，12 d 后取樣并測定生物量。營養(yǎng)液配方參考Khan 等[20]的方法，設(shè)常 規(guī) 氮(2 mmol·L-1NH4NO3) 和 低 氮(0.2 mmol·L-1NH4NO3) 2 個(gè)處理。正常營養(yǎng)液配方如表1 所列。

表1 常規(guī)營養(yǎng)液配方Table 1 Formula of normal nutrient solution

1.2.2 復(fù)篩試驗(yàn)

將常規(guī)和低氮處理時(shí)間延長為18 d，其余試驗(yàn)方法與步驟同初篩試驗(yàn)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 株高與葉綠素含量

復(fù)篩時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取3 株燕麥幼苗，使用便攜式葉綠素儀(SPAD-502)測定燕麥幼苗頂端第二片完全展開葉的SPAD 值；使用直尺測量幼苗株高。

1.3.2 生物量

初篩時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取3 株燕麥幼苗，并將其從水培箱完整取出，將莖葉和根分開裝在信封袋中，在105 ℃烘箱中殺青30 min，調(diào)至60 ℃烘干至恒重，并稱重，獲得莖葉干重和根干重，計(jì)算植株干重。復(fù)篩時(shí)，按照初篩時(shí)的方法稱量每份種質(zhì)的莖葉干重和根干重，并計(jì)算植株干重與根冠比。

植株干重 = 莖葉干重 + 根干重；

根冠比 = 莖葉干重/根干重。

1.3.3 根系形態(tài)參數(shù)

復(fù)篩時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取3 株燕麥幼苗，將根系從幼苗分離，用蒸餾水沖洗干凈，放入透明根盤中，將側(cè)根逐一分開，用WinRHIZO 根系分析系統(tǒng)獲取根體積、根表面積和根直徑和根尖數(shù)，并用直尺測量最大根長。

1.4 綜合評(píng)價(jià)值的計(jì)算

式中：Rx表示各性狀的耐低氮系數(shù)；aij為各性狀耐低氮系數(shù)的特征值對(duì)應(yīng)的特征向量，Xij為各性狀耐低氮系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化值[21]；Xj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)，Xjmax和Xjmin分別表示j個(gè)綜合指標(biāo)的最大值和最小值；U(Xj) 表示某材料第j 個(gè)綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值；Wj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)的權(quán)重，Pj為第j個(gè)綜合指標(biāo)的方差貢獻(xiàn)率[22]；D為綜合評(píng)價(jià)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2020 對(duì)所測數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及相關(guān)數(shù)據(jù)的初步計(jì)算；使用SPSS 21.0 進(jìn)行方差分析和主成分分析；通過SPSS 系統(tǒng)聚類分析法繪制樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮處理下燕麥種質(zhì)生物量差異

燕麥幼苗莖葉干重、根干重和植株干重在兩種氮處理下存在顯著差異(P＜ 0.05) (表2)，莖葉干重和植株干重在常規(guī)氮處理下顯著高于低氮處理，根干重在低氮處理下顯著高于常規(guī)氮處理。不同燕麥種質(zhì)莖葉干重、根干重和植株干重變異系數(shù)在低氮處理?xiàng)l件下分別達(dá)到23.102%、21.352%和21.063%，在常規(guī)氮處理?xiàng)l件下分別為20.037%、24.686%和18.162%，表明不同燕麥種質(zhì)的生物量在兩種氮處理下均存在較大差異。

表2 19 份燕麥種質(zhì)在兩種氮水平下苗期生物量差異Table 2 Differences in seedling biomass of 19 oat germplasms under two nitrogen conditions

比較各種質(zhì)耐低氮系數(shù)(表3)，以綜合耐低氮系數(shù)大于1.00 為標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選出5 份耐低氮材料ZY003178、ZY004085 、ZY004067 、ZY004068 和ZY004071，以綜合耐低氮系數(shù)小于0.70 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選 出5 份 低 氮 敏 感 材 料ZY004093、ZY000304、ZY004101、ZY004058 和ZY004106。

表3 19 份燕麥種質(zhì)干重耐低氮系數(shù)Table 3 Low nitrogen tolerance coefficient of dry weight of 19 oat germplasms

2.2 不同氮處理下燕麥種質(zhì)各性狀基因型差異

不同氮處理下，燕麥種質(zhì)各性狀的變異系數(shù)都比較大，表明不同種質(zhì)間耐低氮性差異大(表4)。常規(guī)組的變異系數(shù)范圍為10.700%～95.673%，其中以根體積、根表面積、根尖數(shù)、平均直徑和最大根長較大；低氮組的變異系數(shù)范圍為7.314%～60.991%，其中以根體積、根表面積、最大根長、平均直徑和莖葉干重較大。比較耐低氮系數(shù)，各指標(biāo)變異范圍為8.162%～91.821%，其中以根體積、根表面積、平均直徑、根尖數(shù)和根干重較大。低氮處理后，除植株干重、最大根長和平均直徑，其余各指標(biāo)均發(fā)生了顯著變化，具體表現(xiàn)為莖葉干重、株高、葉片SPAD值顯著降低，分別較常規(guī)氮處理下降16.296%、11.925%和17.348%；根干重、根冠比、根體積、根表面積和根尖數(shù)顯著增加，分別較常規(guī)氮處理高51.724%、87.383%、57.143%、37.639%和102.507%。

