施嘉華,陳真珍,黃龍堅,王凱華

(1.廣西中醫(yī)藥大學,廣西 南寧 530200;2.右江民族醫(yī)學院,廣西 南寧533000;3.廣西中醫(yī)藥大學附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西 南寧 530201)

鐵死亡(Ferroptosis)是一種依賴于鐵的程序性細胞死亡方式,2012年正式提出[1]。不同于凋亡、焦亡或者自噬,鐵死亡是一種以細胞內(nèi)鐵過載為起因,脂質(zhì)過氧化物活性氧(Reactive oxygen species,ROS)過度積累而產(chǎn)生的細胞死亡。缺血性腦卒中是全球第二大死亡原因和第三大殘疾原因,在中醫(yī)又被稱為“中風”。就現(xiàn)在廣為使用的治療方式而言,患者僅能在發(fā)病的3～6 h內(nèi)接受血管內(nèi)介入治療才能獲得較好預后,而對大部分患者而言想及時接受治療是非常困難的。大量研究表明鐵死亡參與人體多種疾病的發(fā)生發(fā)展[2],如腎病、糖尿病、心血管病等,在一些疾病中(如腦缺血性卒中)抑制細胞鐵死亡可以挽救機體損傷,而在腫瘤中靶向誘導鐵死亡則可以減小腫瘤體積,達到控制疾病進展目的。本文通過綜述鐵死亡的各個環(huán)節(jié)以及各種調(diào)控鐵死亡的細胞通路和其在腦缺血再灌注中產(chǎn)生的影響來加深對這一細胞死亡方式的理解,并為后續(xù)通過研究靶向腦缺血再灌注中細胞鐵死亡來保護腦神經(jīng)提供新的思路。

1 鐵死亡概述

鐵死亡是一種不同于自噬、焦亡和凋亡的程序性細胞死亡方式(Regulated cell death,RCD),主要特征是細胞體積縮小、游離鐵增加、線粒體膜密度增加和ROS的鐵依賴性積累[3]。過去有大量研究表明,鐵死亡的本質(zhì)是由氧化應激誘導的鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物大量積累,主要有兩個環(huán)節(jié)可作為思考治療靶點的基礎:①鐵的運輸和代謝,②脂質(zhì)過氧化物和自由基的清除。往往一種抑制細胞鐵死亡的藥物是靠多個環(huán)節(jié)聯(lián)合發(fā)揮療效的。紅花黃(CY)是一種已知能減輕心臟缺血及再灌注損傷的藥物[4]。GUO等[5]的研究表明,在MCAO模型大鼠中使用CY治療對CIRI后神經(jīng)功能缺損有顯著作用,不但減輕了損傷部位的炎癥反應,還通過逆轉谷胱甘肽過氧化物酶 4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)、鐵蛋白重鏈1(Ferritin heavy chain 1,FTH1)的表達水平從而減少了Fe2+和活性氧的積累,也逆轉了血清中谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的水平。

1.1 鐵的代謝 鐵是人體所必需的微量元素之一。最廣為大眾所知的用途就是參與紅細胞生成,比如鐵缺乏可能造成貧血等。食物中的鐵以Fe3+形式為主,但人體只能吸收利用Fe2+。為了限制活性鐵的負向作用,體內(nèi)的鐵主要以與其他輔基結合的形式存在。血液中Fe3+與轉鐵蛋白(Transferrin,TF)結合,從而被運輸?shù)礁鱾€組織。一般來說,血液循環(huán)中會剩余大約三分之二的不飽和轉鐵蛋白用于抵抗氧化還原反應和有毒非轉鐵蛋白結合鐵的積累[6]。腦缺血后,細胞外鐵濃度升高提高了TFR對Fe3+的攝取,并被還原為Fe2+,并由STEAP3和DMT1釋放到細胞質(zhì)中。同時由Tau蛋白介導的APP轉運和Fpn1活性降低,限制鐵輸出。所以鐵以不穩(wěn)定鐵池(Labile iron pool,LIP)的形式在細胞內(nèi)積累[6]。過量的活性鐵通過非酶芬頓反應(Fenton)和LOX介導的芬頓反應參與ROS的產(chǎn)生,促成細胞鐵死亡。通過對細胞內(nèi)LIP的調(diào)控是通過鐵代謝途徑調(diào)控鐵死亡的關鍵環(huán)節(jié)。

