李顯碧,劉尚升,肖 兵,廖 華,張 楊

(1.江油市人民醫(yī)院麻醉科,四川 江油 621700;2.興文縣人民醫(yī)院麻醉科,四川 興文 644400)

腦卒中是指腦組織局部發(fā)生出血或缺血性病理改變而引起腦組織血液供給降低,繼而引起嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損癥狀的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,是全球范圍內(nèi)引起人類死亡的主要原因,也是致殘的第二大原因[1-2]。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明,每年約有1500萬以上新發(fā)卒中患者,其中病死人數(shù)可達(dá)三分之一。腦卒中可分為出血性卒中和缺血性卒中,其中后者又稱為腦梗死,占腦卒中患者總數(shù)的85%[2]。目前臨床中,針對(duì)缺血性腦卒中的主要治療方法為手術(shù)治療和抗血小板聚集、神經(jīng)保護(hù)、溶栓等藥物治療?？鼓帉?duì)患者的副作用較多,溶栓藥的治療效果較好,但有效治療時(shí)間窗狹窄和易引起顱內(nèi)出血、致殘率較高等因素導(dǎo)致其應(yīng)用受限。因此,深入探究腦梗死的發(fā)病機(jī)制,尋求針對(duì)性的治療藥物或療法,是臨床中亟須解決的問題。

研究表明,腦梗死發(fā)生后,白細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞被激活,產(chǎn)生大量炎性因子[3-4],其中核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor κ gene binding,NK-κB)是炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可以通過調(diào)控腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(Interleukin,IL-6)等促炎性因子的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)炎性反應(yīng)的加重[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent information regulation 1,SIRT1)是一組在腦、肝臟、脂肪等多種器官和組織中廣泛分布的蛋白去乙?；?主要表達(dá)于細(xì)胞核中,通過對(duì)組蛋白以及NK-κB的去乙酰化作用,參與體內(nèi)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和增殖等生理活動(dòng),在維持生理功能和某些疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,與腦梗死的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。

右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一種常用的α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑,具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用,常用于腦組織受損的疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效用[6],但此藥的詳細(xì)作用機(jī)制尚未完全明晰,仍需進(jìn)一步探究。因此,本研究擬采用Longa法制備腦梗死大鼠模型,探究Dex對(duì)腦梗死大鼠治療作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選擇SPF級(jí)SD雄性大鼠共60只,體重(200±20)g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司[許可證編號(hào)SCCK(京)2016-0011]。所有大鼠均進(jìn)行1周適應(yīng)性飼養(yǎng),自由飲食飲水,保持12 h/12 h光暗周期。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品:鹽酸右美托咪定注射液購(規(guī)格1ml:0.1mg,國藥準(zhǔn)字H20143195)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)線栓(北京西濃科技),蛋白質(zhì)電泳儀(美國Bio-Rad),Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀、FRESCO 21高速低溫離心機(jī)(美國Thermo Fisher),-80 ℃超低溫冰箱(日本SANYO),光學(xué)顯微鏡(日本Nikon)。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑:水合氯醛、多聚甲醛(美國Sigma),放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸 (BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天),大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(武漢華美生物),SIRT1抗體、兔抗SIRT1抗體(美國Proteintech)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、右美托咪定低劑量組、右美托咪定高劑量組,每組各12只。大鼠體重達(dá)到(270±20)g時(shí)造模干預(yù)處理。術(shù)前禁食12 h不禁水,使用10%水合氯醛,以0.5 ml/100 g劑量將對(duì)照組以外的大鼠進(jìn)行麻醉。手術(shù)過程中及術(shù)后注意對(duì)大鼠進(jìn)行保溫,肛溫在(37±1)℃。對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng),不進(jìn)行造模干預(yù)。假手術(shù)組:切開頸部正中處皮膚后,鈍性分離皮下肌肉和主要血管,不進(jìn)行模型制備,隨后縫合皮膚。其余各組采用Longa線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。