2.3 燕麥耐低氮性綜合評(píng)價(jià)

2.3.1 燕麥耐低氮性狀的綜合評(píng)價(jià)

對(duì)燕麥各性狀的耐低氮系數(shù)進(jìn)行主成分分析(表5)，在所選11 個(gè)性狀中，前3 個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為42.238%、31.604% 和11.415%，累計(jì)達(dá)85.257%。第1 主成分主要由植株干重、莖葉干重、根干重和株高決定，系數(shù)分別達(dá)0.958、0.925、0.797和0.788，說明此主成分主要反映低氮脅迫下燕麥的生物量變化。第2 主成分中，根體積、根表面積、平均直徑和根尖數(shù)的載荷系數(shù)較大，分別為0.730、0.889、0.746 和0.794，說明此主成分主要反映低氮脅迫下燕麥根系形態(tài)的變化。第3 主成分中根冠比的載荷系數(shù)最大，為0.787，說明該主成分主要反映低氮脅迫下燕麥地上干物質(zhì)和地下干物質(zhì)的分配情況?；谏鲜鲋鞒煞?，分析燕麥各性狀耐低氮系數(shù)與綜合評(píng)價(jià)值(D) 的相關(guān)性(表6) 可知，株高、莖葉干重、根干重、植株干重、根表面積和根尖數(shù)與D 值呈顯著或極顯著正相關(guān)；而根體積、根直徑和根冠比與D 值相關(guān)性未達(dá)顯著水平，所以剔除根體積、根直徑和根冠比3 個(gè)性狀。通過方差分析(表4) 可知，植株干重在低氮和常規(guī)氮下差異不顯著，故剔除植株干重。綜上得出，評(píng)價(jià)燕麥低氮耐受性的最佳性狀為株高、莖葉干重、根干重、根表面積和根尖數(shù)。

表6 燕麥各性狀耐低氮系數(shù)與D 值的相關(guān)性Table 6 Correlation of the D-value with low nitrogen tolerance coefficient of oat traits

2.3.2 燕麥耐低氮種質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)

在燕麥各性狀耐低氮系數(shù)的基礎(chǔ)上，通過公式(2) 計(jì)算各種質(zhì)3 個(gè)主成分的綜合指標(biāo)值，并對(duì)其進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，通過3 個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率確定權(quán)重大小，最后結(jié)合隸屬函數(shù)和權(quán)重計(jì)算各種質(zhì)的D 值。D 值越高，表明其耐低氮能力越強(qiáng)，10 份材料D 值由高到低為ZY004067 ＞ ZY004068 ＞ZY004071 ＞ ZY004106 ＞ ZY004058 ＞ ZY000304 ＞ZY003178 ＞ ZY004093 ＞ ZY004101 ＞ ZY004085 (表7)，其 中ZY004067 和ZY004068 的D 值 高 達(dá)0.965 6 和0.913 8，表明二者耐低氮能力極強(qiáng)，ZY004085 的D 值最小，僅為0.272 2，其耐低氮能力差。進(jìn)一步采用平方歐氏距離法對(duì)D 值進(jìn)行系統(tǒng)聚類，將10 份燕麥材料聚為3 類，分別為耐低氮型、中間型和低氮敏感型(圖1)。耐低氮型材料有2 份，分別為ZY004067和ZY004068；低氮敏感型材料有3 份，ZY004085、ZY004101 和ZY004093；其余為中間型材料。

圖1 10 份燕麥種質(zhì)耐低氮能力的系統(tǒng)聚類圖Figure 1 Dendrogram of 10 oat germplasms based on low nitrogen tolerance

表7 燕麥種質(zhì)的D 值Table 7 The D value of oat germplasms

3 討論

3.1 低氮對(duì)燕麥苗期農(nóng)藝性狀的影響

氮素是植物體正常代謝和生長的關(guān)鍵因素[23]，氮素的缺乏會(huì)導(dǎo)致植物體發(fā)生一系列的變化。植株地上部分的表觀可以直接反映其生長狀況，試驗(yàn)結(jié)果表明，供試燕麥種質(zhì)苗期各性狀在兩種氮水平下差異顯著，在低氮脅迫下，燕麥種質(zhì)的莖葉干重、株高、葉片SPAD 值顯著降低。這與前人研究結(jié)果一致[24-25]，說明低氮脅迫對(duì)植物幼苗地上部分的生長及葉綠素的合成具有抑制作用。根系在植物適應(yīng)各種環(huán)境、獲取有效養(yǎng)分和水分過程中具有十分重要的作用[26-27]，氮素通過根系吸收才能進(jìn)入燕麥體內(nèi)，所以在低氮脅迫下，燕麥根系會(huì)首先做出反應(yīng)。本研究中，低氮脅迫下，大多數(shù)燕麥種質(zhì)的根干重、根冠比、根體積、根表面積和根尖數(shù)顯著增加，這與遠(yuǎn)月麗等[28]和汪曉麗等[29]研究結(jié)果一致，說明低氮脅迫可以促進(jìn)植物根部發(fā)育，低氮條件下植物幼苗通過擴(kuò)增根系來獲取更多的氮素，用于植物的生長發(fā)育[30]，這也是燕麥應(yīng)對(duì)低氮脅迫的一種措施。