1.2 脂質(zhì)過氧化物的清除 眾所周知,鐵死亡是由細胞內(nèi)鐵過載導致脂質(zhì)過氧化物大量積累引起的細胞程序性死亡。位于細胞膜的含有多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAS)的磷脂(PUFA-PLS)經(jīng)過一系列氧化還原反應形成脂質(zhì)過氧化物,通過過量積聚而引發(fā)鐵死亡已被證實。從組成上看,磷脂的化學多樣性源于兩條脂肪?；渟n1和sn2,sn1往往結合的是飽和脂肪酸(Saturated fatty acid,SFA)和單不飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid,MUFA),而sn2在此基礎上還可以結合多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)[8]。結合了PUFA的細胞膜磷脂雖然實現(xiàn)了許多細胞功能,但也增加了對鐵死亡的敏感性。

PUFA含有雙烯丙基,不同于單不飽和脂肪酸的烯丙基和飽和脂肪酸的沒有雙鍵的亞甲基,由于位于兩個碳-碳雙鍵中間而鍵能減小,該亞甲基基團非常容易發(fā)生過氧化。自由基從PUFA的雙烯丙基中去除氫原子從而產(chǎn)生磷脂自由基(PLOO·)[9],隨后從另一個PUFA中去除氫,形成磷脂氫過氧化物(PLOOH)。

1.3 調(diào)控鐵死亡的主要細胞通路

1.3.1 System Xc-/GPX4途徑:System Xc-是一種胱氨酸/谷氨酸鹽反轉運體,其表達編碼的蛋白被稱為xCT蛋白,該蛋白使細胞恢復氧化還原穩(wěn)態(tài)并在氧化應激、氨基酸饑餓、代謝應激和基因毒性應激等壓力條件下提高細胞生存率[10]。胱氨酸在細胞內(nèi)發(fā)生氧化還原反應變成半胱氨酸,并與谷氨酸、甘氨酸結合成為GSH。GPX4是著名的細胞鐵死亡抑制蛋白,可以利用還原型谷胱甘肽清除自由基,催化PLOOH還原為相應的羥基衍生物來保護細胞[11]。目前有關于腫瘤細胞的研究發(fā)現(xiàn)通過靶向干預GPX4上游通路來降低其活性可以達到誘導腫瘤細胞鐵死亡的目的從而提高療效[12]。SLC1A5是一種在許多癌癥中表達水平較高的鐵死亡相關基因(FRGS),在有關神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中,有人發(fā)現(xiàn)SLC1A5在膠質(zhì)母細胞瘤組織中表達顯著上調(diào),增加GPX4表達從而抑制膠質(zhì)瘤鐵死亡[13]。

1.3.2 FSP1/CoQ10途徑:鐵死亡抑制蛋白 1(Ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)又被稱為線粒體相關細胞凋亡誘導因子 2(Apoptosis-inducing factor 2,AIFM2)[10],是一種依賴于煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP) 的輔酶 Q10 氧化還原酶。FSP1通過豆蔻?；揎椂ㄎ挥谫|(zhì)膜從而作為氧化還原酶來還原輔酶Q10(CoQ10)。CoQ10不僅保護細胞線粒體呼吸鏈,其抗氧化作用還能中和膜的自由基,抑制CoQ10會加速細胞的鐵死亡[14]。

1.3.3 Nrf2/HO-1途徑:核因子E2相關因子2(Nrf2)是一種亮氨酸拉鏈轉錄激活因子[15]。Nrf2可以激活醌氧化還原酶-1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]、血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase 1,HO-1)和鐵蛋白重鏈-1(Ferritin heavy chain 1,FTH1)的轉錄。HO-1是一種抗氧化酶,主要用于催化血紅素分解代謝成為亞鐵、一氧化碳和膽綠素[16]。血紅素的降解有助于抗氧化作用,副產(chǎn)物膽綠素及其還原型膽紅素具有ROS清除活性,這些作用對于HO-1清除過氧化物及羥基自由基有很大幫助。

1.3.4 DHODH/CoQ10途徑:在線粒體內(nèi)膜上,DHODH將二氫乳清酸(DHO)還原為乳清酸(ORO),并將電子轉移到FMN并轉化為二氫黃素單核苷酸(Dihydroflavin monucleotide,FMNH2),然后將乳清酸轉化為尿苷一磷酸(UMP),即參與核糖體生物合成的 RNA 核苷酸。ZHANG等[16]使用MnCl2干預腫瘤細胞引發(fā)鐵死亡,同時MnCl2下調(diào)腫瘤細胞中的DHODH表達,導致線粒體ROS和脂質(zhì)過氧化的增加,恢復DHODH表達則可以逆轉這種情況,證明DHODH是一個可靶向弱點。