大鼠麻醉后仰臥位固定,術(shù)前對(duì)大鼠頸前部皮膚進(jìn)行消毒,在頸正中線處做2 cm切口,鈍性分離肌肉和筋膜,分離大鼠的右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA),在ECA、CCA近心端結(jié)扎,在CCA遠(yuǎn)心端處打活結(jié),使用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA,在CCA分叉5 mm處使用1 ml注射器針頭扎一小孔,將線栓經(jīng)此插入CCA后將遠(yuǎn)端活結(jié)拉緊以固定線栓,將線栓推入ICA后去除動(dòng)脈夾,繼續(xù)推送線栓至有阻力感時(shí)停止,提示線栓到達(dá)大腦中動(dòng)脈(MCA)處,檢查確認(rèn)無活動(dòng)性出血后,縫閉頸部皮膚,切口處消毒,大鼠單籠飼養(yǎng)。

血流栓塞共持續(xù)2 h,2 h后拔出線栓。在血流栓塞過程中,右美托咪定低劑量(25 μg/kg)、高劑量組(100 μg/kg)分別經(jīng)腹腔注射右美托咪定,除對(duì)照組外,其余大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.1 MACO大鼠模型制備成功判斷標(biāo)準(zhǔn):將大鼠尾部懸空提起,30 s內(nèi)大鼠出現(xiàn)頸部轉(zhuǎn)動(dòng)>10°,左前肢肌張力下降、屈曲內(nèi)收,或爬行時(shí)出現(xiàn)追尾現(xiàn)象,即可視為造模成功。造模不成功的大鼠予以剔除。

1.2.2 腦組織標(biāo)本的收集:所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛,以0.3 ml/100 g劑量麻醉后,立即斷頭處死并剝離腦組織。在冰上將腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域分離后,置于液氮中冷凍貯存?zhèn)溆谩?8 h后從液氮中取出樣本,置于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)缺血腦組織SIRT1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平:使用Trizol法提取總RNA,稱取0.01 g腦組織,剪碎后加入Trizol裂解液并研磨,使組織充分裂解。加入裂解液后于冰上裂解15 min,反復(fù)吹打使細(xì)胞脫落后,將裂解液轉(zhuǎn)移至無酶EP管中?；靹蜢o置后加入1/5體積氯仿,再次混勻后4 ℃、12000 r/min離心15 min。吸取上清,加入異丙醇混勻后室溫靜置10 min,隨后于-20 ℃內(nèi)靜置1 h。棄去上清后加入75%乙醇,再次4 ℃、12000 r/min離心15 min后,除去乙醇。隨后進(jìn)行RNA定量,測(cè)定RNA濃度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,置于PCR儀中以37 ℃ 15 min -85 ～4 ℃ 10 min進(jìn)行反應(yīng)。隨后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn),95 ℃ 5 min,9 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,重復(fù)40次。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。引物設(shè)置如下:β-actin:上游:5’-CCCATCTATGAG-GGTTACGC-3’,下游:5’-TTTAATGTCACGCAC-GATTTC-3’;SIRT:上游:5’-TGTGTGTGGGTCTATG-CCTT-3’,下游:5’-CCTGCAATCCCAGGTACTTT-3’;NF-κB:上游:3’-CATCCACCATGGAAGACAAG-3’,下游:5’-CCAGCAGCATCTTCACATCT-3’。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)缺血腦組織SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá)水平:取適量的腦組織剪碎后放入EP管,加入裂解液后于冰上進(jìn)行勻漿,4 ℃、12000 r/min離心30 min,吸取上層清液后,依據(jù)BCA試劑盒操作說明進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。將配置好的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和PBS加入細(xì)胞板并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用PBS將待測(cè)蛋白樣品稀釋,與BCA工作溶液混合后37 ℃孵育30 min,酶標(biāo)儀測(cè)定樣品吸光度后繪制曲線測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后配置電泳凝膠,隨后上樣進(jìn)行電泳,將3 μl預(yù)染蛋白Marker加入至孔道中,依次加入待測(cè)蛋白樣本。待膠液面分離后調(diào)整電泳時(shí)間,直至marker分開。隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后,室溫下使用5%脫脂奶粉封閉1.5～2.5 h。將PVDF膜在一抗抗體(1∶1000)及內(nèi)參β-actin(1∶2000)抗體溶液中浸泡,4 ℃孵育過夜。次日TBST洗膜后將PVDF膜在二抗溶液中浸泡,室溫下孵育1 h。TBST洗膜后,使用超敏發(fā)光液浸泡PVDF膜,使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影,并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 大鼠海馬區(qū)炎性因子水平檢測(cè):選用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法測(cè)定大鼠海馬組織中的TNF-α、IL-6水平。將大鼠腦組織中雙側(cè)海馬仔細(xì)分離后,加入10倍的PBS溶液制成勻漿,4 ℃、5000 g離心5 min,取上層清液。將標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板前兩列中,每孔100 μl。將其余各孔內(nèi)加入100 μl待測(cè)樣品,避光,37 ℃避光孵育90 min。加入100 μl抗體后,37 ℃孵育1 h,隨后洗板3次,加入酶結(jié)合物100 μl,37 ℃孵育30 min,甩干后重復(fù)洗滌5次。加入90 μl顯色底物,37 ℃孵育。加入終止液50 μl,使用酶標(biāo)儀以波長450 nm處測(cè)量OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算測(cè)試樣品中的TNF-α、IL-6水平。