3.2 燕麥苗期耐低氮種質(zhì)篩選

耐低氮種質(zhì)的篩選離不開適宜的評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前，針對(duì)作物耐低氮性的評(píng)價(jià)指標(biāo)尚未統(tǒng)一，不同作物的評(píng)價(jià)指標(biāo)不同。植物對(duì)氮素比較敏感，缺氮會(huì)導(dǎo)致植物體一系列表型性狀發(fā)生直接或間接的變化[28]。本研究首先將莖葉干重和植株干重這兩個(gè)容易測定的表型性狀作為評(píng)價(jià)燕麥耐低氮能力的初級(jí)篩選指標(biāo)，并篩選出了5 個(gè)耐低氮種質(zhì)ZY004085、ZY004067、ZY004068、ZY004071、ZY003178和5 個(gè)低氮敏感種質(zhì)ZY004093、ZY000304、ZY004101、ZY004058、ZY004106。眾多研究者通過單一指標(biāo)(主要是生物量)評(píng)價(jià)作物的耐低氮能力[31]，然而單項(xiàng)指標(biāo)并不能準(zhǔn)確地反映不同作物品種的耐低氮能力，因此僅用莖葉干重和植株干重來評(píng)價(jià)燕麥種質(zhì)間耐低氮能力較為片面[11]。為了更加合理地篩選出評(píng)價(jià)燕麥耐低氮能力的指標(biāo)，本研究復(fù)篩時(shí)采用多個(gè)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，通過主成分分析初步得到與氮素含量密切相關(guān)的性狀：莖葉干重、植株干重、根干重、株高、根體積、根表面積、平均直徑、根尖數(shù)和根冠比，再通過相關(guān)性分析和方差分析去掉相關(guān)性較低和差異不顯著的性狀：根體積、根直徑、根冠比和植株干重，最終得出評(píng)價(jià)燕麥低氮耐受性的適宜指標(biāo)為株高、莖葉干重、根干重、根表面積和根尖數(shù)。祝令曉等[21]認(rèn)為，作為低氮耐受性的評(píng)價(jià)性狀應(yīng)當(dāng)具備易獲得性、可靠性、普適性，本研究獲得的評(píng)價(jià)指標(biāo)基本滿足以上3 個(gè)要素。

不同燕麥基因型對(duì)氮素的敏感性存在明顯差異[32]，篩選耐低氮種質(zhì)是挖掘燕麥自身的氮利用潛力，最大限度地發(fā)揮其優(yōu)勢的重要途徑。目前，主成分分析、隸屬函數(shù)和聚類分析是篩選耐低氮種質(zhì)常用的方法[12,22]。為獲得更準(zhǔn)確且具有說服力的結(jié)果，研究者已將主成分分析和隸屬函數(shù)兩種方法結(jié)合[33]，用于篩選耐低氮種質(zhì)。本研究首先基于燕麥種質(zhì)不同性狀的耐低氮系數(shù)，進(jìn)行主成分分析并在主成分分析結(jié)果上運(yùn)用隸屬函數(shù)法，綜合評(píng)價(jià)不同燕麥種質(zhì)的耐低氮性?；陔`屬函數(shù)法計(jì)算的耐低氮性綜合評(píng)價(jià)值(D) 將不同基因型燕麥分類。結(jié)果表明，ZY004067 和ZY004068 為耐低氮型種質(zhì)，ZY004085、ZY004101 和ZY004093 為氮敏感型種質(zhì)。本研究篩選出了2 份耐低氮種質(zhì)，但此結(jié)果僅能說明其在苗期對(duì)低氮的耐受力較強(qiáng)，并不能代表成熟期的耐低氮能力。因而，為更確切地評(píng)價(jià)燕麥種質(zhì)耐低氮能力，還需進(jìn)行田間試驗(yàn)來驗(yàn)證。

4 結(jié)論

低氮脅迫對(duì)燕麥幼苗地上部分的生長及葉綠素的合成具有抑制作用，但會(huì)促進(jìn)燕麥根系生長。株高、莖葉干重、根干重、根表面積和根尖數(shù)是評(píng)價(jià)燕麥耐低氮性的重要指標(biāo)。供試材料中，ZY004067和ZY004068 為耐低氮型種質(zhì)，ZY004085、ZY004101和ZY004093 為氮敏感型種質(zhì)。