1.3.5 GCH1/BH4/磷脂途徑:GCH1是四氫生物蝶呤(BH4) 生物合成的限速酶,可以響應三個梯隊的鐵死亡誘導劑(RSL3,erastin和GPX4基因消融)。KRAFT等[17]在CRISPR 激活篩選中發(fā)現(xiàn)一組拮抗鐵死亡細胞死亡的基因,包含GTO環(huán)水解酶-1(GCH1)以及GCH1的代謝衍生物四氫生物喋呤/二氫生物喋呤(BH4/BH2)。GCH1的表達通過兩種機制來抑制鐵死亡:①GCH1 產(chǎn)生功能類似于 CoQ10的親脂性抗氧化劑 BH4,以防止脂質(zhì)過氧化;②GCH1通過脂質(zhì)膜環(huán)境重塑來增加還原型 CoQ10 的豐度,并消耗增加對鐵死亡敏感性的 PUFA-PLs。值得注意的是,GCH1可以選擇性地保護具有兩個多不飽和脂肪?；驳牧字庥诮到?表明GCH1/BH4/磷脂途徑可能是治療的潛在靶點。

2 腦缺血再灌注損傷

缺血性腦卒中是由于局部腦缺血及永久性腦梗死引發(fā)的突發(fā)神經(jīng)功能缺損[18],包括短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)及缺血性腦梗死(Ischemic stroke,IS),是全球第二大死亡原因和第三大殘疾原因。常見病因包括大動脈的動脈粥樣硬化閉塞、腦栓塞(栓塞性梗死)、小的深部穿支動脈的非栓塞性梗塞(腔隙性腦梗)和由遠端動脈狹窄及腦血流下降導致的分水嶺區(qū)域梗死(血流動力學卒中)。

FDA目前僅批準靜脈組織纖溶酶原激活劑和血管內(nèi)血栓切除術作為腦梗死治療方法。但是兩種治療方法必須分別在中風后4.5 h和12 h內(nèi)使用,非常緊迫。去除血栓后,血液的復通也會對患者造成損傷,稱為腦缺血/再灌注損傷(Cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI),目前腦缺血再灌注引起損傷的機制是復雜的,尚不完全明確,涉及多個信號通路。恢復期CIRI包括多種復雜的病理生理過程,比如興奮性氨基酸的毒性作用、自由基損傷、Ca2+超載、炎癥反應、能量代謝失常,這些多環(huán)節(jié)快速級聯(lián)反應都會對神經(jīng)元造成損傷。

3 鐵死亡與腦缺血再灌注

鐵死亡是造成缺血再灌注損傷的機制之一,再灌注后一般都伴隨ROS過量生成以及鐵的積累。過量的Fe2+發(fā)生芬頓反應(Fenton)產(chǎn)生羥基自由基[19],從而引起細胞毒性。腦微血管內(nèi)皮細胞(BMVEC)功能障礙,ROS積累引起巨噬細胞大量增多,血腦屏障(BBB)受損,出現(xiàn)腦梗死后出血性轉化和腦水腫[20],以及早期神經(jīng)功能惡化。在MCAO大鼠中敲低 CBX7 會降低鐵離子濃度和轉鐵蛋白受體 1(Transferrin receptor 1,TFR1) 的蛋白表達,但會增強SLC7A11 和GPX4通路,從而抑制鐵死亡,從而減輕腦缺血再灌注損傷、改善認知功能障礙并通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制鐵死亡[21]。WANG等[22]提出線粒體鐵蛋白(FtMt)可以通過抑制炎癥調(diào)節(jié)的鐵沉積來減輕神經(jīng)元的鐵死亡,進一步發(fā)現(xiàn)FtMt過表達可以減輕缺血再灌注引起的血腦屏障破壞。CISD2(CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 2)是一種早期神經(jīng)元分化的標志,過去有研究發(fā)現(xiàn)沉默CISD2可提高頭頸部腫瘤細胞對鐵死亡誘導劑磺胺吡啶的敏感性,過表達CISD2則相反,胡淼的研究表明,過表達CISD2可以抑制TFR1的表達從而限制鐵的運輸,從源頭上抑制受損神經(jīng)細胞對鐵的過度轉運,從而減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生[22],為缺血性腦卒中的治療提供了一個可靶向的思路。