1.2.6 缺血腦組織氧化應(yīng)激水平檢測(cè):取各組大鼠缺血半暗帶處腦組織制備勻漿,使用丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。依照操作說明書檢測(cè)樣本中SOD、MDA水平,使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值后計(jì)算含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選擇SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,多組之間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠缺血腦組織SIRT1、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較 結(jié)果表明,與對(duì)照組大鼠比較,Dex治療組大鼠SIRT1 mRNA水平降低、NF-κB mRNA水平升高,經(jīng)Dex治療后兩組大鼠的SIRT1 mRNA水平升高,且Dex高劑量組更高;同時(shí)NF-κB mRNA水平下降,且Dex高劑量組低于Dex低劑量組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠缺血腦組織SIRT1、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2 各組大鼠缺血腦組織SIRT1、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較 結(jié)果表明,與對(duì)照組大鼠比較,Dex治療組大鼠SIRT1 蛋白表達(dá)水平降低、NF-κB 蛋白水平升高,經(jīng)Dex治療后兩組大鼠的SIRT1蛋白表達(dá)水平升高,且Dex高劑量組更高;同時(shí)NF-κB蛋白表達(dá)水平下降,且Dex高劑量組低于Dex低劑量組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠缺血腦組織SIRT1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

2.3 各組大鼠海馬區(qū)炎性因子TNF-α、IL-6水平比較 結(jié)果表明,與對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠比較,其余各組大鼠TNF-α、IL-6水平升高,經(jīng)Dex治療后兩組大鼠的炎性因子水平降低,且Dex高劑量組TNF-α、IL-6水平低于Dex低劑量組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬區(qū)炎性因子TNF-α、IL-6水平比較(pg/ml)

2.4 各組大鼠缺血腦組織MDA、SOD水平比較 結(jié)果表明,與對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠比較,其余各組大鼠MDA水平升高、SOD水平下降,經(jīng)Dex治療后兩組大鼠的MDA水平降低,Dex高劑量組更低,同時(shí)SOD水平升高,且Dex高劑量組更高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠缺血腦組織MDA、SOD水平比較

3 討 論

腦卒中是引起患者死亡、致殘的主要疾病之一,其中缺血性腦卒中的比例在八成以上[2,7-8]。腦缺血發(fā)生后,腦組織發(fā)生一系列復(fù)雜的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等,也是引起腦梗死患者運(yùn)動(dòng)、感覺、言語、認(rèn)知等功能障礙的病理機(jī)制。右美托咪定作為常用的鎮(zhèn)靜劑,臨床中常用于患者全麻插管時(shí)的麻醉及區(qū)域麻醉輔助鎮(zhèn)靜,能夠有效安撫患者的焦慮情緒。近年研究發(fā)現(xiàn),Dex對(duì)多種器官的缺血損傷均有較好的保護(hù)作用[9]。研究表明,Dex可以通過調(diào)控Nfr2/HO-1通路減輕心肌損傷[10-11],同時(shí)可以通過緩解線粒體功能障礙導(dǎo)致的氧化應(yīng)激繼而引起的腦組織受損。但針對(duì)Dex治療腦梗死的機(jī)制尚未完全明確,仍需進(jìn)一步探究。MCAO模型是常用的誘導(dǎo)腦組織缺血模型,其誘發(fā)腦梗死的成功率較高;還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腦內(nèi)血流阻塞/再灌注的精準(zhǔn)控制,且引起的腦組織梗塞的面積更大,病理改變更為明顯[12]。但MCAO模型也有一定的局限性,插入的線栓僅能全部阻斷或恢復(fù)腦組織血運(yùn),與真實(shí)的腦梗死患者復(fù)雜的腦損傷情況仍有差異。