與此同時許多研究表明,鐵螯合可以減少動物的缺血再灌注損傷[24]。Nrf2是重要的鐵死亡抑制基因。ZHANG等[25]通過向腦室內(nèi)注射miRNA-27a激動劑或拮抗劑改變miRNA-27a表達水平,并建立MCAO模型,檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-27a 靶向抑制 Nrf2,加劇細胞鐵死亡。并且拮抗miRNA-27a可以逆轉這種作用,表明miRNA-27a可能通過抑制Nrf2來加重缺血性腦卒中期間因再灌注引起的腦組織死亡。缺血性腦卒中發(fā)病后,內(nèi)源性修復機制介導的可塑性變化可以促進大腦皮層功能如神經(jīng)膠質(zhì)增生、突觸功能重建、髓鞘再生和神經(jīng)干細胞激活的改善。去鐵胺(Deferoxamine,DFO)是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準應用的鐵螯合劑,合成脂質(zhì)體包裹將親水性藥物包裹在中間,親脂性藥物包被在膜上,從鼻內(nèi)給藥,可以使藥物更好地透過血腦屏障。GUO等[26]使用合成脂質(zhì)體包裹的去鐵胺(DFO-LIP)納米顆粒發(fā)現(xiàn)鐵沉積的減少可以逆轉卒中后大腦皮層功能的變化,延遲神經(jīng)功能的恢復,研究人員又使用納米脂質(zhì)體包裹的檸檬酸鐵胺(FAC-LIP)嘗試提高鐵水平能否促進皮層功能改善,但是并未見到預期結果。他們推測可能需要一定的鐵水平才能促進大腦皮層神經(jīng)功能的恢復[27]。

?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)是PUFAs代謝的重要同工酶,將輔酶A(Coenzyme A,CoA) 酯化為游離脂肪酸,并且酰基輔酶A(Acyl-CoA)的形成激活相應的脂肪酸進行脂質(zhì)過氧化[28]。通過過表達ACSL4可以通過催化多種多不飽和脂肪酸提高細胞對于鐵死亡的敏感性。CUI等[29]進一步研究發(fā)現(xiàn)在大腦中動脈閉塞后缺氧誘導因子1α(HIF-1α)通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝介導了ACSL4表達的抑制。推廣研究發(fā)現(xiàn)ACSL4可以促進小膠質(zhì)細胞介導的炎癥反應,這也是缺血性卒中神經(jīng)炎癥的重要原因之一。而抑制或敲除ACSL4可以保護細胞免受鐵死亡,降低卒中后神經(jīng)細胞的損傷。

大腦缺血缺氧時三磷酸腺苷(ATP)的減少會導致Na+/K+電化學梯度崩潰,導致谷氨酸轉運蛋白反向運行,并且有研究證明由System Xc-介導的突觸外谷氨酸釋放是造成缺血缺氧時胞外谷氨酸濃度升高和興奮性毒性的關鍵機制之一。HSIEH等[30]提出缺氧誘導因子1α(HIF-1α)可以直接通過糖氧剝奪/再氧合(Oxygen glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R)依賴性方式結合于xCT啟動子來調(diào)節(jié)xCT的轉錄,從而增加谷氨酸的轉運,增強氧化應激毒性。

4 結 語

缺血性腦卒中引發(fā)的神經(jīng)細胞損傷及后續(xù)的再灌注損傷使其成為了危害全球人類健康的元兇之一。鐵死亡作為一種新近發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡方式在很長時間內(nèi)都是醫(yī)學研究的熱點,有越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)其在各種疾病損傷中發(fā)揮的作用,例如在腫瘤細胞中有效地誘導鐵死亡可以提高腫瘤的治愈率,在急性肺損傷或者腦缺血再灌注損傷中抑制細胞鐵死亡可以減少損傷并保護組織。因此通過靶向細胞通路來抑制細胞鐵死亡從而提高腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞存活率是非常有意義的。本文的不足在于鐵死亡的細胞通路是如同樹的根系一般非常龐大的,在此只能敘述各個通路位于上游的調(diào)節(jié)部分,繼續(xù)向下游探索會發(fā)現(xiàn)鐵死亡的作用靶點非常豐富,并且各個通路之間還可以通過相互作用進行調(diào)節(jié)。隨著對細胞鐵死亡各種通路及影響因素探索的不斷加深,可以幫助我們揭開腦缺血再灌注這一病理過程細胞組織病變的神秘面紗,為臨床緩解患者痛苦,提高治療效率提供新的思路。