腦缺血發(fā)生后,缺血缺氧損傷和再灌注損傷會(huì)引起一系列的炎性反應(yīng),炎性因子被釋放至受損的腦組織部位,引起炎性浸潤[13]。炎性因子的積累會(huì)進(jìn)一步激活炎癥相關(guān)通路,誘導(dǎo)更多炎性因子釋放,進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞凋亡[14]。因此,抑制炎性相關(guān)通路的激活可有效緩解腦梗死后的腦組織損傷程度。SIRT1/NF-κB是重要的炎性反應(yīng)調(diào)控通路,SIRT1在腦組織中含量較高,對(duì)維持神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能和代謝發(fā)揮重要作用,且SIRT1具有較好的抗炎功能[15]。而NF-κB與細(xì)胞炎性損傷密切相關(guān),它可以通過產(chǎn)生促炎性因子TNF-α、IL-6等,進(jìn)而加重炎性反應(yīng)水平[16-17]。TNF-α、IL-6作為人體常用的炎性反應(yīng)標(biāo)志物,其含量與炎性反應(yīng)程度呈正相關(guān)[18-19]。研究證實(shí),SIRT1對(duì)NF-κB為負(fù)性調(diào)節(jié)作用,當(dāng)SIRT1水平升高時(shí),可以有效抑制NF-κB的炎性作用,緩解神經(jīng)細(xì)胞損傷程度。本研究中,經(jīng)Dex治療后,大鼠受損腦組織的SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平以及海馬區(qū)TNF-α、IL-6水平下降,提示Dex可有效的通過上調(diào)SIRT1、下調(diào)NF-κB水平及其下游炎性因子的表達(dá),有效抑制炎性反應(yīng),繼而發(fā)揮腦保護(hù)作用,且Dex高劑量組的治療效果優(yōu)于低劑量組。活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)是有氧代謝的產(chǎn)物,適量的ROS可以有效促進(jìn)腦組織的功能發(fā)育,而過量的ROS堆積則會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷,與腦卒中和其他神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[20-22]。生理狀態(tài)下,過量的ROS可被人體通過調(diào)節(jié)氧化還原和耗氧量而中和,當(dāng)腦梗死發(fā)生后,ROS過量堆積無法清除,引起脂質(zhì)和蛋白質(zhì)過氧化,引起氧化應(yīng)激反應(yīng),繼而引起神經(jīng)元凋亡和變性死亡,加重腦損傷。相關(guān)研究表明,SIRT1可以通過誘導(dǎo)NF-κB、FOX家族蛋白等途徑,緩解衰老等疾病中的氧化應(yīng)激反應(yīng)水平,同時(shí)在動(dòng)脈粥樣硬化、痛風(fēng)性骨關(guān)節(jié)炎等疾病中也可通過激活SIRT1相關(guān)通路繼而緩解氧化應(yīng)激[23-24]。SOD屬于抗氧化酶系統(tǒng),是緩解超氧化物引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì),MDA是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物,通過破壞細(xì)胞中的核酸、酶、細(xì)胞器或生物膜等引起氧化應(yīng)激損傷,MDA的含量可以有效反映腦組織的脂質(zhì)過氧化程度,間接提示了神經(jīng)元損傷程度[25]。本研究中,經(jīng)Dex治療后,大鼠受損腦組織的SOD水平升高同時(shí)MDA水平下降,提示Dex可以有效改善受損腦組織的抗氧化應(yīng)激能力,緩解氧化應(yīng)激損傷,且Dex高劑量組的治療效果優(yōu)于低劑量組。

綜上所述,右美托咪定可以有效緩解腦梗死發(fā)生后的腦組織損傷,發(fā)揮腦保護(hù)作用。其機(jī)制可能與激活SIRT1/NF-κB信號(hào)通路,進(jìn)而減輕炎性反應(yīng)、緩解氧化應(yīng)激有關(guān)。